Nghiên cứu tổng hợp nano vàng và khảo sát khả năng gắn kết với kháng thể kháng vi khuẩn e coli

Các hạt nano vàng với những đặc tính như không độc, dễ tương tác sinh học và có các tínhchất quang học và điện tử đặc biệt, điều này theo các tài liệu tham khảo cho biết do hiệu ứngkích

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA VẬT LÝ-VẬT LÝ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH QUANG HỌC

- -ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO VÀNG

VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG

VI KHUẨN E.COLI O157

GVHD: TS Lâm Quang Vinh HVTH: Phan Thị Cẩm Huệ

MỞ ĐẦU

Phương pháp khử hóa học chế tạo hạt nano vàng từ axit cloroauric (HAuCl4.3H2O) và gắn kếtkháng thể kháng vi khuẩn E coli O157 lên trên hạt nano vàng Các phương pháp phân tíchnhư phổ hấp thụ được ứng dụng để đánh giá các tính chất của các hạt nano vàng Hơn nữa,khả năng gắn kết giữa kháng thể kháng vi khuẩn E coli O157 với hạt nano vàng chế tạo rađược chứng minh thông qua kính hiển vi truyền qua TEM

Các hạt nano vàng với những đặc tính như không độc, dễ tương tác sinh học và có các tínhchất quang học và điện tử đặc biệt, điều này theo các tài liệu tham khảo cho biết do hiệu ứngkích thước lượng tử tạo nên, đang thu hút nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước trong việcđưa các hạt nano này ứng dụng trong các lĩnh vực y sinh học như chẩn đoán, cảm biến, lâmsàng Vấn đề mà các nhà khoa học đang quan tâm là tạo ra các hạt nano vàng có kích thướcnhỏ, phân bố kích thước đồng đều và đáp ứng yêu cầu trong việc gắn kết với các phần tử sinhhọc nhằm triển khai ứng dụng các hạt nano này vào các lĩnh vực khác nhau đặc biệt ứng dụngtrong việc làm tăng độ nhạy trong cảm biến sinh học sử dụng linh kiện vi cân tinh thể thạchanh (QCM) trong phát hiện các vi khuẩn độc hại và các mục đích khác trong y sinh Phươngpháp phân tích này so với các phương pháp phân tích sinh học thông thường như đếm tế bàotrên kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên dĩa thạch, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR có các

ưu điểm như: phát hiện vi khuẩn ở nồng độ thấp, thời gian thử nghiệm nhanh và chính xác.Hiện nay tại Việt Nam, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng và cầnthiết vì ảnh hưởng đến trực tiếp đến sức khỏe con người mà còn gây thiệt hại về kinh tế, làgánh nặng cho gia đình và xã hội Theo thống kê của Cục An Toàn Thực Phẩm – Bộ Y TếViệt Nam, hơn 5.500 người ngộ độc thực phẩm năm 2012 ở Việt Nam Có nhiều nguyênnhân khác nhau gây ra ngộ độc thực phẩm, trong đó nguyên nhân do ô nhiễm vi sinh vật

chiếm tỉ lệ khá cao Một trong những vi sinh vật gây bệnh được chú ý nhiều nhất là E coli

O157 vì là nguyên nhân gây ra các bệnh tiêu chảy nặng, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiếtniệu và viêm màng não trẻ sơ sinh Trong công việc hiện tại, chúng tôi tiến hành chế tạo hạtnano vàng được biến tính bề mặt với nhóm thiol và khảo sát khả năng gắn kết với kháng thểkháng vi khuẩn E.coli O157 Bên cạnh đó, khả năng gắn kết các hạt nano vàng sau khi chế

tạo ra với kháng thể kháng vi khuẩn E coli O157 được đánh giá bằng phổ hấp thụ và kính

hiển vi truyền qua TEM

TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO VÀNG

Từ buổi bình minh của lịch sử loài người, vàng có thể nói là bề nổi của một nền vănminh Hơn 3.000 năm trước, tại Ai Cập và Trung Quốc con người đã ý thức vàng là kim loạiquý, đã biết khai thác, gia công vàng tạo ra các đồ trang sức quý giá và được xem như mộtthế chấp cụ thể dự trữ cho sự phồn thịnh của một triều đại Giá trị về mỹ thuật hay kinh tế củavàng cho đến ngày hôm nay vẫn không có nhiều thay đổi, nhưng trong nền công nghệ nanohiện đại với những tiềm năng ứng dụng quan trọng của hạt nano vàng trong quang học, quangđiện tử và y học, vàng nano có lẽ còn quí giá hơn vàng khối trên quan điểm thực dụng nhằmphụng sự cho cuộc sống và hạnh phúc con người

