Y HỌC THỰC HÀNH (874) - SỐ 6/2013 35 Bảng 6: Giá trị của test nhanh trong chẩn đoán viêm cổ tử cung do C.trachomatis: KẾT LUẬN So với phương pháp PCR, giá trị của xét nghiệm nhanh miễn dịch men có: Độ nhậy: 64,5% Độ đặc hiệu: 88,6% Giá trị tiên đoán dương tính: 80%. Giá trị tiên đoán âm tính: 78%. SUMMARY Objectives: Determine the specifisity and sensitivity of one step C.chlamydia. PCR in the C.chlamydia diagnostic. Study Design: Randomized clinical control trial Research Subjects: 150 womans ages 15-49. Results: True negative: 78, false negative: 22, true positive: 40, false positive: 10. Sensitivity: 40/62 = 64.5%, speccifisity: 78/88 = 88.6% Positive predictive value: 40/50 = 80%, negative predictive value: 78/100 = 78% TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Hồng Cẩm (2002. "Nghiên cứu tỷ lệ viêm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis và một số yếu tố kết hợp ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ tại huyện Hóc Môn", Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh: trang 77-99. 2. Phạm Văn Đức (2007). "Giá trị của xét nghiệm nhanh trong chẩn đoán viêm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis ở phụ nữ nạo phá thai tại bệnh viện Từ Dũ” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, tập 1(12): trang 180-186. 3. Trần Thị Lợi (2000). "Sơ bộ khảo sát tình hình nhiễm Chlamydia trachomatis trong viêm sinh dục" Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh. Tập 4(1): trang 14-18. 4. Đặng Chi Mai (2003). "Chlamydiae." Vi khuẩn học. Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh: trang 176-179. 5. Nguyễn Năng Hải (2004). “Nghiên cứu tình trạng viêm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis ở thai phụ 28-37 tuần” Luận văn chuyên khoa cấp II. Đại học Y Hà Nội: trang 30-50. 6. Clavel C et al. Br J Cancer (2004); 90:1803-1808. 7. Ho GYF, Bierman R, Beardsley NP, et al: Natural history of cervicovaginal papilomavirus infection as rick factor forpersistent cervical dysplasia. Journal of the national cancer institus 87(18): 1365-1371 (september 1995). 8. Sherris J, Herdman Cand malloy C (2000). HPV DNA testing: Technical and programmatic issues for cervical cancer prevention in low-resource settings. Preparation of this was supported by the alliance for cervical cancer prevention. BIÓU HIÖN KH¸NG THÓ scFv KH¸NG CD20 Ph¹m Thu Thïy, TrÇn Minh §¹o - Bệnh viện 19.8, Lª Quang HuÊn - Viện Công Nghệ Sinh Học, VAST TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu tạo ra lượng lớn kháng thể scFv kháng CD20 tinh sạch, có hoạt tính và có thể sử dụng cho các nghiên cứu sâu hơn như chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư máu có xuất hiện chỉ thị phân tử CD20. Phương pháp nghiên cứu: Gen mã hóa kháng thể kháng CD20 được biểu hiện trong tế bào E.coli (BL21). Protein tái tổ hợp đã biểu hiện được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA (Invitrogen) theo hướng dẫn của hãng sản xuất và được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli (1970). Hoạt tính của kháng thể scFv kháng CD20 được xác định bằng kĩ thuật Western blot. Kết quả: Kháng thể scFv kháng CD20 biểu hiện thành công ở E. coli BL21 và tinh sạch được trên cột sắc ký ái lực Ni-NTA. Xác định được hoạt tính liên kết của kháng thể scFv kháng CD20 với kháng thể cộng hợp đuôi 6xHis chuẩn. Từ khóa: CD20, kháng thể kháng CD20, western blot, imidazol. SUMMARY EXPRESSION OF ANTI-CD20 scFv ANTIBODY Objective: To produce a large number of pure and active scFv antibodies specific to CD20 which can be used for further studies such as diagnosis and treatment of blood cancer based on CD20 maker. Methods: The gene coding for anti-CD20 antibody was expressed in E.coli (BL21). Expressed recombinant protein was purified by affinity chromatography using Ni-NTA column (Invitrogen) following the manufacturer’s instruction and checked by polyacrylamide gel electrophoresis (Laemmli 1970) [4]. The activation of scFv antibody was determined by Western blot. Results: anti-CD20 scFv antibody was successfully expressed and purified by affinity chromatography. Determine the active alignment of the anti-CD20 scFv antibody with antibody conjugate 6 His tag standard. Keywords: CD20, anti-CD20 antibody, western blot. ĐẶT VẤN ĐỀ U lympho không Hodgkin (NHL) là ung thư phổ biến thứ 7 ở nước Mĩ và các nước khác trên thế giới [1]. CD20 là chỉ thị phân tử biểu hiện chủ yếu trên tế bào B và xuất hiện khoảng 85 – 90% ở bệnh nhân NHL [5], [2], [6]. CD20 là phân tử đích tiềm năng trong liệu pháp điều trị ung thư bằng kháng thể đơn dòng. Trên thế giới đã có một số kháng thể đơn dòng kháng CD20 được cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn dùng trong điều trị ung thư máu có xuất hiện chỉ thị CD20 và các bệnh tự miễn [6]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về chỉ thị phân tử CD20 vẫn còn rất ít ở Việt Nam. Do đó, việc biểu hiện, tinh sạch kháng thể scFv Y HỌC THỰC HÀNH (874) - SỐ 6/2013 36 kháng CD20 và xác định hoạt tính đặc hiệu của kháng thể này với kháng thể cộng hợp Ni-NTA có gắn đuôi 6xHis bằng kĩ thuật Western blot đã được đặt ra làm nhiệm vụ của nghiên cứu này. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Plasmid tái tổ hợp pET-22b(+) gắn gen mã hóa kháng thể scFv kháng CD20 (plasmid tái tổ hợp pET- 22b(+)/antiCD20) đã được biến nạp vào chủng biểu hiện E.coli BL21(DE3) do chúng tôi thiết kế. Các hóa chất: LB lỏng, LB đặc, IPTG, Polyacrylamide; Glycerol; Comassie Blue; APS; SDS, (hãng sigma). Các hạt Ni 2+ , các đệm sodium phosphate. Phương pháp Biểu hiện gen mã hóa kháng thể scFv kháng CD20 Một khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp được nuôi trong môi trường LB lỏng chứa kháng sinh Ampicillin, nuôi lắc 200 v/p, 37 o C, qua đêm. Cấy chuyển sang môi trường LB lỏng chứa kháng sinh với tỷ lệ chủng là 2%. Nuôi lắc 200 v/p, 37 o C đến khi OD 600 đạt nồng độ thích hợp. Thu mẫu trước cảm ứng, sau đó bổ sung vào dịch nuôi cấy chất cảm ứng IPTG với nồng độ thích hợpvà tiếp tục nuôi lắc. Thu mẫu sau cảm ứng và điện di kiểm tra kết quả biểu hiện. Điện di protein trên gel polyacrylamide: Protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli (1970) [4]. Tinh sạch protein tái tổ hợp: Cột sắc kí ái lực Ni- NTA (Invitrogen) được dùng để tinh sạch protein tái tổ hợp có chứa đuôi 6-histidine. Quy trình tinh sạch được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kĩ thuật Western blot: Kháng thể scFv kháng CD20 có chứa đuôi 6xHis đã tinh sạch được xác định hoạt tính dựa trên liên kết đặc hiệu của chúng với kháng thể cộng hợp. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Biểu hiện kháng thể scFv kháng CD20 Gen mã hóa kháng thể scFv kháng CD20 được biểu hiện ở E.coli BL21 (DE3) theo phương pháp như mô tả ở trên. Kháng thể scFv (protein tái tổ hợp) được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide. Khi so sánh các mẫu trước và sau cảm ứng với IPTG, chúng tôi nhận thấy ở mẫu sau cảm ứng xuất hiện 1 băng protein mới, khác biệt, có trọng lượng phân tử ~30 kDa (Hình 1). Protein này có kích thước tương ứng với kháng thể scFv kháng CD20 theo tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định sơ bộ đã biểu hiện thành công kháng thể kháng CD20. Hình 1: Biểu hiện gen mã hóa kháng thể scFv kháng CD20 M: thang protein chuẩn, 2: protein trước cảm ứng IPTG; 1: protein sau cảm ứng IPTG Tinh sạch kháng thể tái tổ hợp kháng CD20 Đuôi 6xHistag là một trong các đuôi phổ biến nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thăm dò và tinh sạch protein tái tổ hợp. Trong quá trình tinh sạch trên cột Ni 2+ các protein không có đuôi His vẫn có thể được gắn lên cột, do đó khi thu protein có thể lẫn protein đích với các protein không cần thiết. Thông thường, các protein tạp có ái lực liên kết yếu hơn protein tái tổ hợp đích. Có một số cách để loại trừ protein tạp, thứ nhất có thể tính toán lượng hạt Ni 2+ vừa đủ để gắn với lượng protein đích, thứ hai imidazol có thể sử dụng như một tác nhân cạnh tranh [3]. Ở nghiên cứu này, để loại bỏ những protein không quan tâm và thu được lượng protein tinh sạch cao nhất chúng tôi đã sử dụng các nồng độ imidazole khác nhau (50mM, 100mM, 250mM, 350mM, 500mM) (Hình 2). 1 2 3 4 M 5 Hình 2. Kết quả tinh sạch kháng thể scFv kháng CD20 ở các nồng độ imidazol khác nhau M: Maker protein 1-5: 50 mM, 100 mM, 250 mM, 350 mM và 500 mM imidazole theo thứ tự Kết quả điện di trên hình 2 cho thấy, kháng thể tái tổ hợp không thu được khi tinh sạch ở các nồng độ imidazol thấp hơn 500 mM. Tất cả các protein không đặc hiệu được rửa trôi khỏi cột với các nồng độ imidazol tăng dần từ 50 mM đến 300 mM. Vì vậy, nồng độ imidazol 500 mM đã được lựa chọn để thu kháng thể scFv kháng CD20. Xác định hoạt tính của kháng thể scFv kháng CD20 Western blot là kĩ thuật miễn dịch được sử dụng rộng rãi để thăm dò các protein đặc hiệu. Kĩ thuật này sử dụng điện di để tách các protein bởi chiều dài chuỗi polypeptit hay bởi cấu trúc 3-D của protein. Các protein này thường được chuyển lên màng (nitrocellulose hoặc PVDF), tại đó chúng được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu với protein đích [7]. Trong y học, Western blot được ứng dụng để thăm dò kháng thể kháng HIV, HBV Ở nghiên cứu này, Western blot được sử dụng để kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp sản xuất được với kháng thể cộng hợp gắn đặc hiệu với đuôi 6xHistag ~ 30 kDa Y HC THC HNH (874) - S 6/2013 37 ca protein ớch. Kt qu c th hin hỡnh 3. Hỡnh 3. Hỡnh nh Western blot ca khỏng th scFv khỏng CD20 M: thang protein chun; 1-2: khỏng th scFv khỏng CD20 Kt qu trờn hỡnh 3 xut hin bng kớch thc xp x 30 kDa, iu ny chng t protein tỏi t hp sn xut c phn ng c hiu vi khỏng th cng hp uụi Histag (Ni-NTA conjugate). KT LUN Khỏng th scFv khỏng CD20 biu hin thnh cụng E. coli BL21. Khỏng th scFv tinh sch c trờn ct sc kớ ỏc lc vi Ni 2+ nng imidaziol 500 mM. Khỏng th scFv khỏng CD20 cú hot tớnh v hot tớnh ca cỏc protein ny ó c xỏc nh bng k thut Western blot vi khỏng th cng hp khỏng uụi 6-His. TI LIU THAM KHO 1. Fang H., Miao Q.F., Zhang S.H., Cheng X., Xiong D.S., and Zhen Y.S. (2011), Antitumor effects of an engineeredand energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin, Science China, Life Sciences, 54(3), pp. 255262. 2. Fisher R.I. (2003), Overview of non-Hodgkin's lymphoma: biology, staging, and treatment, Seminars in Oncology, 30(2-4), pp. 3-9. 3. Hửlscher K., Richter-Roth M. and Felden de Neumann B., (2006), Addition of imidazole during binding improves purity of histidine-tagged proteins. GE Healthcare, 28-4067-41 AA. 4. Laemmli U. K. (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, pp. 680-685. 5. Li B., Shi S., Qian W., Zhao L., Zhang D., Hou S., Zheng L., Dai J., Zhao J., Wang H., Guo Y. (2008), Development of novel tetravalent anti-CD20 antibodies with potent antitumor activity, Cancer research, 68(7), pp. 2400-2408. 6. Lim S.H., Beers S.A., French R.R., Johnson P.W., Glennie M.J., Cragg M.S. (2010), Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives, Haematologica, 95(1), pp. 135-143. 7. Western Blot http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/ TIếN TRIểN BệNH RĂNG MIệNG CủA HọC SINH TIểU HọC, TRUNG HọC CƠ Sở, TRUNG HọC PHổ THÔNG Hà NộI SAU KHI SáT NHậP Đào Thị Dung, Phạm Lê Hng, Phùng Thị Thu Hà Bnh vin Việt Nam Cuba. TểM TT iu tra t l bnh rng ming cho 16.024 hc sinh 6 n 17 tui ti 29 qun huyn H Ni sau sỏt nhp cho thy: - T l sõu rng vnh vin cao nht ca hc sinh trung hc c s, thp nht l hc sinh tiu hc. - T l viờm li ca HS tng dn theo cp hc: HS tiu hc l 0,46%, HS THCS l 7,64%, HS trung hc ph thụng l 16,04%. - Ch s sõu mt trỏm rng vnh vin ca HS tng dn theo cp hc v theo tui: 6 tui l 0,01; 9 tui l 0,12; 12 tui l 0,4; 15 tui l 0,34; 17 tui l 1,5 - Ch s rng sõu cao, nhng s rng c hn thp cỏc la tui - T l sõu rng v viờm li ca hc sinh khu vc H ni c thp hn H tõy c. - T l sõu rng v viờm li ca hc sinh khu vc ni thnh thp hn ngoi thnh. T khúa: bnh rng ming, hc sinh SUMMARY Investigation of oral diseases rate among 16.024 pupils aged from 6 to 17 years in 29 Districts of Hanoi after administrative expansion indicated that: - The highest rate of permanent teeth decay is belong to secondary grade, lowest rate in among primary grade. - The rate of gingivitis increased from primary to pre-school grade, in which primary school with 0.46%, Secondary school with 7.64% and pre-school grade is at 16.04% - DMFT for permanent teeth is increased by age and grade. At 6 years is 0.01; 9 years is 0.12; 12 years is 0.4; 15 years is 0.34 and 17 years is 1.5 - The number of decay teeth found is high, but the number of restorative teeth is very low. - The rate of teeth decay and gingivitis of old Hanoi is lower than in old Ha tay province. - The rate of teeth decay and gingivitis of urban area is lower than in the sub-urban area. Keywords: oral diseases, pupils T VN Nm 2008, H Ni c m rng thờm 15 qun huyn mi c v din tớch v dõn s thuc H Tõy c (HTC). Bc u kho sỏt thy chng trỡnh nha hc . kháng thể cộng hợp. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Biểu hiện kháng thể scFv kháng CD20 Gen mã hóa kháng thể scFv kháng CD20 được biểu hiện ở E.coli BL21 (DE3) theo phương pháp như mô tả ở trên. Kháng thể. liên kết của kháng thể scFv kháng CD20 với kháng thể cộng hợp đuôi 6xHis chuẩn. Từ khóa: CD20, kháng thể kháng CD20, western blot, imidazol. SUMMARY EXPRESSION OF ANTI -CD20 scFv ANTIBODY. ứng với kháng thể scFv kháng CD20 theo tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định sơ bộ đã biểu hiện thành công kháng thể kháng CD20. Hình 1: Biểu hiện gen