Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của một số chủng staphylococci phân lập từ môi trường bệnh viện

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ CHỦNG STAPHYLOCOCCI PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BỆNH VIỆN Bùi Minh Giao Long*, Lý Trọng Minh**, Trần Cát Đông** TÓM TẮT Mở đầu: Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng đáng kể chi phí điều trị tỉ lệ tử vong bệnh nhân nằm viện. Các chủng Staphyloccoci, đặc biệt MRSA (Staphylococcus aureus kháng methicillin) chủng gây gây nhiễm trùng khó điều trị bệnh viện bệnh phổ biến nhất. Việc khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh thường tiến hành từ bệnh phẩm, nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu vi khuẩn phân lập từ môi trường bệnh viện. Mục tiêu: Khảo sát đề kháng với nhóm β-lactam kháng sinh khác đồng thời xác định kiểu gen đề kháng chủng Staphylocci phân lập từ không khí bệnh viện. Phương pháp: Lấy mẫu phân lập cách đặt đĩa MSA (Mannitol Salt Agar) khoa, phòng. Thử nghiệm kháng sinh đồ biện giải theo CLSI M100-S18. Chiết tách ADN thực PCR để xác định kiểu gen đề kháng mecA. Kết quả: Phân lập 130 chủng Staphylococci từ không khí số khoa, phòng. Kết cho thấy tỉ lệ kháng penicillin ampicillin cao (lần lượt 72,31%, 70%). Tỉ lệ chủng kháng ceftazidime oxacillin gần (26,15% 24,62%). Các kháng sinh lại có tỉ lệ đề kháng 20%. Imipenem amoxicillin/clavulanic acid không bị đề kháng. Kết PCR cho thấy có 28/32 chủng có có mang gen đề kháng mecA. Thử nghiệm kháng sinh đồ kháng sinh nhóm khác cho thấy tỉ lệ đề kháng azithromycin cao (83,33%), clindamycin (67,67%) kanamycin (40%). Tỉ lệ đề kháng với cloramphenicol, bactrim ciprofloxacin khoảng từ 20-30%. Không có chủng đề kháng với tetracyclin vancomycin. Kết luận: Sự đề kháng kháng sinh chủng Staphylococci không khí bệnh viện cho thấy môi trường bệnh viện cần phải kiểm soát tốt để hạn chế nhiễm trùng cho bệnh nhân. Từ khóa: Staphylococci, MRS, MRSA, đề kháng kháng sinh, mecA ABSTRACT INVESTIGATING THE ANTIBIOTIC RESISTANCE OF SOME STAPHYLOCOCCI STRAINS ISOLATED FROM HOSPITAL ENVIRONMENT. Bui Minh Giao Long, Ly Trong Minh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No - 2011: 164 - 169 Background: Currently, nosocomial infections contribute significantly to excess costs and mortality for hospitalized patients. Many strains of Staphylococci, especially, MRSA (methicillin resistant Staphylocccus aureus) are one of the most popular pathogens causing difficult-to-treat infections in hospital. The monitoring of antibiotic resistance is often performed on patients’ isolates; however, there has been not much concern for that from hospital environment yet. Objectives: Investigating incidences of antibiotic resistance to β-lactam and others and also identifying resistant genotype of Staphylococci strains isolated from hospital air. *Bộ môn Dược Lâm Sàng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM **Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127; Email: trancdong@gmail.com 164 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Methods: Sampling and isolating airborne Staphylococci strains were done by sedimentation method on MSA (Mannitol Salt Agar) plates in some clinics. Agar disk diffusion was used to identify the resistance to antibiotics and the results were interpreted based on CLSI M100-S18. DNA of MRS strains were extracted and amplifying mecA gene by using PCR for the genotyping. Results: We isolated 130 strains of Staphylococci from hospital air. The results showed that the resistance to penicillin and ampicillin ranked the first and second highest with 72,31% and 70% respectively. The rates of ceftazidime and oxacillin resistance were followed at 26,15% and 24,62% respectively. For other β-lactam antibiotics, resistant incidences were less than 20%. There was no resistance to imipenem and amoxicillin/clavulanic acid found in all strains. The PCR-based genotyping indicated 28 out of 32 strains carrying the mecA gene. The subsequent results on other antibiotic groups demonstrated that azithromycin has the highest resistant rate (88,33%) followed by clindamycin (67,67%) and kanamycin (40%). The resistance to chloramphenicol, bactrim and ciprofloxacin were ranged in 20-30%. Resistance to vancomycin and tetracycline was not observed. Conclusion: The antibiotic resistance of Staphylococci strains isolated from hospital air indicated that it is always necessary to control the hospital environment to reduce infections for patients. Keywords: Staphylococci, MRS, MRSA, antibiotic resistance, mecA. khuẩn tồn môi trường bệnh viện ĐẶT VẤN ĐỀ nước ta chưa quan tâm nhiều. Ngoài ra, Môi trường bệnh viện đặc biệt phòng bên cạnh việc xác định kiểu hình đề kháng khám, phòng mổ, khoa hô hấp, khoa hồi sức cấp methicillin, việc xác định kiểu gen đề kháng cứu tồn vi khuẩn gây bệnh hay hội với xem xác sử dụng mật độ cao. Các vi khuẩn lây nhiễm nhiều hơn(7,9). cho bệnh nhân nhân viên y tế theo đường không khí qua tiếp xúc với dụng cụ y tế dùng bệnh viện(2,13). Đây tình trạng nhiễm trùng bệnh viện quan tâm nhiều vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện thường có mức độ đề kháng cao vi khuẩn nhiễm trùng từ cộng đồng(4,13). Các chủng Staphylocci, đặc biệt MRSA (Staphylococcus aureus đề kháng methicillin) phát đề kháng nhiều loại kháng sinh khác macrolid, quinolon, aminosid, kể vancomycin(6,13). Ngoài số chủng khác Staphylococcus epidermidis Staphlycococcus saprophyticus gây bệnh hội quan trọng cho người có khuynh hướng đa đề kháng(6). Điều thực thử thách lớn điều trị làm gia tăng tỉ lệ tử vong làm tăng chi phí điều trị cho bệnh nhân. Việc theo dõi tình hình đề kháng chủng vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm công việc thường quy bệnh viện. Tuy nhiên, việc xác định mức độ đề kháng vi Chuyên Đề Dược Khoa VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Hóa chất: đĩa kháng sinh (Nam Khoa), TSA (Trypton Soy Agar), MHA (Mueller Hinton Agar), MSA (Mannitol Salt Agar), agarose, ethidium bromide (Merck), PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs). Trang thiết bị: máy UV-vis Genequant 1300, tủ ấm Shellab, máy li tâm Sigma – 18, máy luân nhiệt Techne TC-3000 G, điện di ngang Biorad Mini-sub cell GT. Phân lập chủng Staphylococci Các chủng Staphylococcus aureus phân lập từ không khí số khoa phòng (phòng hồi sức cấp cứu, phòng khám, phòng mổ, khoa hô hấp, khoa ngoại tổng hợp, kho nội tổng hợp) thời gian từ tháng 04/2010 đến tháng 05/2010 Bệnh viện Nhân Dân Gia Định Bệnh viện Thủ Đức. Sử dụng đĩa thạch MSA 165 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 (Mannitol Salt Agar) môi trường chọn lọc để phân lập chủng Staphylococci. Các đĩa MSA đặt ngẫu nhiên góc phòng vị trí: sàn nhà, cách mặt đất 1-1,5 m mở nắp giờ. Sau đó, ủ đĩa tủ ấm 37 oC 24-36 giờ. Chọn khóm màu vàng có vòng xung quanh khóm (do khả lên men mannitol), nhuộm Gram kiểm tra hình thái làm môi trường TSA. Kháng sinh đồ Thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp Kirby – Bauer, chủng chứng sử dụng gồm S. aureus ATCC 29213 (nhạy methicillin) MRSA ATCC 4330. Đo đường kính vùng ức chế thước kẹp. Bất tăng trưởng thấy bên vòng vô khuẩn chứng tỏ vi khuẩn đề kháng kháng sinh. Kết biện giải theo bảng biện giải M100-S18 CLSI(3) Chiết tách ADN phản ứng PCR Chiết tách ADN theo qui trình chiết tách chung cho vi khuẩn Gram dương Cutting S.M(5) thực PCR khuếch đại đoạn gen mecA với mồi đặc hiệu cho gồm mồi xuôi (5’AGT TGT AGT TGT GGG GTT TGG-3’) mồi ngược (5’-CGT ATT TTT TAT TAC CGT TTCTC-3’) thiết kế để tạo sản phẩm khuếch đại có kích thước 2000 bp. Phản ứng PCR thể tích 25 µl có thành phần gồm 0,5 µl ADN trộn với 2,5 µl đệm PCR 10 X, 0,25 µl dNTP 25 mM, 0,25 µl mồi xuôi mồi ngược với nồng độ 100 µM 0,2 µl Taq ADN polymerase U/ µl nước khử khoáng vừa đủ. Thực chương trình PCR gồm 95 °C phút, 45°C 45 giây, 72°C 2,5 phút, lập lại 35 chu kì. Sản phẩm khuếch đại PCR chạy điện di gel agarose 1% điện 100V 15 phút, đọc kết phương pháp nhuộm ethidium bromide xem ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm. 166 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết phân Staphylococci lập định danh Từ 264 đĩa MSA qua đợt lấy mẫu ngẫu nhiên khoa phòng hai bệnh viện, thu 130 chủng Staphylococci. Kết đề kháng sinh nhóm β-lactam 130 chủng Staphylococci thực kháng sinh đồ 13 loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam. Kết trình bày Bảng 1. Bảng 1. Kết đề kháng 13 kháng sinh nhóm βlactam 130 chủng Staphylococci khảo sát Kháng sinh Penicillin Ampicillin Ceftazidim Oxacilin Ceftriaxon Cefuroxim Ticarcillin Cefotaxim Cefaclor Amoxicillin/ acid clavulanic Piperacillin/Tazobactam Ampicillin/Sulbactam Imipenem Tổng cộng Số chủng Tỉ lệ (%) 94 72,3 91 70 34 26,2 32 24,6 25 19,2 19 14,6 15 11,5 14 10,8 11 8,7 5,4 3,9 0 0 Qua kết toàn 130 chủng thu được, cho thấy tỉ lệ vi khuẩn đề kháng penicillin cao với 72,3%, ampicillin 70% ceftazidime với 26,2%. Tỉ lệ vi khuẩn kháng với oxacillin đứng thứ với 24,6%. Không có chủng đề kháng với ampicillin/sulbactam imipenem. Mức độ đề kháng penicillin nghiên cứu thấp (72,3%) so với nghiên cứu khác Lê Toàn Lợi (80%)(8), Nguyễn Phúc Minh Châu (92,2%)(10), Phạm Thị Khánh Chi (100%)(12), Phạm Hùng Vân (100%)(11). Về ampicillin tương tự, mức độ đề kháng 70%, nghiên cứu khác 85,7% 89,1%. Nghiên cứu mức độ đề kháng với β-lactam khác, so với nghiên cứu Phạm Hùng Vân, mức độ đề kháng với Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ticarcillin, ampicillin/ acid clavulanic cefuroxim 28%, 30% 38% nghiên cứu 11,5%, 5,4% 14,6%. Thống kê Bộ y tế năm 2006(1) cho thấy tỉ lệ đề kháng với cefotaxim ceftriazon 9,8% 29,7% gần tỉ lệ đề kháng 10,78% 26,2%. Tuy nhiên, tỉ lệ đề kháng cefuroxim theo thống kê lại thấp nhiều với 0,8%. Sự khác biệt nghiên cứu điều kiện đối tượng lấy mẫu khác nhau. Trong nghiên cứu này, kết đề kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập từ không khí thấp so với vi khuẩn phân lập từ mẫu phẩm bệnh nhân từ nghiên cứu khác. Điều Nghiên cứu Y học giải thích mật độ vi khuẩn đề kháng không khí chưa cao bệnh nhân sử dụng kháng sinh bệnh viện với tần suất cao. Ngoài ra, cần phải