Các cây và các tác nhân gây bệnh có mối liên hệ phức tạp luôn ảnh hưởng đến nhau giữa chúng có sự tương tác. Đôi khi các tác nhân gây bệnh có thể gây bệnh thành công trên cây ký chủ, trong khi thường là cây chủ hiển thị kháng bệnh thành công. Flor phát hiện ra một mô hình của kháng được gọi là gene đối gen mà ở đó một gen duy nhất của mầm bệnh thực vật tương ứng với một gen kháng duy nhất của cây ký chủ. Ý kiến này đã được chứng minh là có giá trị trong việc nhân giống cây trồng và sản xuất ra các cây có chứa gen kháng bệnh mà các nhà nghiên cứu sử dụng sự kết hợp của các gen kháng để xây dựng giống kháng với các chủng gây bệnh nguy hiểm của tác nhân gây bệnh cụ thể.
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ.
Các cây và các tác nhân gây bệnh có mối liên hệ phức tạp luôn ảnh hưởng đến nhau giữa chúng có sự tương tác Đôi khi các tác nhân gây bệnh có thể gây bệnh thành công trên cây ký chủ, trong khi thường là cây chủ hiển thị kháng bệnh thành công Flor phát hiện ra một mô hình của kháng được gọi là gene - đối - gen mà ở đó một gen duy nhất của mầm bệnh thực vật tương ứng với một gen kháng duy nhất của cây ký chủ Ý kiến này đã được chứng minh là có giá trị trong việc nhân giống cây trồng và sản xuất ra các cây có chứa gen kháng bệnh
mà các nhà nghiên cứu sử dụng sự kết hợp của các gen kháng để xây dựng giống kháng với các chủng gây bệnh nguy hiểm của tác nhân gây bệnh cụ thể
Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng với tác nhân gây bệnh Giống cây tạo được gọi là giống kháng (resistant) còn chủng tác nhân gây bệnh gọi là chủng không độc (avirulent) Nhưng thực tiễn khi đen các giống kháng này ra ngoài đồng một thời gian sau tính kháng bị biến mất Từ đó người
ta rút ra một kết luận trong quần thể chủng tác nhân gây bệnh đã hình thành các đột biến có thể khắc phục được tính kháng của giống cây kháng bệnh Trong trường hợp này, chủng tác nhân gây bệnh trở thành chủng độc (virulent) đối với giống kháng đó Vì vậy để tồn tại lâu dài giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ dường như có một mối quan hệ đồng tiến hóa Mối quan hệ đồng tiến hóa này có thể được giả thích bằng thuyết gen-đối-gen
http://www.ag.ndsu.edu/plantpath/history
Trang 2Harold Henry Flor (1900-1991), một nhà bệnh cây học người Mỹ Mặc dù không phải là người đầu tiên sử dụng thuật ngữ gen-đối-gen, nhưng ông là
người đầu tiên chứng minh rằng biểu hiện bệnh là hậu quả mối tương tác của cả tác nhân gây bệnh và ký chủ và di truyền được
Flor đã xây dựng thuyết gen-đối-gen dựa trên nhiều thí nghiệm di truyền về tính gây bệnh và tính độc của các tổ hợp lai giữa các chủng sinh lý của nấm Melampsora lini gây bênh gỉ sắt cây lanh (Linum usitatissimum) trên các giống lanh có tính kháng và mẫn cảm khác nhau với nấm Các thí nghiệm này chủ yếu được thực hiện từ những năm 1940 đến 1960
THÍ NGHIỆM VỀ BỆNH GỈ SẮT CÂY LANH CỦA FLOR
1.1 Đặc điểm nấm gỉ sắt Melampsora lini.
Nấm M lini thuộc họ Melampsoraceae, bộ Uredinales, lớp nấm đảm
Basidiomycetes với bộ nhiễm sắc thể n = 18 M lini là nấm gỉ sắt đồng chủ ( hoàn thành vòng đời trên một cây ký chủ) Nấm có chu kỳ lớn tạo đủ 5 loại bào
tử trong cả vòng đời, theo trình tự là bào tử giống – bào tử xuân – bào tử hạ - bào tử đông - bào tử đảm
Vòng đời của nấm khá phức tạp gồm 2 pha đơn bội và song hạch (2 nhân) Nấm qua đông dưới dạng bào tử đông lưỡng bội (2n) trên tàn dư cây ký chủ Vào mùa xuân, nhân lưỡng bội của bào tử đông giảm nhiễm thành nhân đơn bội (1n) và bào tử đông nảy mầm thành đảm, từ đảm sẽ hình thành 4 bào tử đơn bội gọi là bào tử đảm (1n) Bốn bào tử đảm này khác nhau về kiểu ghép cặp (mating type) trong đó 2 bào tử thuộc kiểu ghép cặp (+) và 2 bào tử còn lại thuộc kiểu ghép cặp (-) Bào tử đảm tách khỏi đảm, phát tán và tiếp xúc trên bề mặt lá cây lanh Trong điều kiện đủ ẩm, bào tử đảm nảy mầm và xâm nhập qua biểu bì trên của lá và hình thành sợi nấm đơn bội trong mô lá Trong mô lá, sợi nấm phát triển trong gian bào và hình thành vòi hút bên trong tế bào để hấp thụ dinh
dưỡng Ở pha đơn bội này, nấm là loài dị tản (heterothallic) có nghĩa mỗi cá thể (sợi nấm) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (-) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (+) Tiếp theo,
Trang 3sợi nấm đơn bội hình thành 2 cơ quan sinh sản khác nhau (1) ở phía biểu bì trên, nấm tạo ra ổ bào tử giống dạng bình tam giác có lỗ mở, bên trong chứa các bào tử giống (1n) đóng vai trò như giao tử đực Nhô ra khỏi lỗ mở của ổ bào tử giống là các sợi nấm hữu thụ, phân nhánh, không có vách ngăn gọi là sợi tiếp nhân (2) Ở phía biểu bì dưới, vẫn cùng một cá thể nấm, sợi nấm hình thành tiền
ổ bào tử xuân (gồm các sợi nấm tụ tập lại) chứa các tế bào gốc (basal cells) đóng vai trò như giao tử cái
http://www.asturnatura.com/especie/melampsora-lini.html
Quá trình sinh sản hữu tính bắt đầu khi bào tử giống khác kiểu ghép cặp (ví
dụ là +) tiếp xúc và dung hợp (fusion) với sợi tiếp nhận (ví dụ là -) Sau khi dung hợp, nhân của bào tử giống (+) sẽ di chuyển dọc sợi tiếp nhận (-), vượt qua các vách ngăn tế bào của sợi nấm (-) tiến tới tiền ổ bào tử xuân (-), cuối cùng tới
tế bào gốc (-) để tạo thành tế bào gốc chứa 2 nhân (- và +) Tiền ổ bào tử xuân sẽ phát triển thành ổ bào tử xuân có lỗ mở, bên trong hình thành các bào tử xuân 2 nhân (n+n) mọc thành chuỗi Bào tử xuân giải phóng khỏi ổ bào tử xuân, phát
Trang 4tán nhờ gió, tiếp xúc, xâm nhập vào mô lá, thân và hình thành sợi nấm 2 nhân trong mô Sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành các ổ bào tử hạ chứa nhiều bào tử hạ 2 nhân Bào tử hạ tiếp tục phát tán và tạo ra nhiều chu kỳ xâm nhiễm mới Vào mùa thu, trên tàn dư lá bệnh, sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành ổ bào tử đông chứa các bào tử đông hình trụ Lúc đầu, mỗi tế bào của bào tử đông gồm 2 nhân riêng biệt nhưng trong thời gian ngủ nghỉ, 2 nhân sẽ tiến hành hợp nhân (karyogamy)
để tạo thành 1 nhân lưỡng bội (2n) Như vậy bào tử đông thành thục là bào tử đơn nhân lưỡng bội và ngủ nghỉ qua đông để tới mùa xuân bắt đầu chu kỳ bệnh mới
Như vậy, nấm gỉ sắt lanh có pha 2 nhân chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển Vì sợi nấm hay bào tử 2 nhân chứa kiểu gen của cả bố và mẹ nên di truyền tính gây bệnh và tính độc của nấm có thể được phân tích theo các qui luật di truyền Menden
1.2 Đặc điểm cây ký chủ.
http://prgdb.crg.eu/organism.php?name=Linum_usitatissimum
Cây lanh (Linum usitatissimum) là cây tự thụ, có nguồn gốc từ phía đông Địa Trung Hải đến Ấn Độ được trồng rộng rãi ở Ai Cập cổ đại,được trồng chủ yếu để lấy hạt, dầu và sợi Vào những năm 30, các nhà bệnh cây Mỹ đã xác định được cây lanh có thể kháng được bệnh gỉ sắt và tính kháng được điều khiển bởi
di truyền với kiểu hình kháng là trội so với kiểu hình nhiễm Cho tới nay, 31 gen kháng bệnh gỉ sắt đã được phát hiện trên lanh Các gen này nằm trên 5 loci được
Trang 5ký hiệu là K (2 gen), L (13 gen), M (3 gen), N (6 gen) và P (13 gen) Trong những năm 40 và 50, Flor đã sử dụng nhiều giống lanh kháng bệnh để nghiên cứu di truyền về tính kháng bệnh của cây lanh Các giống lanh này là các giống thuần, đồng hợp tử về tính trạng kháng nhiễm và được gọi là các giống chỉ thị
