Tiểu luận Phương pháp PCR và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI KHOA SINH HỌC  BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Lý luận và phương pháp dạy học Sinh học Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Thành Đạt PGS.TS. Đặng Hữu Lanh Sinh viên thực hiện: Cao Thị Dung Lớp: Sinh CH-K24 Hà Nội-2015 1 2 3 4 MỞ ĐẦU Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) do Kary Mullis phát hiện ra năm 1985. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn AND nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế. Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái bản AND. Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với AND dễ dàng và hiệu quả hơn. PCR là kỹ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực AND tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mang tính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phân tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gene và đi sâu nghiên cứu chức năng cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển, hoặc phản ứng của gen đối với các điều kiện môi trường. Nó cho phép ta tiến hành những nghiên cứu mà trước đây không có khả năng thực hiện. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ở người, di truyền quần thể, phân tích pháp y, … Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần có. Các phương pháp tạo dòng invitro đã biết tuy giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng lại đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài. Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, trong số đó nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển, mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn. Chính vì vậy tôi đã quyết định nghiên cứu đề tài “Phương pháp PCR và ứng dụng”. Đề tài được nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về các nguyên tắc, chỉ tiêu ảnh hưởng, ứng dụng và hạn chế của phương pháp PCR. Từ đó có những kiến thức cơ bản phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài của luận văn cũng như việc tiến hành các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm sau này. Để đạt được điều đó, đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu như phương pháp thu thập, xử lý thông tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thống hóa thông tin… Ngoài phần Mở đầu, Kết luận, bài tiểu luận bao gồm những nội dung sau: 1 1. Sự phát hiện ra phương pháp PCR. 2. Phương pháp PCR và ứng dụng. 2 1. SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1. Khái niệm PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được gọi là “phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men [7]. Một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn [3]. Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng hợp invitro sử dụng DNA polymerase và các oligonucleotide (các mồi – primers). Đó chính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn mạch DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mồi oligo tạo liên kết với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA invitro nhờ enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA ban đầu làm khuôn rất nhỏ (cỡ 10 -3 μg) [3]. Như vậy, PCR là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của hai mồi oligonucleotide gắn vào hai sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. 1.2. Lịch sử của phương pháp PCR Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở tiểu bang California, trên đường lái xe dọc theo bờ biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một nhà sinh hóa học rất bình thường, làm việc cũng tại một phòng thí nghiệm rất bình thường. Ý tưởng này khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel danh giá. Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA 3 có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase [7]. DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (invitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA [7]. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn. Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA. PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base = 1000 cặp base). Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thước lên đến 40kb, ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào Eukaryote (ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỷ cặp base) [6]. 4 1.3. Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử 1.3.1. Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu). Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vaent (exo). Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’-5’ exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình. Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus 1.3.2. Máy chu kỳ nhiệt Trước đây khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc 5 bằng tay nhàm chán va nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt bao gồm các bộ phận chính như sau: + Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện. + Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện. + Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Để làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ, có hai phương pháp: (1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào. (2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử. 6 [...]... những ứng dụng lớn, ví dụ khuếch đại các vùng thay đổi nằm xen giữa các Alu để lấy nguyên liệu di truyền ban đầu cho các khảo sát sau này 23 KẾT LUẬN PCR là một phương pháp tạo dòng invitro, cơ sở của phương pháp này chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR rất phong phú Nếu như năm 1985 mới có 3 công trình được công bố về PCR. .. đệm Tris HCl 10mM, KCl 50mM và MgCl 2 21,5mM Ngoài ra còn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide [6] Phản ứng PCR còn phụ thuộc vào hàm lượng GC và nhiệt độ nóng chảy Tm Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC ở mức có thể được Những oligonucleotide có 20 base với hàm lượng 50% GC thì có nhiệt độ nóng chảy Tm vào khoảng 56-620C sẽ tạo... trong phản ứng PCR dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với trường hợp huyết thanh học Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường - Giảm về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện vi sinh vật gây bệnh 2.5.2 Hạn chế - Kích thước của trình tự cần khuếch đại: Phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb Việc sử dụng PCR đối với... - Phương pháp này chỉ phát hiện những vi sinh vật có trong mẫu chứ không xác định được số lượng vi sinh vật - Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém Do vậy, để giảm chi phí người ta thường sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR (gọi là phản ứng multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau 2.6 Một số ứng dụng của phương. .. nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau 2.6 Một số ứng dụng của phương pháp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR từ khi được Kary Mullis đề xuất hoàn thiện đã có những ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội 2.6.1 Trong khoa học công nghệ a RT -PCR (Reverse transcriptase -PCR) Phản ứng này được tiến hành nhằm nhân bản các cDNA từ khuôn ban đầu là... Kỹ thuật RAPD -PCR thường được ứng dụng trong phân tích quan hệ họ hàng, xây dựng cây phân loài c PCR tạo đột biến định hướng Được áp dụng để xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp, đưa vào hoặc hoặc bỏ đi, hoặc thay thế các nucleotide trong một đoạn DNA Các nucleotide cần gây đột biến được thiết kế nằm trong trình tự của mồi Kỹ thuật này phối hợp sản phẩm của các phản ứng PCR với nhau Phản ứng PCR định lượng... phản ứng PCR DNA láy từ nguồn nào không quan trọng, yêu cầu duy nhất là vị trí gắn các mồi và trình tự giữa chúng còn nguyên vẹn Đã có những mẫu DNA mà tuổi đến hơn 7000 năm vẫn được sử dụng rất thành công trong các phản ứng PCR 2.4.2 Mồi và nhiệt độ lai Đoạn mồi là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và. .. Taq polymerase 2.2 Nguyên tắc và các giai đoạn của phương pháp PCR Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase...2 PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ 2.1 Sự khác nhau giữa tái bản DNA trong tế bào và trong invitro Trong tế bào, DNA được tái bản dựa theo nguyên tắc bảo tồn, tức là mỗi phân tử con được hình thành từ một mạch cũ và một mạch mới, ở mạch ra chậm 5’→3’ theo nguyên tắc nửa gián đoạn là hình thành các đoạn okazaki, và theo nguyên tắc bổ sung A-T, G-C Qúa trình... năm sau đó đã được sử dụng trong hàng nghìn phòng thí nghiệm trên khắp thế giới Do có các ứng dụng vô cùng to lớn và kỳ diệu trong mọi lĩnh vực, PCR đã thật sự làm được một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử trong thời điểm hiện nay Với kỹ thuật và công nghệ ngày càng tiến bộ, các thuốc thử sẽ càng rẻ và tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày càng hạ và đặc biệt là việc sử dụng hệ thống nội tại . hiện ra phương pháp PCR. 2. Phương pháp PCR và ứng dụng. 2 1. SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1. Khái niệm PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được gọi là “phản ứng chuỗi. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI KHOA SINH HỌC  BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Lý luận và phương pháp dạy học Sinh học Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Thành. kể đến phương pháp PCR đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển, mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn. Chính vì vậy tôi đã quyết định nghiên cứu đề tài Phương pháp PCR và ứng dụng . Đề