điện di gel agarose và ứng dụng

điện di gel agarose và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài báo cáo:

ĐIỆN DI GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG

Giảng viên : TS Võ Minh Trí

Danh sách nhóm:

Phan Duy Luân MSSV: 0853010470

Đoàn Thị Thiên Trang MSSV: 0853010961

TP Hồ Chí Minh, ngày 28, tháng 10, năm 2010

MỤC LỤC

I GIỚI THIỆU CHUNG

1.Điện di

2 Phân loại

3 Nguyên tắc thực hiện

II ĐIỆN DI TRÊN AGAROSE GEL

1.Giới thiệu về agarose

2 Agarose gel

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

3.1 Kích thước của phân tử

3.2 Nồng độ agarose

3.3 Cấu hình của DNA

4.Thành phần thực hiện điện di

4.1 Agarose

4.2 Lược

4.3 Khuôn gel

4.4 Máy điện di

5 Phương pháp điện di agarose gel

5.1 Đệm pH

5.2 Chuẩn bị agarose gel

5.3 Nhuộm DNA trong agarose gel

5.4 Thu hồi DNA từ agarose gel

5.4.1 Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)

5.4.2 Ly tâm

5.4.4 Dùng hạt thủy tinh

5.4.3 Điện di vào bẫy

6 Các bước thực hiện

6.1 Chuẩn bị gel agarose

6.2 Tiến hành điện di

6.3 Nhuộm DNA bằng EtBr

6.4 Kiểm tra băng AND

III.ỨNG DỤNG

1 Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose

2.Tinh sạch và thu nhận mẫu

3 Định tính và định lượng thô nucleic acid

4 Một số ví dụ

I GIỚI THIỆU CHUNG

1.Điện di:

- Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích (isoelectic point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất chất nhuộm khác nhau (ethumdromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi điện di

- Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tích

và cấu hình của chúng

- Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương

- Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối

2 Phân loại

Gel được cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành một

hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân

tử và phản ứng tạo liên kết chéo Các kiểu điện di:

• Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb

• Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb

• Ngoài ra còn điện di trong trường xung (PFGE _ Pulse Field Gel Electrophonesic)

3 Nguyên tắc thực hiện

- Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thướt lỗ của thể nền (gel)

- Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

• Lực điện trường tác động lên chúng(nếu các phân tử tích điện khác nhau)

• Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel

• Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

II ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

1.Giới thiệu về agarose

- Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da là một trong hai thành phần chính của agarose chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30% Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC Agarose gel được ứng dụng rộng rãi

để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose)

- Agarose được tách ra ở dạng thạch từ một số loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển , được tìm thấy tại California và miền đông châu Á Agar, một thuật ngữ có nguồn gốc từ chữ thạch agar-Malay, có nghĩa là sữa ong chúa, là thường bắt nguồn từ các chi Gelidium rong biển Nó bao gồm cả phân tử agarose và agaropectin và cung cấp hỗ trợ cho các thành tế bào trong tảo biển.Agar được sử dụng như một chất làm đặc thức ăn, giống như gelatin, hoặc một phương tiện cho vi khuẩn phát triển, nấm, hoặc các vi sinh vật khác

Hình : Cấu trúc phân tử của

agarose Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong

agarose polymer Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer.

2 Agarose gel

- Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và được điện di được thực hiện theo phương nằm ngang

- Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng

độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV)

- Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose,

người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (monocular weigth marker

– MWN) Đó là một trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DAN – DNA ladder), thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực thể λ được thủy giải bởi enzyme giới hạn HindIII

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

3.1 Kích thước của phân tử

Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm

3.2 Nồng độ agarose

Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau

Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thước khác nhau) Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn

Bảng: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

3.3 Cấu hình của DNA

Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn)

và vòng đứt

4.Thành phần thực hiện điện di

4.1 Agarose

Agarose là dẫn xuất polysaccharide từ agar (thạch) có độ tinh khiết cao Có rất nhiều loại agarose khác nhau về độ điện môi, nhiệt độ nóng chảy, độ trong, độ cứng agarose thường được cung cấp dưới dạng bột khô Khi cho vào đệm sôi nó sẽ tan và giữ được trạng thái lỏng cho đến khi tạo gel khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40°C Khi đã đông gel ổn định ở nhiệt độ thấp hơn Kích thước mạng lưới và đặc tính sàn lọc phụ thuộc vào nồng độ agarose trong gel Nồng độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ Nồng độ thích hợp là 0,4% đến 4%

4.2 Lược

Dùng để tạo ra các giếng trong bản gel

4.3 Khuôn gel:

Nơi đổ gel lên

Hình: Thành phần thực hiện điện di

4.4 Máy điện di

- Buồng đệm được tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer (tạo bề dày) ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín (H 1.4) Gel bản có kích thước từ 2,5 cm2 (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến 30.15 cm2 và độ dày từ

<0,05 mm đến > 10 mm

- Điện cực

- Máy điện di

Hình ảnh về thiết bị điện di agarose

5 Phương pháp điện di agarose gel

5.1 Đệm pH

Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-Tris-acetate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-Tris-acetate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau

về cường lực ion của đệm Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity) Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó

5.2 Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic)

Nó dễ dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp Tuy nhiên, type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate

polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và

RE Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này

5.3 Nhuộm DNA trong agarose gel

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp

và có hiệu suất huỳnh quang không cao Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong 45µGel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5 phút ở nhiệt độ phòng)

Chú ý : Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh, chất độc gây ung thư, vì vậy cần luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc nhuộm,tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khi sử dụng, không được thải ra ngoài môi trường khi chưa được xử lý thích hợp.

Cấu trúc ethidium bromide

5.4 Thu hồi DNA từ agarose gel

Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không

có phương pháp nào là hoàn toàn tối ưu Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại

agarose đều bị nhiễm bẩn bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố ức chế có hoạt tính của nhiều loại

enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau;

thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của nó,

các đoạn DNA có chiều dài <1 kb có thể được thu hồi hoàn toàn, khi khối lượng phân

tử của DNA tăng thì hiệu suất chiết giảm, các đoạn DNA có kích thước >20 kb được thu hồi kém (khoảng hơn 20% sản lượng) Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính:

5.4.1 Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)

Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau

đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose

5.4.2 Ly tâm

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column) Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc

độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA

5.4.3 Điện di vào bẫy

Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45 Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa

5.4.4 Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ khoảng 4M Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm

vi tối ưu hẹp Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa

6 Các bước thực hiện

6.1 Chuẩn bị gel agarose

- Cho lượng thích hợp agarose và dung dịch đệm vào bình tam giác

- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel