Toàn văn khảo sát thành phần hóa học cây còng mù u (calophyllum thorelii pierre)

Vì vậy thực vật là nguồn cung cấp đầy tiềm năng các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú, là thành phần không thể thiếu trong nghiên cứu phát triển của ngành công nghiệp dược.. Các nghi

NGUYỄN THỊ LỆ THU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY CÒNG MÙ U (CALOPHYLLUM THORELII PIERRE)

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh Phản biện 2: PGS.TS Phạm Thành Quân Phản biện 3: PGS.TS Trương Thế Kỷ Phản biện độc lập 1: PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 2: PGS.TS Trần Hùng

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Nguyễn Diệu Liên Hoa

2 GS.TS Nguyễn Minh Đức

Tp Hồ Chí Minh - 2011

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 25

3.1 Thành phần hóa học của vỏ cây thu hái năm 2003 46

3.3.11 Acid 4-hydroxybenzoic (154) (FE7B) 121

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp SRB 124 3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa với thuốc thử DPPH 125

3.5.1 Về thành phần hóa học 125

Tài liệu tham khảo 135

Danh mục phụ lục 153

Phụ lục 156

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

d Doublet, mũi đôi

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMAPP 3,3-Dimetylallyl pyrophosphat

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

Đnc Điểm nóng chảy

HIV-1 Human Immunodeficiency Virus Type 1

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography, sắc ký lỏng hiệu năng cao HR-EIMS High Resolution Electron Impact Mass Spectroscopy,

Khối phổ bắn phá điện tử phân giải cao HR-ESIMS High Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy

Khối phổ phân giải cao ion hóa bằng kỹ thuật phun điện

IC50 Half maximal inhibitory concentration, nồng độ ức chế 50%

IR Infra Red, hồng ngoại

J Hằng số ghép cặp

m Multiplet, mũi đa

NMR Nuclear Magnetic Resonance, cộng hưởng từ hạt nhân

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

thorelion (125) (CVH7A) trong CD3OD 53 Bảng 3.2 Tương quan COSY của thorelion (125) (CVH7A) trong

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 1,5,6-trihydroxyxanthon

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 6-deoxyisojacareubin

Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của osajaxanthon (133)

(CVH6B) trong CDCl3 và metanol-d 4 57

Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 1,5-dihydroxyxanthon (4)

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

guttiferon I (134) (BH5A) trong CD3OD 62 Bảng 3.8 Tương quan COSY của guttiferon I (134) (BH5A) trong

Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

guttiferon F (114) (BH5E) trong CD3OD (BH5E) 77

Bảng 3.15 Tương quan COSY của guttiferon F (114) (BH5E) trong

Bảng 3.16 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

30-epi-cambogin (137) (BH5F) trong aceton-d 6 80

Bảng 3.17 Tương quan COSY của 30-epi-cambogin (137) (BH5F)

Bảng 3.18 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

acid benzoic (138) (BH5G) trong CDCl3 82

Bảng 3.19 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid 3-furancarboxylic

Bảng 3.20 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

calothorexanthon (140) (BH4A) trong aceton-d 6 85

Bảng 3.21 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

garbogiol (141) (BH4B) trong aceton-d 6 86

Bảng 3.22 Tương quan NOESY của garbogiol (141) (BH4B) trong

Bảng 3.23 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

1,4,8-trihydroxyxanthon (142) (BH4C) trong aceton-d 6 88 Bảng 3.24 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 1,7-dihydroxyxanthon (5)

Bảng 3.25 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của globuxanthon (143)

Bảng 3.26 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

δ-tocotrienol (128) (BH2A) trong CDCl3 92 Bảng 3.27 Số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của 1,3,5-trihydroxy-4-

(3-metylbut-2-enyl)xanthon (144) (BE3B) trong aceton-d 6 95

Bảng 3.28 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 1,2,5-trihydroxyxanthon

Bảng 3.29 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid protocatechuic (146)

Bảng 3.30 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của

1,3,5,6-tetrahydroxyxanthon (147) (BE8A) trong aceton-d 6 98 Bảng 3.31 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

thorexanthon (148) (FH2A) trong CDCl3 102

Bảng 3.32 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

thorelion (125) (FH2C) trong CD3OD 104 Bảng 3.33 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 30-epi-cambogin (137)

Bảng 3.34 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid trans-cinnamic (149)

Bảng 3.35 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

thoreliolid A (150) (FH4A) trong aceton-d 6 110

Bảng 3.36 Tương quan COSY của thoreliolid A (150) (FH4A) trong

Bảng 3.37 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

thoreliolid B (151) (FH4B) trong aceton-d 6 115

Bảng 3.38 Tương quan COSY của thoreliolid B (151) (FH4B) trong

Bảng 3.39 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và tương quan HMBC của

wogonin (152) (FE6A) trong aceton-d 6 118 Bảng 3.40 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của 6-deoxyisojacareubin

Bảng 3.41 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid vanillic (153) (FE7A)

Bảng 3.42 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid 4-hydroxybenzoic

Bảng 3.43 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của acid syringic (155) (FE7C)

Bảng 3.44 Hoạt tính sinh học của các hợp chất đã biết phân lập từ cây

Bảng 3.45 Nồng độ gây độc tế bào IC50 (µg/ml) của các dẫn xuất

benzophenon lồng thu được từ cây còng mù u trên các

Bảng 3.46 Tỉ lệ (%) gây độc tế bào của 125a và 125b trên các dòng tế

Bảng 3.47 Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa với thuốc thử DPPH 125 Bảng 3.48 Bảng tổng kết các hợp chất phân lập từ vỏ và trái cây còng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp benzophenon polyisoprenyl hóa 18

Hình 1.2 Hình cây, trái, hoa và lá cây còng mù u (Calophyllum

Hình 3.6 Tương quan HMBC và COSY của nhóm geranyl trong 134 61

Hình 3.7 Tương quan HMBC của các dây nhánh trên hệ vòng

Hình 3.11 Tương quan HMBC trong 136 73

Hình 3.12 Hóa học lập thể của vòng cyclohexanon và hệ vòng

Hình 3.13 Tương quan HMBC của hai nhóm isoprenyl và nhóm

Hình 3.21 Tương quan HMBC của hai nhóm isoprenyl và vòng

Hình 3.25 Tương quan HMBC trong 152 118

Hình 3.26 Sự tạo thành giả định vòng

Hình 3.27 Sự tạo thành giả định vòng

2-(1-hydroxy-1-metyletyl)-2,3-dihydrofuran trong calothorelion A (135)

127

Hình 3.28 Sự tạo thành giả định calothorelion B (136) từ thorelion (125) 128

Hình 3.29 Con đường giả định tạo thành thoreliolid A (150) 129

Hình 3.30 Con đường giả định tạo thành thoreliolid B (151) 129

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Kết quả phổ HR-EIMS của thorelion (125) (CVH7A) 156Phụ lục 2 Phổ 1H NMR của thorelion (125) (CVH7A) 157Phụ lục 3 Phổ 13C NMR của thorelion (125) (CVH7A) 158Phụ lục 4 Phổ HSQC của thorelion (125) (CVH7A) 159Phụ lục 5 Phổ HMBC của thorelion (125) (CVH7A) 160Phụ lục 6 Phổ HMBC của thorelion (125) (CVH7A) 161Phụ lục 7 Phổ COSY của thorelion (125) (CVH7A) 162Phụ lục 8 Phổ 1H NMR của 1,5,6-trihydroxyxanthon (131) (CVH7B) 163Phụ lục 9 Phổ 1H NMR của 6-deoxyisojacareubin (132) (CVH6A) 164Phụ lục 10 Phổ 1H NMR của osajaxanthon (133) (CVH6B) 165Phụ lục 11 Phổ 1H NMR của 1,5-dihydroxyxanthon (4) (CVH6C) 166Phụ lục 12 Phổ 1H NMR của guttiferon I (134) (BH5A) 167Phụ lục 13 Phổ HR-ESIMS của calothorelion A (135) (BH5C) 168Phụ lục 14 Phổ 1H NMR của calothorelion A (135) (BH5C) 169Phụ lục 15 Phổ 13C NMR của calothorelion A (135) (BH5C) 170

Phụ lục 16 Phổ HSQC của calothorelion A (135) (BH5C) 171

Phụ lục 17 Phổ HMBC của calothorelion A (135) (BH5C) 172

Phụ lục 18 Phổ COSY của calothorelion A (135) (BH5C) 173Phụ lục 19 Phổ HR-ESIMS của calothorelion B (136) (BH5D) 174Phụ lục 20 Phổ 1H NMR của calothorelion B (136) (BH5D) 175Phụ lục 21 Phổ 13C NMR của calothorelion B (136) (BH5D) 176

Phụ lục 22 Phổ HSQC của calothorelion B (136) (BH5D) 177

Phụ lục 23 Phổ HMBC của calothorelion B (136) (BH5D) 178

Phụ lục 24 Phổ COSY của calothorelion B (136) (BH5D) 179Phụ lục 25 Phổ 1H NMR của guttiferon F (114) (BH5E) 180Phụ lục 26 Phổ 1H NMR của 30-epi-cambogin (137) (BH5F) 181Phụ lục 27 Phổ 1H NMR của acid benzoic (138) (BH5G) 182Phụ lục 28 Phổ 1H NMR của acid 3-furancarboxylic (139) (BH5H) 183Phụ lục 29 Phổ HR-ESIMS của calothorexanthon (140) (BH4A) 184Phụ lục 30 Phổ 1H NMR của calothorexanthon (140) (BH4A) 185Phụ lục 31 Phổ 13C NMR của calothorexanthon (140) (BH4A) 186

Phụ lục 32 Phổ HSQC của calothorexanthon (140) (BH4A) 187

Phụ lục 33 Phổ HMBC của calothorexanthon (140) (BH4A) 188Phụ lục 34 Phổ 1H NMR của garbogiol (141) (BH4B) 189Phụ lục 35 Phổ 1H NMR của 1,4,8-trihydroxyxanthon (142) (BH4C) 190Phụ lục 36 Phổ 1H NMR của 1,7-dihydroxyxanthon (5) (BH3A) 191Phụ lục 37 Phổ 1H NMR của globuxanthon (143) (BH3B) 192Phụ lục 38 Phổ 1H NMR của δ-tocotrienol (128) (BH2A) 193Phụ lục 39 Phổ 1H NMR của 1,3,5-trihydroxy-4-(3-metylbut-2-

enyl)xanthon (144) (BE3B)

194

Phụ lục 40 Phổ 1H NMR của 1,2,5-trihydroxyxanthon (145) (BE6A) 195Phụ lục 41 Phổ 1H NMR của acid protocatechuic (146) (BE7A) 196Phụ lục 42 Phổ 1H NMR của 1,3,5,6-tetrahydroxyxanthon (147) (BE8A) 197Phụ lục 43 Phổ HR-ESIMS của thorexanthon (148) (FH2A) 198

Phụ lục 44 Phổ 1H NMR của thorexanthon (148) (FH2A) 199Phụ lục 45 Phổ 13C NMR của thorexanthon (148) (FH2A) 200

Phụ lục 46 Phổ HSQC của thorexanthon (148) (FH2A) 201

Phụ lục 47 Phổ HMBC của thorexanthon (148) (FH2A) 202Phụ lục 48 Phổ 1H NMR của acid trans-cinnamic (149) (FH3A) 203Phụ lục 49 Phổ HR-ESIMS của thoreliolid A (150) (FH4A) 204Phụ lục 50 Phổ 1H NMR của thoreliolid A (150) (FH4A) 205Phụ lục 51 Phổ 13C NMR của thoreliolid A (150) (FH4A) 206

Phụ lục 52 Phổ HSQC của thoreliolid A (150) (FH4A) 207

Phụ lục 53 Phổ HMBC của thoreliolid A (150) (FH4A) 208

Phụ lục 54 Phổ COSY của thoreliolid A (150) (FH4A) 209Phụ lục 55 Phổ HR-ESIMS của thoreliolid B (151) (FH4B) 210Phụ lục 56 Phổ 1H NMR của thoreliolid B (151) (FH4B) 211Phụ lục 57 Phổ 13C NMR của thoreliolid B (151) (FH4B) 212

Phụ lục 58 Phổ HSQC của thoreliolid B (151) (FH4B) 213

Phụ lục 59 Phổ HMBC của thoreliolid B (151) (FH4B) 214

Phụ lục 60 Phổ COSY của thoreliolid B (151) (FH4B) 215Phụ lục 61 Phổ 1H NMR của wogonin (152) (FE6A) 216Phụ lục 62 Phổ 1H NMR của acid vanillic (153) (FE7A) 217Phụ lục 63 Phổ 1H NMR của acid 4-hydroxybenzoic (154) (FE7B) 218Phụ lục 64 Phổ 1H NMR của acid syringic (155) (FE7C) 219

MỞ ĐẦU

Các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên có một lịch sử phát triển lâu dài với nhiều ứng dụng rộng rãi và đầy tiềm năng Đặc biệt, thực vật đã được sử dụng làm thuốc từ thời cổ đại để trị bệnh ở nhiều quốc gia trên thế giới như Hy Lạp, Ai Cập, Ấn

Độ, Trung Quốc Sự ra đời và phát triển của tổng hợp hữu cơ giúp cho ngành công nghiệp dược có những bước tiến dài và cung ứng nhiều dược phẩm tổng hợp cho thị trường thuốc trên thế giới Tuy nhiên trong thời gian gần đây, các nước phát triển đang chuyển hướng sang sử dụng thảo dược Theo điều tra của Liên minh Châu Âu, khoảng

1400 loại thuốc pha chế từ thảo mộc được sử dụng rộng rãi ở các nước thuộc Liên minh Châu Âu và có vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe ban đầu [57] Theo kết quả nghiên cứu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số thế giới vẫn còn tin tưởng vào y học cổ truyền; sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật và động vật vô cùng phong phú trong thiên nhiên [36] Từ năm 1983 đến 1994, có đến 41% thuốc mới được phê chuẩn có nguồn gốc tự nhiên Tỷ lệ này thậm chí còn cao hơn (> 60%) đối với thuốc chống lây nhiễm và kháng ung thư [25] WHO cũng đã nhận ra tầm quan trọng của y học cổ truyền và đã tích cực đề ra chiến lược, đường lối chỉ đạo và tiêu chuẩn cho thuốc có nguồn gốc thực vật [105]

Nhiều hợp chất tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong thương mại để làm thuốc điều trị bệnh như morphin, reserpin, digitoxin, penicillin, vinblastin, vincristin, taxol và artemisinin Với hơn 270.000 loài thực vật bậc cao đang tồn tại trên hành tinh này, chỉ một phần nhỏ được khảo sát hóa thực vật [119] Vì vậy thực vật là nguồn cung cấp đầy tiềm năng các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú, là thành phần không thể thiếu trong nghiên cứu phát triển của ngành công nghiệp dược Các nghiên cứu trên thực vật của ngành công nghiệp này tập trung vào việc phân lập và sử dụng trực tiếp các thành phần có hoạt tính chữa bệnh hoặc trên cơ sở đó phát triển thành thuốc bán tổng hợp hay tổng hợp [57] Ngoài ra, sự tiến bộ và phát triển vượt bậc của ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật, đã giải quyết được một phần vấn đề nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc

Calophyllum là một chi lớn của họ Bứa (Guttiferae), phân bố khắp các miền nhiệt

đới Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy chi này là nguồn giàu xanthon, coumarin, acid chromanon, biflavonoid và triterpen với hoạt tính sinh học đa dạng như kìm hãm HIV-1, kháng ung thư, kháng khối u, kháng kích thích bài tiết, bảo vệ tế bào và kháng virus [99] Điều này thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Ở Việt

Nam, một số loài thuộc chi Calophyllum được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian

để trị bỏng, thấp khớp, viêm gan, các bệnh về da và làm thuốc tẩy xổ

Luận án này khảo sát thành phần hóa học của vỏ và trái cây còng mù u

(Calophyllum thorelii Pierre) thu hái ở Lâm trường Sông Kôn, tỉnh Bình Định Sau đó

thử hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức chế tế bào ung thư của một số hợp chất phân lập được trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (NCI-H460)

Mục tiêu của luận án là cung cấp thông tin khoa học về thành phần hoá thực vật của

họ Bứa ở Việt Nam, làm giàu danh mục các hợp chất tự nhiên mới trên thế giới, khẳng định giá trị tài nguyên thực vật Việt Nam Ngoài ra, việc khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được từ cây còng mù u là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về dược tính để sử dụng các hợp chất này làm thuốc chữa trị ung thư trên cơ sở của hợp chất tự nhiên hay bán tổng hợp, định hướng khai thác cây thuốc từ nguồn thực vật phong phú và đa dạng ở nước ta

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về họ Bứa (Guttiferae)

Họ Bứa (Măng cụt, Guttiferae hay Clusiaceae) gồm khoảng 40 chi với hơn 1000 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm như Nam Á hay Đông Nam Á, một số mọc ở Nam Mỹ và Châu Phi Đặc điểm của các loài này là thường tiết

ra nhựa màu vàng hay màu trắng [133, 134] Tại Việt Nam, theo GS Phạm Hoàng Hộ,

họ Bứa có 62 loài, phân bố rải rác khắp đất nước [6]

1.2 Giới thiệu về chi Calophyllum

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Calophyllum là một trong những chi lớn của họ Bứa (Guttiferae) với khoảng 200

loài, phân bố khắp các miền nhiệt đới [99] Gỗ rất chắc và bền nên được sử dụng nhiều trong xây dựng và đóng thuyền [90]

Ở Việt Nam, chi Calophyllum có 15 loài, thường là đại mộc, có độ cao từ 5-30 m như mù u (C inophyllum), còng tía (C calaba), không (C ceriferum), còng nước (C dongnaiense), còng núi (C dryobalannoides), còng nhiều hoa (C polyanthum), còng nhám (C rugosum), còng trắng (C soulatri), vẩy ốc (C tetrapterum), còng mù u (C thorelii), choi (C touranensis) Một số ít là tiểu mộc như còng da (C membranaceum), còng dây (C pisiferum), còng poilanei (C poilanei) hoặc dạng bụi như rù ri (C balansae) Gỗ đỏ Lá có gân phụ rất mịn, nhiều, khít nhau Hoa trắng hoặc vàng Quả

nhân cứng hình cầu Phân bố từ Quảng Trị đến Phú Quốc [6]

1.2.2 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy chi Calophyllum là nguồn giàu

xanthon, coumarin, acid chromanon, biflavonoid và triterpen [99]

Xanthon

Xanthon tìm thấy từ chi Calophyllum có nhiều kiểu mẫu đa dạng, từ đơn giản đến

phức tạp Xanthon đơn giản là xanthon mang một hay nhiều nhóm hydroxyl hoặc

metoxyl Xanthon monooxygen hóa thường có nhóm thế gắn vào C-2 hoặc C-4 như

2-hydroxyxanthon (1) từ gỗ C zeylanicum Kosterm [50], 2-metoxyxanthon (2) và hydroxyxanthon (3) từ gỗ C austroindicum Kosterm ex P F Stevens [65] Xanthon

4-dioxygen hóa thường gặp nhất là 1,5-dihydroxyxanthon (4) và 1,7-dihydroxyxanthon (5) [26] và xanthon trioxygen hóa thường mang oxygen ở các vị trí 1,3,5- hoặc 1,3,7- như 1,3,5-trihydroxyxanthon (6) và 1,3,7-trihydroxyxanthon (7) [60]

O

OH

R O

OH

R O

O

OR

O O

OH

Xanthon đơn giản mang bốn nhóm thế hydroxyl/metoxyl phổ biến ở vị trí 1,3,5,6-

và 1,3,6,7-, ví dụ như 6-hydroxy-1,3,5-trimetoxyxanthon (8) và

3,6-dihydroxy-1,5-dimetoxyxanthon (9) được Iinuma và cộng sự phát hiện lần đầu tiên từ C austroindicum [65] và 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon (10) từ C fragrans Ridley [83]

O

OMe OMe

OH HO

HO O

OH OMe

HO

Tuy không nhiều như các dạng nêu trên nhưng xanthon đơn giản mang năm nhóm

thế cũng được tìm thấy như 1,3,6-trihydroxy-5,7-dimetoxyxanthon (11) từ C austroindicum [65], 1,3,8-trihydroxy-5,7-dimetoxyxanthon (12) và 1,2,3,4,7- pentahydroxyxanthon (13) từ vỏ cây C caledonicum Vieill [95]

O

OH OMe

OH

OH O

OH OMe

MeO

OH

Mặc dù có cấu trúc phức tạp hơn nhưng xanthon mang nhóm thế alkyl được tìm thấy phổ biến hơn xanthon đơn giản Nhóm alkyl thường gặp nhất là nhóm isoprenyl (C5), thường hiện diện dưới dạng 3-metylbut-2-enyl (còn gọi là isoprenyl, prenyl hay 3,3-dimetylallyl); đôi khi là nhóm 1,1-dimetylallyl hoặc nhóm prenyl bị oxid hóa hay

hydrat hóa Isoguanandin (14) từ C brasiliense Camb [44], metylbutyl)-1,5-dihydroxyxanthon (15) từ C scriblitifolium Henderson & Wyatt-Smith [69] và caloxanthon H (16) từ C austroindicum [65] là ba ví dụ về xanthon prenyl hóa

6-(4-hydroxy-3-có kiểu mẫu dioxygen hóa

14

16 15

O

OH O

OH

O

OH O

OH

O

OH O

OH HO

HO

Xanthon với kiểu mẫu 1,3,5- và 1,3,7- trioxygen hóa; 1,3,5,6- và 1,3,6,7- tetraoxygen hóa mang một hay nhiều đơn vị C5 hiện diện khá phổ biến Năm 1969, hợp

chất 2-(3,3-dimetylallyl)-1,3,5,6-tetrahydroxyxanthon (17) được phân lập từ lõi gỗ C

fragrans [83], sau đó còn được tìm thấy từ lõi gỗ C brasiliense Cambess [11] Hợp

chất 17 mất nhóm -OH ở C-6 tạo thành 1,3,5-trihydroxy-2-(3-metylbut-2-enyl)xanthon

(18) được phát hiện trong C walkeri Wight [26] dihydroxy-7-metoxyxanthon hay calocalabaxanthon (19) lần đầu tiên tìm thấy từ C

2,8-Di-(3-metylbut-2-enyl)-1,3-calaba L var 2,8-Di-(3-metylbut-2-enyl)-1,3-calaba [77] và 1,3,7-trihydroxy-2,8-di-(3-metylbut-2-enyl)xanthon còn

gọi là 6-deoxy-γ-mangostin (20) phân lập từ vỏ rễ C thwaitesii Planch & Triana [31]

O

HO OH

R

O

HO R

17 R= OH, 18 R= H 19 R= OMe, 20 R= OH

Năm 1997, apetalinon A (21) có dây nhánh là một đơn vị C5 nối với oxygen được

tìm thấy từ rễ cây C apetalum Wild [61] Đơn vị C5 có thể bị oxid hóa tạo acid như

trong acid teysmannic (22) được phân lập từ gỗ C teysmannii var inophylloide [74]

Kiểu mẫu 1,2,3,5- tetraoxygen hóa cũng được tìm thấy như trong caledonixanthon D

(23) từ vỏ thân cây C caledonicum [94]

O O

OH

OH OMe OH

21 22 23

Năm 2002 caledonixanthon G (24) được phân lập từ C caledonicum [95] và brasixanthon G (25) được phát hiện từ vỏ C brasiliensis Camb [67] Hai năm sau,

1,3,5,6-tetrahydroxy-2-(3-hydroxy-3-metylbutyl)xanthon (26) là ví dụ về xanthon có

nhóm prenyl bị hydrat hóa được tìm thấy từ lõi gỗ C brasiliense [11] Năm 2008, hợp

chất mới pinetoxanthon (27) được phân lập từ vỏ C pinetorum Bisse [12]

O O

OH OH

HO

OH

24 25 R= prenyl 26

Trong quá trình sinh tổng hợp, nhóm prenyl có thể đóng vòng với nhóm hydroxyl

gắn ở vị trí orto tạo vòng pyran hoặc furan Chính điều đó đã tạo nên hoạt tính lý thú

cho xanthon Các xanthon có chứa vòng pyran hiện diện khá phổ biến trong chi này

Năm 1974, Dahanayake và cộng sự phát hiện hợp chất mới thwaitesixanthon (28) từ vỏ

C thwaitesii và calabaxanthon (29) từ C walkeri Wight [26]

OH OH

Năm 1997, một số xanthon mới đã được báo cáo như caloxanthon I (30) tìm thấy

trong vỏ cây C apetalum [60], dombakinaxanthon (31) phát hiện từ vỏ rễ C moonii

Planch and Triana [32] Năm năm sau, brasixanthon D (32) đã được phân lập từ vỏ C

O HO

30 31 32

Năm 2005, một pyranoxanthon mới được phát hiện từ rễ C blancoi là

blancoxanthon (33) Năm 2008, Chen và cộng sự tìm thấy membraxanthon A (34) từ

C membranaceum Gaertn et Champ. [21] Vòng pyran có thể mang nhóm hydroxyl

như trong caledonixanthon L (35) phân lập từ C caledonicum [95]

O O

OH

OH HO

33 34 35

Xanthon mang vòng furan được tìm thấy như caloxanthon F (36) [65], caledonixanthon C (37) [94] và một hợp chất mới khác là caloxanthon P (38) được

phân lập từ cành non C inophyllum Linn [27]

O O

OH O

HO

O O O

36 37 38

Nhóm geranyl cũng có thể đóng vòng với nhóm hydroxyl ở vị trí orto như trong hợp chất calozeyloxanthon (39) tìm thấy từ vỏ cây C zeylanicum [50] và apetalinon B (40) từ rễ cây C apetalum [61]

Một vài xanthonolignoid cũng được phát hiện trong chi Calophyllum, ví dụ như

calophyllumin (41) và 6-hydroxycadensin F (42) từ rễ C inophyllum Từ gỗ C austroindicum, calophyllumin B (43) cũng đã được phân lập [63]

O O O

OH MeO

R 2

HO OMe HO

HO

H H

40 O

Chi Calophyllum còn sinh tổng hợp nên coumarin, là điểm thu hút sự quan tâm rất

lớn của các nhà khoa học do khả năng kháng HIV và kháng ung thư Có thể chia coumarin ra làm ba dạng cơ bản như sau

Dạng thứ nhất: tại C-8 mang nhóm thế prenyl, benzoyl hay 2-metylbut-2-en-1-on

và dạng hydrogen hóa, hydrat hóa của nhóm này Ví dụ như calophyllolid (44) có trong

mầm hạt và lá cây C inophyllum [40] Từ lá cây C austroindicum, Dharmaratne và

cộng sự tìm thấy ba hợp chất mới trong đó có oblongulid (45) thuộc dạng này [30], nhưng tới năm 1994 Palmer và Josephs xác định lại cấu trúc đúng của oblongulid là 46

bằng phương pháp tổng hợp, hai nhóm metyl trên nhóm thế gắn vào C-8 nằm ở vị trí

cis với nhau [103]

O O

O

O MeO

O

46 45

44

Năm 1994 từ nhựa mủ C teysmannii, một hợp chất mới được phân lập là calanon

(47) [52] Bốn năm sau, Cao và cộng sự đã tìm thấy

O

O HO

HO

47 48 49

Năm 2001, mammea A/BA cyclo F (50) được tìm thấy từ C dispar P F Stevens [49] Hai năm sau, brasimarin B (51) được phân lập từ vỏ cây C brasiliense [68] Năm

2004, hợp chất mới isorecedensolid (52) cùng với recedensolid (53) được Shen và cộng

sự tìm thấy trong hạt C blancoi N K B Robson [118]

O

HO O

HO H

O H

O O

Dạng thứ hai: vòng 2,3-dimetylchroman-4-on hoặc 4-ol súc hợp với khung

coumarin tại C-7 và C-8 Năm 1964, Stout và Stevens phân lập được costatolid (54)

được từ nhựa cây C costatum Bail [124] Năm 1992, calanolid A (55) và calanolid B (56) được Kashman cùng cộng sự tìm thấy từ trái và cành non C

(+)-lanigerum Miq var austrocoriaceum (T.C Whitmore) P F Stevens [73]

  Năm 1993 từ lá và cành non C inophyllum, Patil và cộng sự đã phân lập được

inophyllum B (57) và P (58) [104] Một năm sau, soulattrolid (59) được phát hiện từ

nhựa mủ C teysmannii [52] Năm 1996, một hợp chất mới được tìm thấy từ lá và cành

non C teysmannii Miq var inophylloide (King.) P F Stevens là calanolid F (60) [89]

O O

Dạng thứ ba là coumarin có nhóm thế prenyl ở C-8 đóng vòng với nhóm -OH ở C-7

tạo nên vòng 2,2-dimetylchroman hoặc vòng furan như pseudocordatolid C (66) phân

lập từ C lanigerum [89], isocalanon (67) tìm thấy từ vỏ C teysmannii var inophylloide

66

O

OH O

67

OH O

O

OH

68

Năm 2001, Guilet và cộng sự phân lập được disparfuran B (69), dispaacetylfuran A (70), mammea A/AA deshydrocyclo F (71) và mamea A/AA metoxycyclo F (72) từ vỏ

C dispar [49]

71

O O

Ph

O

OH O

70

O O

Ph

O

OH O

O 69

O O

Ph

O

OH O

OH OCH 3

Acid chromanon

Chi Calophyllum sinh tổng hợp nên các acid chromanon, là nhóm hợp chất đặc

trưng của chi này Năm 1971 bốn acid là acid apetalic (73), acid isoapetalic (74), acid dihydro-isoapetalic (75) và acid chapelieric (76) cũng như các ester metyl tương ứng là

73a, 74a, 75a và 76a đã được phân lập từ C chapelieri Drake Trong đó 74a, 75a, 76a

là các hợp chất mới [48]

O O

COOR

O O

COOR

O O

COOR

O O

OH

COOR Ph

O

R= H 73 74 75 76

R= Me 73a 74a 75a 76a

Năm 1992, Goh và cộng sự là những người đầu tiên tìm thấy hợp chất

(+)-(2R,3S)-

2,3-dimetyl-5-hydroxy-6-(3-metylbut-2-enyl)-7-metoxy-8-(2-carboxyl-1-phenyletyl)-2,3-dihydrobenzopyran (77) từ lõi gỗ C inophylloide King [41] Một số acid khác như chất đồng đẳng của acid isoapetalic (78), acid blancoic (79) và acid (2S,3R)-apetalic (80) được tìm thấy từ dầu hạt C brasiliense [106]; acid isochapelieric (81) từ lá C calaba L [51] và acid isocordato-oblongic (82) từ vỏ C cordato-oblongum Thw [33]

O

O OH

MeO HOOC

78 R= n-butyl, 79 R= n-pentyl

O O

OH

COOH

O

O O

HOOC O

O

Sáu acid mới được phát hiện từ C brasiliense là acid brasiliensophyllic A (83), acid

isobrasiliensophyllic A (84), acid brasiliensophyllic B (85), acid isobrasiliensophyllic

B (86), acid brasiliensophyllic C (87) và acid isobrasiliensophyllic C (88) [24]

R1=H, R2= CH3 83 R1=H, R2= CH3 85 R1=H, R2= CH3 87

R1= CH3, R2=H 84 R1= CH3, R2=H 86 R1= CH3, R2=H 88

O OH

R 1

R 2

O OH

O OH

HOOC O

O

R 1

R 2

Biflavonoid

Chi Calophyllum còn sinh tổng hợp nên các biflavonoid thường gặp như

amentoflavon (89) từ lá C calaba [51] Pyranoamentoflavon (90) từ lõi gỗ C inophylloide [41] và 2,3-dihydroamentoflavon (91) cùng với bốn chất mới là

pyranoamentoflavon 7,4′′′-dimetyl eter (92), pyranoamentoflavon 7,4′-dimetyl eter

(93), 6″-(3-metyl-2-butenyl)amentoflavon (94) và

6″-(2-hydroxy-3-metyl-3-butenyl)amentoflavon (95) tìm thấy trong cây C venulosum Zoll [17]

O

OH HO

O OH

OH

O

O

OH HO

O OH

OH

O

O

OH HO

HO

O

OH

O OH

HO R

Chi Calophyllum cũng sinh tổng hợp nên triterpen, ví dụ như canophyllal (96),

canophyllol (97) và acid canophyllic (98) được phát hiện đầu tiên vào năm 1967 từ lá

cây C inophyllum [45] Năm sau, apetalacton (99) lần đầu tiên được công bố từ lá C

apetalum và C tomemtosum T Anders [46]

96 R= CHO

Năm 1976, friedelan-3β-ol (100) được Kumar và cộng sự phát hiện từ gỗ C

inophyllum [76] Tám năm sau, friedelan-3 β,28-diol (101) được tìm thấy từ vỏ C calaba [51] và D:A-friedo-oleanan-3-on (102) từ lá C lankaensis [29]

HO

H H H

100

Một trisnor-triterpen dị vòng mới được phân lập từ lá C gracilipes là gracilipen

(103) [16] Acid betulinic (104) cũng được tìm thấy ở loài này và một số loài khác như

C blancoi, C teysmannii và C tomemtosum [42, 72]

O

H H

HO

COOH

Năm 2005 ba triterpen mới có khung friedelan là acid 3,4-secofriedelan-3,28-dioic

(105), acid 27-hydroxyacetat canophyllic (106) và acid 3-oxo-27-hydroxyacetat

friedelan-28-oic (107) đã được phân lập từ lá C inophyllum [80]

H O O

Acylphloroglucinol

Năm 2005, Taher và cộng sự phát hiện sự hiện diện của hai acylphloroglucinol từ

một loài thuộc chi Calophyllum là C enervosum Henderson and Wyatt-Smith gồm hợp

chất mới enervosanon (108) và chất đã biết cambogin (109) [125] Tuy nhiên, một năm sau tác giả đề nghị lại hóa học lập thể của 108 và cho rằng cấu trúc đúng của hợp chất này là 110 [126] Hợp chất 109 còn được Sahu và cộng sự phân lập từ cây bứa cọng

Garcinia pedunculata Roxb [113]

O

O

O H H

O O

OH HO O

Garcinia Chẳng hạn như guttiferon A (111), B (112) và E (113) được phân lập từ một

số loài thuộc chi Symphonia, Garcinia và Clusia [53] Guttiferon F (114), epimer ở

C-30 của 113, là một benzophenon polyisoprenyl hóa lần đầu tiên được phát hiện từ một

loài thuộc chi Allanblackia là A stuhlmannii (Engl.) Engl [39]

O

O O

OH

HO

OH

OH HO

O O

111 112  

113 114

O

O O

OH HO

OH O

O O

OH HO

16 3

 

Quá trình sinh tổng hợp benzophenon polyisoprenyl hĩa được Cuesta-Rubio và cộng sự đề nghị như trong Hình 1.1 Theo Cuesta-Rubio và cộng sự, hệ vịng bicyclo[3.3.1]nonan-2,4,9-trion trong nhĩm hợp chất này được tạo thành từ sự

isoprenyl hĩa benzoylphloroglucinol (117) để cho ra grandon (118) Hợp chất này sau

đĩ phản ứng với 3,3-dimetylallyl pyrophosphat (DMAPP) sinh ra cation 119 Tùy

thuộc vào sự đĩng vịng của carbocation này với nhĩm benzoyl hay nhĩm isoprenyl mà

cĩ sự tạo thành dạng A hay dạng B [109]

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp benzophenon polyisoprenyl hóa

Các khảo sát hĩa học về chi Calophyllum ở Việt Nam

Ở Khoa Hĩa, Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, nhĩm nghiên cứu của PGS Phạm Đình Hùng và PGS Nguyễn Diệu Liên Hoa đã khảo sát thành phần hố

học của bốn lồi thuộc chi Calophyllum là cịng tía (C saigonense Pierre hay C calaba 

L var bracteatum (Wight) Stevens), mù u (C inophyllum), cịng nước (C

dongnaiense Pierre) và cịng núi (C dryobalanoides Pierre) và đã phân lập được 34

hợp chất [1, 4, 5, 8, 9]

Năm 2008, Nguyễn Thị Minh Hằng và cộng sự ở Viện Hóa học, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam đã phân lập được một coumarin mới là acid (3E)-isocalophyllic

(120) từ lá cây mù u (C inophyllum), hai furanocoumarin mới là mammea A/AA hydroxycyclo F (121) và calobalansin (122) từ lá và cành cây rù ri (C balansae)

Ngoài ra, nhóm này còn tìm thấy một xanthon mới là

1,7-dihydroxy-2,3,8-trimetoxyxanthon (123) từ lá và cành cây còng sáp (C ceriferum) và một triterpen mới

là 5β,6β-epoxyalnusan-3β-ol (124) từ vỏ cây này [3]

122

120 121

O O

OH O

O

O O

OH O

O OH

OH O

O

OH O

 

1.2.3 Hoạt tính sinh học

Các hợp chất phân lập từ chi Calophyllum có hoạt tính sinh học đa dạng như kìm

hãm HIV-1, kháng ung thư, kháng khối u, bảo vệ tế bào và kháng vi khuẩn [99]

Xanthon 17 có hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan [11] Xanthon 17 và trihydroxy-2-(3-metylbut-2-enyl)xanthon (18) đều có hoạt tính kháng loài nấm nâu gây

1,3,5-mục gỗ Postia placenta [110] 6-Deoxy-γ-mangostin (20) có khả năng kháng trùng sốt

rét Plasmodium falciparum [56] Brasixanthon D (32) kìm hãm sự hoạt hóa của

EBV-EA trong tế bào Raji [67] Blancoxanthon (33) kháng virus corona hữu hiệu nên có

triển vọng sử dụng để trị bệnh nhiễm virus corona [117]

Nhiều coumarin có hoạt tính kháng khối u và kháng HIV Một số chất tiêu biểu như

calanon (47) có hoạt tính gây độc trung bình trên bốn dòng tế bào ung thư P388, WEHI164, THP-1, MOLT4 [19] Mammea A/BA cyclo F (50) có độc tính kháng dòng

tế bào ung thư biểu bì ở miệng KB [49] Brasimarin B (51) có thể là tác nhân hóa học ngăn ngừa ung thư hữu hiệu [68] Isorecedensolid (52) cùng với recedensolid (53) có

hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư KB và ung thư cổ tử cung Hela [118] Brasimarin

C (61) cũng có khả năng là tác nhân ngăn ngừa ung thư hữu hiệu [68]

(+)-Calanolid A (55) và (+)-calanolid B (56) từ trái và cành non C lanigerum có tác

dụng bảo vệ tế bào một cách hoàn toàn kháng lại sự tái tạo HIV-1 và tế bào bị bệnh

nhưng không có hoạt tính kháng HIV-2 55 không những có hoạt tính kháng dòng

AZT-resistant G-9106 của HIV-1 mà còn kháng dòng pyridinon-AZT-resistant A-17; tạo nên sự

quan tâm đặc biệt vì virus A-17 có sức đề kháng mạnh hơn HIV-1 và các chất ức chế

enzym RT không-nucleosid đã biết như TIBO; BI-RG-587; L693, 593 [73] Vì vậy 55

được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ thử nghiệm lâm sàng để đưa vào sử dụng làm thuốc Do hàm lượng chất này trong cây ít (<1 mg/g cao trích) nên các nhà khoa học đi

tìm nguồn thay thế và ứng viên là costatolid (54), đối phân của calanolid B 54 có hiệu lực kháng HIV trung gian giữa calanolid A (55) và B (56) Mặc khác, hàm lượng của

54 trong hạt C cerasiferum cao hơn (>7 mg/g cao trích) Do đó 54 có thể thay thế 55

trong việc phát triển thuốc kháng HIV [38, 123] Ngoài ra, inophyllum B (57) và P (58) [104] và soulattrolid (59) [58] cũng có hoạt tính kháng HIV

Một số hợp chất thuộc nhóm acid chromanon như acid brasiliensophyllic A (83), acid isobrasiliensophyllic A (84), acid brasiliensophyllic B (85), acid isobrasiliensophyllic B (86), acid brasiliensophyllic C (87) và acid

isobrasiliensophyllic C (88) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus và Staphylococcus epidermidis từ trung bình đến mạnh Trong đó 83 và 84 mạnh hơn chất chuẩn chloramphenicol (trong trường hợp vi khuẩn B cereus) còn 87

và 88 có hoạt tính yếu hơn [24] Một biflavonoid là amentoflavon (89) có khả năng

kháng nhiều virus gây bệnh như Avian myeloblastosis (AMV)-RT, Rous-associated

virus-2 (RAV-2)-RT và Moloney murine leukemia virus (MMLV)-RT [128] Triterpen

acid betulinic (104) có khả năng kháng khối u ác tính hữu hiệu [42] và kháng lại ba

dòng tế bào ung thư người là MCF-7, H-460 và SF-268 [100]

Các dẫn xuất phloroglucinol có cấu trúc phức tạp và hoạt tính sinh học lý thú nên có nhiều hứa hẹn cho việc phát triển làm thuốc kháng HIV, kháng ung thư và kháng oxy

hóa Ví dụ như enervosanon (108) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với cả vi khuẩn

Gram-(+) (Bacillus subtilis và Escherecia coli) và Gram-(-) (Pseudomonas aeruginosa

và Staphylococcus aureus), kháng dòng tế bào ung thư vú MCF7 với IC50 1.07 µM

[125, 126] Cambogin (109) có hoạt tính kháng khuẩn (nhưng không có hoạt tính đối

với khuẩn Staphylococcus   aureus), kháng nấm [15, 125] và kìm hãm sự phát triển của

tế bào gây bệnh bạch cầu ở người [88] Guttiferon A (111), B (112), E (113) và guttiferon F (114) đều có hoạt tính kháng HIV [53, 39]

uế Lá được dùng làm thuốc xông chữa đau mắt, đau nửa đầu và chóng mặt Trái chín

có chất độc được sử dụng làm bã chuột Dầu của hạt mù u dùng trị thấp khớp, ghẻ ngứa

và nấm ngoài da [34] Rễ cây còng trắng (C drybalanoides) dùng làm thuốc tẩy xổ Rễ

và lá cây còng da (C membranaceum) được dùng trị thấp khớp, đau nhức xương, viêm

gan vàng da, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, vết thương chảy máu [2, 7] Vỏ

cây C brasiliense dùng trị thấp khớp, chữa chứng giãn tĩnh mạch, bệnh trĩ và những

chỗ loét; lá được dùng chữa viêm Loài này có rất nhiều ở Brazil và đã được chứng

minh tiềm năng chữa bệnh [99] Vỏ cây C membranaceum được sử dụng trong y học

cổ truyền Trung Quốc trị thấp khớp, viêm khớp, đau lưng và chữa vết thương [70]

1.3 Giới thiệu về cây còng mù u

Gỗ tốt, phân bố từ Nha Trang đến Phú Quốc [6]

Hình 1.2 Hình cây, trái, hoa và lá còng mù u (Calophyllum thorelii Pierre)

1.3.2 Các nghiên cứu hóa học trước đây

Thành phần hóa học của cây còng mù u chưa được nghiên cứu trên thế giới

Ở Việt Nam, thành phần hóa học cao eter dầu hỏa của vỏ cây thu hái ở Lâm trường

Sông Kôn đã được khảo sát Sáu hợp chất là thorelion (125), 7-epi-clusianon (126),

caloxanthon L (127), δ-tocotrienol (128), friedelin (129) và stigmasterol (130) đã được

phân lập Trong đó thorelion thu được dưới dạng hai dẫn xuất O-metyl hóa là

1,13,14-tri-O-metylthorelion (125a) và 3,13,14-1,13,14-tri-O-metylthorelion (125b) [10]

125 126

O

O O

OH

OH HO

O

O O

OH

 

125a 125b O

O O

OMe

OMe MeO

O

O MeO

O

OMe MeO

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nguyên liệu

Vỏ cây còng mù u (C thorelii Pierre) được thu hái lần thứ nhất vào tháng 5/2003 tại

Lâm trường Sông Kôn, tỉnh Bình Định và được giảng viên chính Nguyễn Thiện Tịch,

Bộ môn Sinh thái và Sinh học Tiến hóa, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh định danh [10] Tháng 7/2006, vỏ cây được thu hái lần thứ hai trên cùng một cây, đồng thời trái xanh của cây cũng được thu hái trên cây này

2.2 Thiết bị và hóa chất

Năng lực triền quang đo bằng triền quang kế A Krüss Optronic Điểm nóng chảy

đo bằng máy đo điểm nóng chảy Wagner & Munz Polytherm A, nhiệt kế không điều chỉnh Phổ UV đo bằng quang phổ kế UV-Vis Agilent 8453 Diode Array, dung môi EtOH Phổ IR đo bằng quang phổ kế hồng ngoại Bruker Tensor 37, ép trong KBr Khối phổ phân giải cao đo bằng máy Bruker micrOTOF-QII (HR-ESIMS, 80 eV) hay Finnigan MAT SSQ 710 A (HR-EIMS, 70 eV) Phổ NMR đo bằng máy Bruker Avance III 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)] với TMS là chất chuẩn nội (δ= 0,00

ppm) và cloroform-d1, aceton-d6 hoặc metanol-d4 làm dung môi Sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC) thực hiện trên máy Shimadzu HPLC LC-20A, đầu dò UV-Vis

Sắc ký cột được thực hiện trên silica gel 60 (40-63 μm, Merck), RP18 (40-63 μm, Merck) hay Diol silica (40-63 µm, Merck) SK lọc gel được thực hiện trên Sephadex LH-20 (GE Healthcare) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel 60 F254 (250 µm, Merck), RP18 F254s (250 µm, Merck) hay Diol F254s (Merck)

Tất cả các dung môi đều được chưng cất lại trước khi sử dụng Eter dầu hỏa có nhiệt độ sôi 45-90°C

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) của Sigma, acid ascorbic của Prolabo Sulforhodamin B (SRB), môi trường EMEM (10% fetal bovine serum) và camptothecin của Sigma

Độ hấp thu trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa với thuốc thử DPPH đo ở

bước sóng 517 nm bằng quang phổ kế UV-Vis Agilent 8453 Diode Array

Ba dòng tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi H460 nhận từ Division of Cancer Treatment and Diagnosis (NCI, Maryland, USA) Thử nghiệm sàng lọc độc tính tế bào được thực hiện trên đĩa Costar 96 giếng Mật

NCI-độ quang đo ở bước sóng 492 và 620 nm, sử dụng máy đọc đĩa Synergy HT microplate reader (Bio-Tek)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất và phân lập chất

Phơi khô mẫu cây, xay nhỏ, chiết xuất lần lượt với eter dầu hỏa rồi etyl acetat bằng

bộ chiết Soxhlet Thu hồi dung môi bằng máy cô quay thu được cao eter dầu hoả và cao etyl acetat tương ứng

Việc phân lập chất được thực hiện bằng SKC kết hợp với SKLM Trong một số trường hợp, HPLC được sử dụng SKC được thực hiện trên silica gel, RP18 hay Diol silica SK lọc gel được thực hiện trên Sephadex LH-20 với hệ dung ly CHCl3-MeOH 1:1 Phân đoạn nào cho vết rõ trên bản mỏng mới được khảo sát tiếp Các vết trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại, cho vào bình đựng iod hay xịt với dung dịch FeCl3 trong EtOH (để phát hiện hợp chất phenol)

2.3.2 Xác định cấu trúc

Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng phương pháp phổ (1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY và NOESY kết hợp với UV, IR và HR-MS) cũng như so sánh phổ có được với tài liệu tham khảo

2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào sử dụng phương pháp SRB [122]

Nguyên tắc