1.3 Các thí nghiệm của Flor.
Vào những năm 1940, trước khi DNA cho thấy có trách nhiệm kế thừa, một nghiên cứu bệnh cây học đã nghiên cứu bệnh gỉ sắt lanh
Năm 1942, Flor lai chủng nấm số 6 với số 22 Khi thử tính gây bệnh của 67 con cháu F2 trên 12 giống chỉ thị ông đã:
• Xác định được 57 kiểu hình không độc/độc khác nhau (ông gọi là các chủng) Kết quả này gợi ý rằng trên mỗi giống chỉ thị thì kiểu hình độc và không độc là khác nhau giữa chủng 6 và chủng 22
• Kiểu hình không độc là trội so với kiểu hình độc vì trên mỗi giống chỉ thị, tỷ lệ phân ly không độc/độc = 3/1
Năm 1946, Flor lai chủng nấm số 22 với chủng số 24 Khi thử tính gây bệnh của 133 con cháu F2 trên 14 giống chỉ thị ông thu được kết quả sau:
• Xác định được 68 kiểu hình không độc/độc khác nhau (chủng)
• Xuất hiện sự phân lý tính trạng không độc/độc trên 14 giống Tỷ lệ phân ly khác nhau tùy thuộc số gen kháng cây chỉ thị: 3/1 trên 9 giống mang 1 gen kháng; 15/1 trên 2 giống mang 2 gen kháng, và 63/1 trên 1 giống mang 3 gen kháng
Năm 1955, Flor sử dụng lại 67 con lai F2 của chủng số 6 và chủng
số 22 để thử tính gây bệnh trên 32 giống chỉ thị, phần lớn chúng chỉ có một gen kháng (theo xác định của Flor) Ông thu được kết quả tương tự:
• Xuất hiện sự phân ly tính trạng không độc/độc trên 24 giống chỉ thị
Tỷ lệ phân ly trên 23 giống đều là 3/1
Trang 6• Đa số các cặp không độc/độc là khác nhau vì chúng phân ly độc lập với nhau.
Các kết quả trên đưa Flor tới kết luận là (1) khả năng gây bệnh của nấm M lini trên cây lanh do sự tương tác của các gen kháng/nhiễm của cây ký chủ và gen không độc/độc của nấm gây bệnh; (2) Mối tương tác này là đặc hiệu nghĩa
là một gen qui đinh tính không độc/độc của nấm tương tác với chỉ một gen qui định tính kháng/nhiễm của cây ký chủ; và (3) các gen qui định tính kháng của cây và tính không độc của nấm các gen trội
KHÁI NIỆM GEN-ĐỐI-GEN
1.4 Khái niệm
Năm 1971, Flor đã viết: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ
có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh Khẳng định này của Flor được sử dụng rộng rãi và được xem là định nghĩa chính thức của Flor về thuyết gen-for-gen
Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội – trội trong khi đó “gen qui định tính gây bệnh” thường được hiểu là gen lặn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn Do vây, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: “đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau”
Lý thuyết gen đối gen đã được chấp nhận và áp dụng cho cả nấm và vi khuẩn gây bệnh , cùng với một số virus, tuyến trùng, và thậm chí cả côn trùng Nó là khá phức tạp , vì nhiều tác nhân gây bệnh có nhiều gen có thể ảnh hưởng đến tính độc hại - khả năng gây bệnh Ngoài ra, các cây có xu hướng có nhiều loại gen kháng khác nhau Có rất nhiều chủng khác nhau của một số tác nhân gây bệnh Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gen-for-gen) được gọi chung là gen R (Resistance) Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr
Trang 7(Avirulence) Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lăn Mỗi chủng có khả năng tấn công kết hợp khác nhau của các giống cây trồng, tùy thuộc vào hỗn hợp của các gen kháng trong cây mà người ta sử dụng các kí hiệu riêng.
1.5 Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen
Cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng
Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại) Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và
ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng
Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2n trong đó n
là số gen kháng R trong quần thể ký chủ
Xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội
là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen )
Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững
Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu
nhạy/apoptosis
ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN KHÔNG ĐỘC (GEN AVR)
Tác nhân gây bệnh với các gen avirulence có thể gây bệnh trên cây chủ của chúng mang bất kỳ loại gen kháng , trong khi những cây có gen avirulence phù hợp với một gen kháng cụ thể sẽ tạo ra cây có khả năng chống chịu Những gen
Trang 8avirulence sản xuất một sản phẩm được phát hiện bởi các cây, chủ yếu là các Arv protein tương tác với hệ thống miễn dịch cơ bản của thực vật Nâng cao khả năng của các tương tác phân tử giữa các tác nhân gây bệnh và chủ của nó nên kết quả trong kiểm soát dịch bệnh lớn hơn của tác nhân gây bệnh
Một số thuật ngữ liên quan hiện đang được sử dụng:
Effector (chất hiệu ứng): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh Một effector được gọi là elicitor khi nó bị cây nhận biết và khởi động phản ứng phòng thủ.Elicitor (chất kích hoạt): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới tăng cường tính kháng và được cây nhận biết Khi sự nhận biết được thực hiện nhờ protein R thì elicitor được xem là Avr protein
Định nghĩa
Gen Avr là các gen làm cho tác nhân gây bệnh trở thành không độc khi có mặt gen kháng R của cây ký chủ Khả năng này của gen Avr có được là do sản phẩm protein của nó cảnh báo tế bào cây ký chủ về sư tấn công của tác nhân gây bệnh và do đó khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới phản ứng siêu
nhạy/apoptosis Như vậy có thể xem protein Avr là elicitor được cây nhận biết thông qua gen kháng R
Không giống như gen kháng R, nhìn chung, protein Avr chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau Dưới đây là một số đại diện Avr gen/protein
Họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas Cho tới nay, khoảng 40 Avr gen của họ này đã được xác định từ nhiều loài Xanthomonas kể cả 1 gen Brg11 của
vi khuẩn Ralstonia solanacearum Các ví dụ của các Avr gen thuộc họ này bao gồm:
Trang 9Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 - 23 các chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập nhân (Nuclear Localization Signal – NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain – AD) Cấu trúc này chứng tỏ (đã được chứng minh bằng thực nghiệm) các protein này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ
Gen AvrPto của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv tomato (gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua) Gen này mã hóa protein AvrPto có trọng lượng phân tử thấp khoảng 18 kD và được hệ thống tiết loại 3 của vi khuẩn đưa và trong tế bào chất
Các gen Avr của nấm Có khá nhiều gen Avr của nấm đã được phân lập Một
số protein Avr là các protein giàu cystein như AvrCf2 của nấm Cladosporium fulvum; AvrP4; AvrP123 của nấm M lini Một số protein Avr được nấm tiết ra
Trang 10ở gian bào (apoplasm) và tương tác với protein R của ký chủ ở bề mặt tế bào; vi
dụ như các protein AvrCf2, vrCf4, AvrCf9 của nấm C fulvum Một số lại được nấm tiết trực tiếp vào tế bào chất qua vòi hút chẳng hạn như các protein kháng của nấm sương mai, phấn trắng, gỉ sắt
Các gen Avr của virus Đối với virus thực vật, các gen Avr thường liên quan đến 1 protein chức năng của virus Ví dụ điển hình là protein tái sinh
(Replication protein) của Tobacco mosaic virus –TMV là gen không độc tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá
Ngoài ra, các protein vỏ (Coat Protein – CP) của virus cũng là gen Avr phổ biến của virus
Một câu hỏi cần đặt ra là tại sao các Avr gen/protein của tác nhân gây bệnh làm giảm khả năng tấn công (mất ưu thế thích nghi) của tác nhân gây bệnh lại vẫn tồn tại trong quần thể tác nhân gây bệnh Câu trả lời là mặc dù các gen này
có thể tương tác (trực tiếp hoặc gián tiếp) với gen kháng thì trong trường hợp không có gen kháng, các gen Avr này vẫn có một số chức năng có lợi cho tác nhân gây bệnh Ví dụ trên cây cà chua thiếu gen kháng Pto thì gen AvrPto sẽ tạo điều kiện cho sự gây bệnh của vi khuẩn bằng cách ức chế sự phòng thủ vách
tế bào cây (thí nghiệm trên cây Arabidopsis) Các nghiên cứu đối với nấm
Phytophthora infestans, Puccinia graminis cho thấy, ngay sau khi áp lực chọn lọc bởi gen kháng R của ký chủ bị mất thì các gen Avr tái xuất hiện
Trang 111.6 Pto
Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất Pto là protein kháng chống vi khuẩn P syringae pv tomato mang gen AvrPto Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy
1.7 CNL (CC-NB-LRR)
Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper – LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil – CC) ở đầu amin; (2) một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding – NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất Các ví dụ về protein lớp CNL trình bày ở Bảng 2
1.8 TNL (TIR-NB-LRR)
Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC
Trang 12là một chuỗi TIR Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor) Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất Các ví dụ về protein lớp TNL trình bày ở Bảng 2.
Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là
họ NB-LRR Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen)
Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp
1.9 Cf
Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9 Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào)
1.10 Xa21
Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào)
và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất
Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm:
• Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô