Định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của flavonoid trong lá lốt

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘICAO TIẾN DŨNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẢM DÒ MỘT s ố TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TRONG LÁ LỐT KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999-2004 -Người

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

CAO TIẾN DŨNG

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẢM DÒ MỘT s ố TÁC

DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TRONG LÁ LỐT

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999-2004)

-Người hướng dẫn: TS Vũ Văn Điền

Dược sĩ Lê Quốc Hùng-Nơi thực hiện:Bộ môn Dược học cổ truyền -Thời gian thực hiện:9/2003-5/2004

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình làm khtìá luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự 'hướng dẫn chỉ bảo tận tình của các thầy cô Với lỏng biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới: Ts V ũ V ă n Điền

Dược sĩ Lê Quốc Hùng

Đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua.

Em cũng xin chân thành cảm ơn, các thầy cô trong bộ môn Dược học cổ truyền, bộ môn Dược lý và các phòng ban, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đ ể em hoàn thành đề tài này.

Hà nội, tháng 5 năm 2004

Sinh viên

Cao Tiến Dũng

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề 7

Phần 1-tổng quan 8

1 lĐặc điểm thực vật phân bố 8

1.2Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 8

1.3 Trồng trọt, thu hái và chế biến 9

1.4 Thành phần hoá học 9

1.5 Tác dụng dược lý 10

1.6 Công năng chủ trị 11

1.7 Một số bài thuốc có vị Lá lốt được dùng trong điều t r ị 11

Phần 2-Thực nghiệm và kết quả 12

2.1-Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 12

2.1 lNguyên liệu 12

2.12.Phương pháp thực nghiệm 13

a Định tính flavonoid 13

b Định lượng flavonoid 13

c Thử tác dụng sinh học 13

❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột 13

❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự do .14

❖ Tác dụng lợi mật 14

2.2Kết quả thực nghiệm và nhận xét 14

2.2.1.Định tính flavonoid 14

2.2.2Định lượng flavonoid 15

2.2.3Thử tác dụng sinh học 20

❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột nhắt 20

❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự d o 23

❖ Tác dụng lợi mật 26

Phần 3-Kết luận và đề xuất 29

3.1 Kết luận 29

3.2Đề xuất 29

Tài liệu tham khảo 30

Phu luc 32

tp toàn phần

ĐẬT VẤN ĐỂ •

Cây Lá lốt từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng làm thuốc và gia v ị Lá lốt mọc khắp mọi nơi trên đất nước ta và có trữ lượng lớn ở vùng Đông Nam á Lá lốt thường được nhân dân sử dụng trong các trường hợp :Đau răng, đau xương thấp khớp, tê thấp đổ mồ hôi tay chân, đầy bụng khó tiêu, bệnh đi ngoài lỏng

Đã có một số tác giả nghiên cứu về cây Lá lốt, các kết quả cho thấy cây Lá lốt

có chứa các nhóm hoạt chất tinh dầu, alcaloid, tanin, Aavonoid.Thành phần flavonoid hầu như chưa có tác giả nghiên cứu Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc nghiên cứu, đánh giá thực chất vai trò của cây thuốc để định hướng cho việc khai thác sử dụng hợp lý an toàn và hiệu quả.Trong khoá luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau

• Định tính, định lượng flavonoid toàn phần trong Lá lốt

• Thử tác dụng chống oxy hoá, hoạt tính dọn gốc tự do, tác dụng lợi mật của dịch chiết cồn và flavonoid toàn phần

PHẦN 1-TổNG QUAN

1.1.Đặc điểm thực vật,phân bô

Cây Lá lốt thuộc bộ Hồ tiêu (Piperales), họ Hồ tiêu (Piperaceae).Trong họ Hồ tiêu có hai chi :Peperomia và piper, trong chi piper có 10 cây làm thuốc trong

đó có cây Lá lốt Cây Lá lốt còn có tên khác là tất bát, phjăc pat(Tày), ana khia táo, lau chuẩy(Dao)[5] ana klùa táo(Buôn Mê Thuột)[l 1]