Ở trạng thái khối, trong các áp dụng quang học hay quang điện tử, vàng hữu dụng cholắm thì chỉ dùng làm gương phản chiếu Tuy nhiên, vàng nano cho con người một lĩnh vựcnghiên cứu và ứng dụng hoàn toàn mới lạ Khi sóng điện từ tác dụng lên hạt nano vàng, tùyvào kích cỡ của hạt sóng điện từ sẽ có tác dụng sóng tuân theo hiệu ứng "cộng hưởngplasmon" của các điện tử tự do bề mặt và có tác dụng hạt khi kích cỡ của vàng nhỏ hơn 2 nm

và sự phát huỳnh quang xảy ra tuân theo qui luật lượng tử như hạt bán dẫn CdSe

Đặc điểm của kim loại là sự hiện hữu dày đặt của những điện tử tự do Đây cũng lànguyên nhân của sự bóng loáng bề mặt, truyền điện và truyền nhiệt ưu việt của kim loại Khikim loại như vàng và bạc ở dạng hạt nano, hạt không còn màu vàng hay bạc "cố hữu" ở trạngthái khối mà phát ra nhiều màu sắc khác nhau tùy vào kích cỡ và hình dạng Điều này đingược lại những hiểu biết thường thức trong cuộc sống hàng ngày Hai chiếc nhẫn vàng đượcnấu chảy và gia công thành một chiếc nhẫn to gấp đôi thì vẫn là chiếc nhẫn màu vàng Thật

ra, màu sắc của hạt nano vàng và bạc từ dung dịch huyền phù đã được người La Mã áp dụngvào thế kỷ 4 Người ta còn pha chế hạt nano vàng với thủy tinh để làm kính màu đỏ "ruby"trang trí cho cửa sổ thánh đường Mặc dù hạt nano vàng đã được áp dụng hơn 1.700 năm, sựđổi màu của hạt chỉ được làm sáng tỏ vào năm 1908 bởi nhà khoa học Đức, Gustav Mie, qualời giải dựa trên phương trình sóng điện từ Maxwell cho bài toán về sự hấp thụ và tán xạ củasóng trên bề mặt của các hạt hình cầu Vì vậy, sự hiển thị màu sắc của hạt nano vàng cóđường kính từ vài chục đến vài trăm nanomét không trực tiếp liên quan đến sự lượng tử hóanăng lượng vì sóng điện từ tác động lên những điện tử tự do bề mặt hạt mang đặc tính sóng

có cơ bản lý thuyết dựa trên phương trình Maxwell

Sự thay đổi màu sắc của hạt nano vàng ở các kích thước khác nhau

(Dr Michael Cortie, University of Technology, Sydney, Australia)

Màu vàng quen thuộc của vàng là sự hấp thụ ánh sáng màu xanh của phổ mặt trời vàphát ra màu vàng Nhưng khi vàng được thu nhỏ cho đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng củavùng ánh sáng thấy được (400 - 700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt"(surface plasmon resonance, SPR) xảy ra Đây là do tác động của điện trường của sóng điện

từ (ánh sáng) vào các điện tử tự do trên bề mặt của hạt nano Điện trường làm phân cực hạt,dồn điện tử về một phía tạo ra hai vùng, vùng mang điện tích âm và vùng mang điện tíchdương Vì bản chất sóng nên điện trường dao động làm cho sự phân cực bề mặt dao độngtheo Sự dao động này được gọi là "plasmon" Đám mây điện tích trên bề mặt hạt cũng sẽ daođộng lúc âm lúc dương theo nhịp điệu và cường độ của điện trường Ở một kích thước vàhình dáng thích hợp của hạt nano, độ dao động (tần số) của đám mây điện tích sẽ trùng hợpvới độ dao động của một vùng ánh sáng nào đó Sự cộng hưởng xảy ra và vùng ánh sáng này

sẽ bị các hạt nano hấp thụ Đây là một hiện tượng đặc biệt cho vàng và bạc nhưng không thấy

ở các kim loại khác như sắt, bạch kim hay palladium

SPR có bước sóng hấp thụ trong khoảng 520 nm (sóng màu xanh) và ít bị ảnh hưởngcủa kích thước hạt trong phạm vi từ 9 đến 22 nm Các hạt nano hấp thụ ánh sáng xanh sẽ hiểnthị màu đỏ Khi nhìn lại kính "ruby" đỏ mà cổ nhân đã chế tạo từ mấy trăm năm trước, tanhận ra ngay những hạt nano vàng được chế tạo theo phương thức cổ truyền có kích thước 9 -

22 nm Khi hạt càng lớn thì bước sóng hấp thụ có bước sóng dài hơn và khi đến kích thước

99 nm, hạt hấp thụ sóng màu vàng (bước sóng 575 nm) và hiển thị màu xanh

Sự phân cực của điện tử bề mặt do điện trường của sóng điện từ

Sự phát huỳnh quang ánh sáng xanh của hạt nano vàng chứa 8 nguyên tử vàng

Hiệu ứng SPR sẽ biến mất khi vật liệu trở lại trạng thái khối Khi các hạt nano vàngtập tích đến độ lớn micromét, màu vàng nguyên thủy của kim loại vàng sẽ xuất hiện trở lại.Ngược lại, hiệu ứng SPR cũng sẽ biến mất khi hạt nano nhỏ hơn 2 nm Ở thứ nguyên này, ta

đi vào thế giới lượng tử Giống như chấm lượng tử bán dẫn được đề cập bên trên, năng lượngđược lượng tử hóa thành các mức rời rạc Sóng điện từ giờ đây có tác dụng hạt (quang tử).Nhóm của giáo sư Robert Dickson (Georgia Institute of Techology, Mỹ) đã tạo ra những hạtnano (chấm lượng tử) vàng với kích thước thật chính xác chứa 5, 8, 13, 23 và 31 nguyên tử.Đây là những hạt phát huỳnh quang trong đó chùm 31 nguyên tử có đường kính lớn nhấtkhoảng 1 nm Những hạt này được xử lý bề mặt để hòa tan được trong nước Trong dung dịchnước, theo thứ tự kích thước từ nhỏ đến lớn khi được kích hoạt những hạt này có khả năngphát ra tia tử ngoại, ánh sáng xanh, xanh lá cây, đỏ và tia hồng ngoại So với chấm lượng tửbán dẫn CdSe chứa vài trăm đến hơn 1.000 nguyên tử, chấm lượng tử vàng nhỏ hơn với vàichục nguyên tử và không có độc tính như Cd Vì vậy, tiềm năng áp dụng trong y học rất lớn

CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HẠT NANO VÀNG BIẾN TÍNH BỀ MẶT

1 Phương pháp Turkevich.

Phương pháp này được phát minh bởi J Turkevich và các cộng sự vào vào năm 1951

và sau đó được cải tiến bởi G Frens vào những năm 1970 Đây là phương pháp tổng hợp phổbiến nhất trong việc tạo ra các hạt nano vàng có đường kính từ 10 – 20 nm do tính đơn giản

và hiệu quả của nó Trong phương pháp tổng hợp này dung dịch HAuCl4.3H2O được khuấytrộn và gia nhiệt trong dung môi là H2O đến nhiệt độ sôi trước khi nhỏ giọt dung dịch sodiumcitrate vào để khử các ion Au thành nguyên tử Au Sodium citrate ngoài khả năng khử muốivàng chloride còn có chức năng bao bọc các hạt vàng để tránh sự kết tụ của các hạt nanovàng

Để tạo ra các hạt nano vàng lớn hơn, yêu cầu một lượng ít hơn citrate (có thể dưới0.05%, một lượng nhỏ hơn sẽ không thể kích thích phản ứng khử hết các ion Au3+) Việc khửtrong một lượng natri citrate sẽ làm giảm lượng ion citrate sẵn có cho việc bọc xung quanhhạt nano vàng, điều này sẽ làm cho các hạt nhỏ kết đám với nhau và tạo nên những hạt lớnhơn (cho đến khi tổng diện tích bề mặt của các hạt trở nên đủ nhỏ để được bọc bởi tất cả cácion citrate tồn tại trong dung dịch)

Phương trình phản ứng của muối vàng HAuCl4 với sodium citrate Na3C6H5O7 được đềxuất bởi Kumar:

2HAuCl4 + 3Na3C6H5O7 → 2Au0 + 3Na2C5H6O5 + 3NaCl + 5Cl- + 5H+ + 3CO2

2 Phương pháp Perrault.

Phương pháp này được phát minh bởi Perrault và Chan trong năm 2009, sử dụnghydroquione  C6H4(OH)2 để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt nano vàng.Phương pháp này tương tự với phương pháp sử dụng trong việc phát triển film tạo ảnh, trong

đó các hạt bạc bên trong film lớn dần lên trong khi có sự bổ sung của các nguyên tử bạc đượckhử ngay trên bề mặt Tương tự như thế, các hạt nano vàng có thể đóng vai trò là chất cầu nốivới hydroquinone để xúc tác việc khử các ion vàng trên bề mặt Sự tồn tai các chất ổn địnhnhư các ion citrate có thể tạo ra việc mọc các hạt có kiểm soát Phương pháp này có thể tạo racác hạt nano với kích thước rất lớn trong khoảng 30-250 nm

3 Phương pháp Brust.

Phương pháp này được phát hiện bởi Brust và Schiffrin vào đầu những năm 1990 và cóthể được sử dụng để tổng hợp các hạt nano vàng trong dung môi hữu cơ mà thông thườngkhông thể trộn lẫn trong nước (như toluene) Phản ứng đặc trưng của phương pháp giữa axitchloauric và tetraoctylammonium bromide (TOAB) trong toluene và natri borohydrate đóng vaitrò lần lượt như chất chống kết tủa và chất khử

Các hạt nano vàng chế tạo theo phương pháp này có kích thước trung bình 5-6 nm.NaBH4 đóng vai trò tác nhân khử, trong khi TOAB đóng vai trò là chất xúc tác chuyển pha vàchất làm bền Một điều quan trọng là TOAB không bọc xung quanh hạt nano một cách vữngchắc, nhưng dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2 tuần Để hạn chế hiện tượng này,một tác nhân làm bền mạnh có thể được sử dụng như thiol (alkanethiol), có thể liên kết cộnghóa trị với hạt nano vàng, tạo ra một dung dịch gần như vĩnh cửu Alkanethiol bảo vệ hạt nanovàng có thể bị kết tủa nhưng sau đó sẽ được hòa tan lại Một số tác nhân chuyển pha có thể duytrì việc bọc với các hạt nano sau khi đã làm sạch, việc này có thể gây ảnh hưởng đến thuộc tínhvật lý của hạt như tính tan

4 Phương pháp Martin.

Phương pháp này được phát minh bởi nhóm Martin vào năm 2010, phương pháp nàytạo ra các hạt nano vàng dạng “trần” trong nước bằng việc khử HAuCl4 với NaBH4 Mặc dùkhông sử dụng các chất hoạt động bề mặt như citrate, các hạt nano vàng phân tán rất bền Phân

bố kích thước gần như đơn phân tán với đường kính có thể chính xác và tái tổng hợp trongkhoảng 3.2 đến 5.2 nm Chìa khóa cho việc làm bền HAuCl4 và NaBH4 trong dung dịch stockvới HCl và NaOH lần lượt trong hơn 3 tháng và hơn 3 giờ Hơn nữa, tỷ số của các ion NaBH4-NaOH với HAuCl4-HCl phải được kiểm soát chính xác trong vùng gọi là “sweet zone” Các hạtnano “trần” được bọc với một đơn lớp 1-dodecanethiol và sau đó chuyển pha thành hexanebằng việc lắc hỗn hợp của nước, acetone và hexane trong 30 giây Do đó, tất các sản phẩmphản ứng kết hợp tồn tại ở pha nước-acetone Lượng 1-dodecanethiol chỉ chiếm 10% nguyên tửvàng trong tổng số Tất cả các quy trình phản ứng này chỉ mất dưới 10 phút