thực số lượng mẫu nhiều để có kết luận xác hơn. Kết PCR xác định chủng MRS mang kiểu gen đề kháng mecA Kết PCR 32 chủng có kiểu hình đề kháng methicillin, có 28 chủng có mang kiểu gen đề kháng mecA. chủng lại không mang gen mecA thuộc loại BORSA (bordeline S. aureus) tiết lượng lớn β –lactamase. kb kb kb kb Hình 1. Kết PCR khuếch đại gen mecA 28 chủng MRS gồm vancomycin, bactrim kháng sinh Kết kháng sinh đồ chủng MRS thuộc nhóm macrolid, aminoglycosid, kháng sinh nhóm khác phenicol, cyclin, lincosamid. Kết trình Trong nghiên cứu này, định bày Bảng 2. danh sơ 28 chủng có mang gen mecA Bảng 2. Tỉ lệ chủng MRS đề kháng kháng sinh thử nghiệm tìm coagulase với huyết tương thỏ khác nhận thấy có 21 chủng cho coagulase dương Kháng sinh Số chủng Số chủng đề Tỉ lệ tính hay 75% Staphylococcus aureus lại kháng kháng trung gian kháng (%) chủng (25%) coagulase âm tính. Phản ứng Azithromycin (Az) 25 83,3 Clindamycin (cL) 20 67,7 coagulase xác định đến 99% chủng S. Kanamycin (Kn) 12 40 aureus, nhiên vài chủng S. aureus 26,7 Chloramphenicol không tiết coagulase khiếm khuyết gen (Cl) quy định enzym này. Do đó, chủng Bactrim (Bt) 23,3 nên định danh xác Ciprofloxacin (Ci) 20 phương pháp khác sử dụng kit định danh Tetracyclin (Te) Vancomycin (Va) 0 API giải trình tự 16S rADN. Tất 28 chủng MRS mang gen mecA khảo sát đề kháng kháng sinh Qua kết cho thấy, tỉ lệ vi khuẩn đề kháng azithromycin cao với 83,33%, clindamycin (67,67%) kanamycin Chuyên Đề Dược Khoa (40%). Các chủng đề kháng cloramphenicol, bactrim ciprofloxacin có mức độ đề kháng khoảng từ 20-30%. Tất 28 chủng 167 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 nhạy với tetracyclin vancomycin. Tuy nhiên, số lượng chủng đề kháng trung gian với tetracyclin chủng đề kháng trung gian với vancomycin. Tài liệu Macrolid Cl Bt Phạm T. K. Chi(12) 47,8 (Er) 26,1 17,4 Phạm Hùng Vân(11) 88 (Az) 43 25 Khảo sát đề kháng chéo cho thấy chủng MRS kháng đồng thời với nhiều kháng sinh khác. Kết trình bày bảng 3. Nghiên cứu Bảng 3. Số lượng tỉ lệ chủng MRS đề kháng chéo Số kháng sinh Số chủng kháng 10 5 0 Tỉ lệ (%) 33,3 20 16,7 13,3 16,7 0 Bộ Y tế 2006(1) Về tỉ lệ đề kháng chéo, tùy theo loại kháng sinh mà nghiên cứu có mức độ cao thấp so với số nghiên cứu khác. Với kháng sinh nhóm macrolid, số nghiên cứu tiến hành erythromycin (Er) số tiến hành azithromycin (Az). Tuy nhiên, kết cho thấy tỉ lệ đề kháng nhóm macrolid cao (xem bảng 4). Về clindamycin (cL), so sánh với thống kê Bộ Y tế năm 2006 thấy tỉ lệ đề kháng clindamycin cao so với kết thống kê (67,7% so với 47,8%). Ngoài nghiên cứu không tìm thấy vi khuẩn đề kháng vancomycin thống kê 2006 Bộ Y tế cho thấy có 1,2% S.aureus đề kháng với vancomycin. Nguyễn P. M. (10) Châu 92,2 (Er) 45,3 31,3 168 cL Ci Va - 57,1 - 39,1 Va 0 27,4 47,8 32,9 1,2 61,2% (Er) 83,3 (Az) 26,7 23,33 67,7 20 Điều đáng lưu ý nghiên cứu này, imipenem vancomycin chưa bị đề kháng. Trên thực tế, thuốc thuốc lựa chọn hàng đầu cho điều trị nhiễm trùng MRSA, nhiên giá thuốc cao tăng chi phí điều trị tạo gánh nặng kinh tế lớn cho bệnh nhân. Bên cạnh đó, khả gia tăng đề kháng vancomcycin tương lai gây trở ngại lớn điều trị việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát tốt. Kết phân lập khảo sát đề kháng kháng sinh chủng Staphylococci không khí hai bệnh viện dù không cao từ bệnh phẩm cho thấy môi trường bệnh viện nguồn lây nhiễm quan trọng cần phải kiểm soát tốt. Bên cạnh đó, bệnh nhân cần tuân thủ việc sử kháng sinh hợp lý để hạn chế tình trạng vi khuẩn mang gen đề kháng lây truyền cho cộng đồng qua đường không khí. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2. 3. 4. 5. Bảng 4. So sánh mức độ đề kháng kháng sinh nhóm khác nghiên cứu Macrolid Cl Bt 82,9 (Er) 37,1 31,4 Ci 13 65 KẾT LUẬN Qua kết cho thấy, có khoảng 33% chủng MRS đề kháng chéo với loại kháng sinh có khoảng 17% chủng đề kháng với loại kháng sinh. Không có chủng đề kháng chéo với loại kháng sinh trở lên. Tài liệu Lê Toàn Lợi(8) cL - 6. Bộ Y tế (2006). Tổng kết công tác hội đồng thuốc điều trị hoạt động theo dõi kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Breathnach AS (2009). Nosocomial infections. Medicine 37 (10):557-561. CLSI (2008). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; 18th Informational Supplement. M100S18. 28 (1): 46-53. Cosgrove E.S., Perencevich N.E., Sakoulas G. et al. (2003). Comparison of Mortality Associated with MethicillinResistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia: A Meta-analysis. Clinical infectious diseases. 36(1):53. Cutting S. M. and Horn P. B. V. (1990). Genetic Analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. C. R. Harwood and S. M. Cutting. Chichester, England, John Wiley & Sons Ltd: 27-74 Domaracki E.B., Venezia A.R., Evans M.A., (2000), Vancomycin and Oxacillin Synergy for Methicillin-Resistant Staphylococci. Antimicrobial, Agents and Chemotherapy. 44 (5):1394-1396. Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 7. 8. 9. 10. Dominguez M.A., Linares J., Martin R. (1997). Molecular mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Microbiologia; 13: 301-308. Lê Toàn Lợi (2007), Tình hình mang mầm vi khuẩn Staphylococcus aureus bệnh nhân chuẩn bị mổ xoang bệnh viện Tai - Mũi - Họng TP.HCM, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Đại học Mở, TP.HCM. Murakami K., Minadime W., Wanda K., Nakamura E., Teraoka H., and Watanabee S (1991). Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244. Nguyễn Phúc Minh Châu, (2007), Nghiên cứu tình trạng mang Staphylococcus aureus mũi bệnh nhân ngọai trú Chuyên Đề Dược Khoa 11. 12. 13. Nghiên cứu Y học bệnh viên Tai - Mũi Họng Tp.HCM, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP.HCM. Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình (2006), Tình hình đề kháng kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus. Kết nghiên cứu đa trung tâm thực 235 chủng vi khuẩn. Phạm Thị Khánh Chi, (2006), Nghiên cứu người mang mầm vi khuẩn S. aureus mũi sinh viên khoa Dược TP. HCM, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP.HCM. Voss A., Doebbeling N.B. (1995). The worldwide prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents 5:101-106 169 . Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 164 KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ CHỦNG STAPHYLOCOCCI PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BỆNH VIỆN Bùi Minh Giao Long*, Lý. khuẩn phân lập từ môi trường bệnh viện. Mục tiêu: Khảo sát sự đề kháng với nhóm β-lactam và các kháng sinh khác đồng thời xác định kiểu gen đề kháng của các chủng Staphylocci phân lập từ không. chủng MRS đề kháng chéo với ít nhất 1 loại kháng sinh và có khoảng 17% chủng đề kháng với 5 loại kháng sinh. Không có chủng nào đề kháng chéo với 6 loại kháng sinh trở lên. Về tỉ lệ đề kháng