Tên khoa học là :Piper lolot C.DC họ Hồ tiêu Piperaceae

Cây thân thảo, sống dai, cao 30-50 cm Thân hình trụ, có đốt, phồng lên ở các mấu, thân có rãnh dọc, có lông nhỏ.Thân non màu xanh già chuyển sang màu nâu, toàn cây có mùi thơm

Lá đơn nguyên mọc so le, dài khoảng 13cm rộng 8-10cm ,gốc lá hình tim, đầu

lá nhọn phiến lá mỏng mặt trên nhẵn màu xanh, mặt dưới có lông nhỏ ở các đường gân, cuống lá dài khoảng 2,5cm có bẹ gốc ôm lấy thân

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông đơn tính, dài khoảng l,5cm Trục bông cái

có lông, lá bắc có phiến tròn không có cuống Bầu nhẵn hình trứng, nằm sâu trong trục bông, đầu nhụy hình sợi

Quả mọng một hạt màu vàng nâu Mùa hoa quả tháng 8-10

Lá lốt được coi là loài đặc hữu phổ biến ở các nước Lào, Việt Nam, Campuchia Tại Việt Nam Lá lốt mọc hoang ở khắp mọi nơi trong cả nước, đặc biệt là ở các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m)[5,l 1,9,4,3]

1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu

Vi phẫu lá:biếu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp đều đặn, biểu bì dưới của gân lá mang lông che chở đơn bào và đa bào ngắn, đầu nhọn có từ 2-3 tế bào xếp thành dãy, lỗ khí ở mặt dưới phiến lá Đám mô dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì dưới Mô mềm gồm tế bào tròn màng mỏng Một bó libe gỗ

nằm giữa gân lá gồm có vòng mô dày bao bọc xung quanh bó gỗ có nhiều mạch to xếp phía trên , cung libe ở phía dưới Phiến lá có mô mềm đồng hoá xếp giữa hai lớp hạ bì tê bào nhỏ ,thành mỏng xếp lộn xộn Rải rác có tế bào tiết tinh dầu trong mô mềm và trong libe

Bôt:Màu lục xám mùi thơm vị hơi đắng Soi kính hiển vi thấy : mảnh biểu bì trên của lá gồm tế bào màng mỏng, hình nhiều cạnh mang tế bào tiết Mảnh biểu bì dưới là tế bào màng mỏng, nhăn,mang lỗ khí và tế bào tiết Tế bào tiết màu vàng, xung quanh có khoảng 6 tế bào xếp toả ra.Tế bào biểu bì dưới gân

lá hình nhiều cạnh màng mỏng mang lông che chở đơn hay đa bào ngắn đầu nhọn Mảnh thân cây :tế bào hình nhiều cạnh, mang lỗ vỏ, lông che chở và tế bào tiết, có khi lông đã rụng để lại những vết tròn nhỏ Sợi mô cứng thành mỏng hay hơi dày, khoang rộng, mảnh mạch xuắn, mạch mạng, mạch điểm [3]

1.3 Thu hái, trồng tr ọ t, chê biến

- Thu hái:Lá lốt thu hái quanh năm có thể dùng cả thân lá và rễ, hái về dùng tươi hay phơi khô để dùng, nhưng thường dùng tươi Nếu dùng rễ thường thu hái vào tháng 8-9[5 ,11]

- Trồng trọt: Lá lốt được trồng bằng các đoạn thân dài 20-30cm, các đoạn thân đem giâm vào những nơi ẩm ướt dưới bóng mát như dọc theo hàng rào, tường xây Cây ít bị sâu bệnh[5,l 1]

- Chế biến:Sau khi thu hái rửa sạch loại bỏ tạp chất cắt đoạn 3-5cm có thể dùng tươi hay phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ thấp Nếu có dược liệu khô cần rửa sạch cắt đoạn như trên phơi khô, khi dùng tiến hành vi sao tới khi có mùi thơm là được[ 13]

1.4.Thành phần hoá học

-Theo các tài liệu toàn cây Lá lốt có tinh dầu alkaloid, flavonoid, tanin Hàm lượng tinh dầu trong lá non là 0,17%:0,2% trong lá già và 0,06% trong cọng thân.Các chỉ số tinh dầu:d25:0,9677;nd32: l,5202;aD32:-4, chỉ số acid 0,697, chỉ

số este 6,256; chỉ số acetyl 32,820-Thành phần tinh dầu có trên 35 hợp chất trong đó đã xác định được 25 chất bằng sắc ký khí Chất có hàm lượng cao nhất là P-caryophylline và bomyl acetat.[19]

-Theo tài liệu [20,21] trong dịch chiết n_hexan của cây Lá lốt có Ị3-asarone

và một chất kết tinh dược xác định cấu trúc bằng phương pháp nhiễu xạ tia X

là:3-(4'-Methoxyphenyl)propanoyl pyrrole[21]

1.5 TÉC dụng dược lý

Theo các tài liệu Lá lốt có các tác dụng sau:

-Tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn :Bacillus pyocyaneus, Staphylococus

aureus và Bacillus subtilis.Tác dụng kháng khuẩn của ba dạng bào chế cao lá

khô ,cao lá tươi, và nước ép lá tươi gần tương tự như nhau[5]

-Tác dụng chống viêm.Cao lỏng Lá lốt dùng ngậm và viên cao Lá lốt dùng uống được thử nghiệm trên lâm sàng tỏ ra có tác dụng giảm đau và và trị các

-Theo tài liệu [12]trong Lá lốt có các hợp chất

CH,

H 1 14-beta pregnane o nrDíTnono

bênh viêm cấp tính về răng miệng , trị viêm răng do răng sâu có biến chứng, túi viêm răng khôn, nhất là ở hàm dưới[5] Dịch chiết cồn(2:1), flavonoid toàn phần 4% có tác dụng chống viêm tương tự như nhau trên chuột cống qua đường uống[17]

-Tác dụng giãn mạch ngoại biên và ức chế hoạt tính gây co thắt cơ trơn ruột của histamin và acetylcholin [5]

l.ổ.Công năng và chủ trị

Tính v ị , quy kinh:Lá lốt có vị cay mùi thơm tính ấm, quy kinh tỳ, phế

Công năng:ôn trung tán hàn, hạ khí, chỉ thống [3,5,11,18]

Chủ trị: Phong hàn thấp chân tay lạnh, tê bại Rối loạn tiêu hoá, nôn mửa, đầy hơi, đau bụng ỉa chảy Thận và bàng quang lạnh Đau răng đau đầu chảy nước mũi hôi

Liều dùng:8-12g dạng thuốc sắc

1.7.Một sô bài thuốc có vị Lá lốt đã được dùng trong điều trị

-Dược sĩ Triều Đắc (năm 1962) đã dùng nước sắc Lá lốt kết hợp với dầu hạt dọc để điều trị các vết thương thấy có kết quả tốt [7]

-Viên Quân y 108,198,354 đã dùng cây Lá lốt để điều trị viêm loét trong khoa Răng hàm mặt

-Bệnh viện Thuận Châu(Sơn La) dùng Lá lốt 15g, vả đay 30g, bạch hoa xàlOg, thiên niên kiện 20g, rễ cỏ xước 20g, rễ cây xấu hổ 30g, cốt toái bổ 15g,gừng sắc uống liên tục trong 10 ngày Dùng đề điều trị đau khớp

-Bác sĩ Lò Kim (Bệnh viện Thuận Châu) và Bác sĩ Lò Cam(Bệnh viện 103) đãdùng bài thuốc gia truyền để điều trị cho bệnh nhân bị đau khớp ở bệnh việnThuận Châu và nhân dân trong vùng có tác dụng tốt

Các chế phám từ Lá l ố t :

Dentoxid [16]

Thành phần :Cao cồn Lá lốt 10% (70 ml), methanol 4g, tinh dầu hương nhu 21g, clorophin lg

Cách sử dụng:Tẩm dịch vào bông đặt vào chỗ đau răng, sau 5-10 phút súc miệng bằng nước sôi để nguội

Công dụng:Điều trị viêm răng cấp sâu răng, viêm khớp dây chằng ởrăng

Pipelô ngậm,Pipelô uống

Công dụng :Chữa đau răng nhức lợi[ 10]

Các bài thuốc khác cổ vi Lá lốt

• Chữa chân tay đau nhức

Lá lốt rễ bưởi bung, rễ cây vòi voi, rễ cỏ xước tất cả đều dùng tươi thái mỏng sao vàng mỗi vị đều nhau 15g khô, sắc với 600ml nước Cô còn 200ml Chia 3 lần uống trong ngày [ 11 ]

• Giải độc nấm, rắn cắn:

Lá lốt, lá khế, lá đậu ván trắng mỗi vị 50g Giã nát thêm nước Gạn uống

• Chữa viêm răng sâu răng[5]

Cao mềm Lá lốt 2g, đường kính 2g nước vừa đủ 10ml Hoà tan rồi ngậm

• Chữa viêm xoang chảy nước mũi đặc[5]

Lá lốt vò nát đặt vào lỗ mũi

PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1-Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1Nguyên liệu

□ Dược liệu :phần trên mặt đất của cây Lá lốt được thu hái vào tháng 9/2003

ở Hải Hậu -Nam Định Dược liệu sau thu hái đem rửa sạch thái nhỏ thành các đoạn 2-3cm, sấy khô ở 60° c ,bảo quản trong túi nilon để nghiên cứu

□ Hoá chất, dung môi:Sử dụng dung môi của Trung Quốc

Sắc ký lớp mỏng:bảng mỏng tráng sẩn (MERCK)

□ Súc vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng swiss có trọng lượng 18-

22g,Đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, không phân biệt đực cái

□ Phương tiện thiết bị:

- Máy đo độ ẩm :Presica HA60(Thuỵ Sĩ)

- Cân kỹ thuật :Presica Xb320C( Thụy Sĩ)

• Phương pháp thực nghiệm:Phương pháp định lượng MDA được miêu tả bởi Jadwiga Robax(Ba Lan, 1987) và Mitsno Tanaka(Nhật Bản, 1994)

• Nguyên lý của phương pháp :

-Trong quá trình peroxyd hoá lipid có tạo ra sản phẩm trung gian là MDA, MDA có thể tạo phức với acid thiobarbituric tạo ra phức Trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp phụ cực đại ớ 530 và 532 nm

-Phản ứng của MDA với acid thiobarbituric:

-Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA Nồng độ MDA được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA được tính theo đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng

❖ Tác dụng lợi mật:Thử theo phương pháp rudi

□ Tiến hành phản ứng

• Phản ứng Cyanidin: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm to thêm một ít bột Magiê kim loại, cho từng giọt acid HC1 đặc Sau hai phút dung dịch có màu hồng nhạt

• Phản ứng với NH3 :Nhỏ một ít dịch chiết lên giấy lọc, để cho khô tự nhiên, hơ giấy lọc trên miệng lọ NH3 đặc Giấy lọc chuyển từ màu vàng nâu nhạt sang màu vàng đậm

• Phản ứng với FeCl35%:Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm hai giọt FeCl3, thấy xuất hiện tủa xanh đen

□ Nhận x é t: Dược liệu có chứa flavonoid

2.2.2.Đinh lương flavonoid

a.Kiểm traflavonoid trong một sô'phân đoạn chiết:

Để có thể chiết kiệt nhất flavonoid cho quá trình định lượng , chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ trên hai phân đoạn chiết là Ethyl acetat và n_Butanol Lấy 50g dược liệu đã sấy khô cho vào bình Sohxlet chiết loại tạp bằng

cloroform cho đến khi dịch cloroform không màu Lấy dược liệu ra để cho bay hơi hết cloroform Tiếp tục chiết bằng MeOH trong 24 giờ Dịch chiết thu được cất bay hơi dung môi ở áp lực giảm thu được cao đặc Hoà tan cao đặc bằng 200ml nước nóng để trong tủ lạnh qua đêm, lọc lấy dịch Dịch lọc thu được chiết bằng Ethyl acetat Chiết nhiều lần cho đến khi lớp Ethyl acetat không có màu(kiểm tra bằng hơi NH3 thấy không có màu)

Dịch nước còn lại đem thử với NH3, kết quả vẫn có màu vàng đậm, chiết tiếp dịch nước bằng n_Butanol cho đến khi dịch nước và dịch n_Butanol hết màu vàng với NH3,cất thu hồi n_Butanol thu được cao đặc.Quá trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ 1

Hình 1: Sơ đồ chiết flavonoid ở các phân đoạn dung môi khác nhau

❖ Định tính phân đoạn Ethyl acetat Cất thu hồi Ethyl acetat thu được cao đặc.Cao đặc thu được đem làm các hòa tan bằng cồn 96° đem làm phản ứng định tính

o Phản ứng cyanidin :Cho màu đỏ cam

o Phản ứng hơi NH3:màu vàng đậm với NH3

❖ Định tính flavonoid trong dịch n_Butanol :Cất thu hồi n_Butanol thu được cao đặc, cao đặc hoà với cồn 96° để làm phản ứng định tính

flavonoid, phản ứng định tính cho kết quả dương tính giống với phân đoạn Ethyl acetat

Thừ nghiêm chav sác kv lớp mỏng với dich chiết Ethyl acetat và n Butanol trên các hê dung môi:

Hệ I:n_Butanol bão hòa nước

Hệ II: Ethyl acetat:toluen:acid focmic(5:6:l)

Hệ III: Ethyl acetat:MeOH(4:l)

Hệ IV: Ethyl acetat:MeOH:H20(100:17:13)

Hệ V: n_Butanol:Ethanol:NH3(7:2:5)

Hệ VI: n_Butan0l:CH3C 00H :H 20 (4 :1:5)

Hệ VII:n_Butanol:HCl 2N( 1:1) (pha trên) ,x

Kết quả hệ dung môi VII tách tốt nhất

Kết quả sắc ký lớp mỏng của dịch chiết Ethyl acetat và n_Butanol với hệ VII được trình bày ở hình 2(phụ lục)

Nhận xét: sắc ký đồ của dịch chiết Ethyl acetat và n_Butanol gần giống nhau Các vết của sắc ký đồ của dịch chiết n_Butanol có màu đậm hơn và nhiều hơn,

có nhiều vết lên màu với NH3 hơn

Kết quả flavonoid toàn phần của dịch chiết n_Butanol được trình bày ở bảng

1, hình l(phụ lục)

Bảng 1 Kết quả sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần phân đoạn n_Butanol

độ

Nhân xét:các vết 2, 3, 4 có tính chất giống nhau với các thuốc thử vết số 3 có đâm độ cao nhất, riêng vết 2 có màu nâu ở u v 365 để ra ngoài không khí 10

phút phát quang màu hồng đỏ ở UV365 khi hơ qua NH3 lại mất màu hồng đỏ Kết luân: Flavonoid trong Lá lốt nằm chủ yếu ở phần dịch chiết n_Butanol

Vì vậy chúng tôi đưa ra quy trình định lượng như sau

b Định lượng: Lấy 15g dược liệu gói vào giấy lọc cho vào bình Sohxlet chiết

loại tạp bằng cloroform cho đến khi dịch chiết hết màu xanh Để khô tự nhiên Chiết tiếp bằng MeOH trong 20 giờ Cô cạn dịch chiết đến cắn hoà tan bằng

1 OOml nước nóng để qua đêm cho lắng , lọc, dịch nước chiết bằng n_Butanol cho đến khi dịch nước hết màu vàng với NH3 Dịch n_Butanol thu được cho vào cốc đã cân b ì , cô cách thủy dịch n_Butanol đến cắn , sấy khô ở 80° c đến khối lượng không đ ổ i, cân cốc trên cân kỹ thuật

Làm song song với ba mẫu và đo độ ẩm

Quy trình chiết xuất định lượng được trình bày ở hình 2

Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính theo công thức

X = — f -100.

m (\ - b )

X:Hàm lương flavonoid toàn phần %

a:Khối lượng flavonoid toàn phần chiết được (g)

m:khối lượng dược liệu đem chiết( fg)

b:Hàm ẩm dược liệu (%)

Kết quả được trình bày ở bảng 2

Bảng2:Hàm lượng íìavonoid toàn phần

Lầnl Khối lượng dược liệu độ ẩm Khối lượng Hàm lượng

2.2.4Thử tác dung sinh hoc

❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não

> Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu

- Cao Lá lốt: lấy 50g bột dược liệu cho vào bình Sohxlet chiết loại tạp bằng cloroform, tiếp tục chiết bằng Ethanol trong 24 giờ , cất thu hồi Ethanol thu được cao đặc Chọn nồng độ lmg/lml(pha từ nồng độ c=10mg/ml)