TỔNG HỢP NANO VÀNG ĐƯỢC BIẾN TÍNH BỀ MẶT VỚI MHDA & MCU

Hóa chất:

Tetrachloroauric acid trihydrate (HAuCl4.3H2O) 5mM,

11-mercapto-1-undecanol (HO(CH2)11SH) (MCU) (97%),

16-mercaptohexadecanoic acid (MHDA) (90%),

Bước 2: Khuấy trộn 20ml HAuCl4.3H2O 5mM trong 200ml ethanol

Bước 3: Hòa tan 55.18mg 11-mercapto-1-undecanol và 8.65mg

16-mercaptohexadecanoic acid vào dung dịch đang khuấy.

Bước 4: Thực hiện làm lạnh hỗn hợp dung dịch trên đến 0oC Sau khi dung dịchđược làm lạnh ta nhỏ giọt 20ml NaBH4 14mM vào Quan sát sự đổi màu của dungdịch ta sẽ thấy hỗn hợp nhanh chóng chuyển sang màu nâu đen Sau 3h khuấy ta đểdung dịch kết tủa xuống đáy lọ

Bước 5: Thực hiện quay li tâm hỗn hợp, sau đó gạn lọc lại ta sẽ được các hạt nano

vàng đã được biến tính bề mặt

Bước 6: Hòa tan hạt nano vàng đã được biến tính vào 100ml ethanol, sau đó quay li

tâm và gạn lọc hỗn hợp, điều này giúp loại bỏ các nhóm chức chưa liên kết với bềmặt hạt nano vàng và các tạp chất ban đầu

Bước 7: Khuấy trộn hạt nano trong 100ml dung dịch ethanol có chứa 50ul HCl 1M

để khử hoàn toàn Na+ ra khỏi bề mặt nhóm thiol

Phân tích phổ FTIR của hạt nano vàng biến tính bề mặt với MHDA & MCU

Hình phổ FTIR của 16-mercaptohexadecanoic acid (MHDA)

Dựa trên phổ FTIR của 16-mercaptohexadecanoic acid và 11-mercapto-1-undecanol

ta có thể xác định các liên kết đặc trưng có trong 2 hợp chất này, từ đó so sánh với phổ IR củacác hạt nano vàng biến tính với nhóm thiol

Phổ FTIR của 16-mercaptohexadecanoic acid thể hiện rõ các nhóm chức liên kết cótrong nó với đỉnh 2849.75 và 2915.86 cm-1 lần lượt là dao động hóa trị đối xứng và hóa trị bấtđối xứng của liên kết C-H trong nhóm CH2 Các dao động của các liên kết trong nhómcacboxylic acid (COOH) thể hiện qua các đỉnh 3035.62 cm-1 (liên kết O-H), 1695.38 cm-

1(liên kết C=O), đỉnh 1290.98 cm-1 (liên kết O-H – dao động biến dạng trong mặt phẳng) vàđỉnh 680.76 cm-1 là của liên kết S-C

2 2915 86

2849 75

1695 38

1290 98 680 76

Hình phổ FTIR của 11-mercapto-1-undecanol (MCU)

Tương tự như vậy, phân tích phổ FTIR của 11-mercapto-1-undecanol (MCU) cho tacác liên kết đặc trưng của nó tại các đỉnh 3351.96 cm-1 ( liên kết O-H), 2853.39 cm-1 (liên kếtC-H – dao động hóa trị đối xứng), 2922.84 cm-1 (liên kết C-H – dao động hóa trị bất đốixứng), 1462.30 cm-1 (liên kết C-H – dao động biến dạng), 1055.93 cm-1 (liên kết C-OH), đỉnh651.60 cm-1 (liên kết S-C) và đỉnh 2559.84 cm-1 (liên kết S-H)

Hình phổ FTIR của hạt nano vàng sau khi biến tính bề mặt với nhóm thiol

Quan sát phổ đồ trên ta xác định được các liên kết:

Đỉnh 3045.89 cm-1 đặc trưng cho liên kết O-H dao động biến dạng

Đỉnh 2920.13 và 2849.99 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H dao động hóa trị đối xứng

và dao động hóa trị bất đối xứng tương ứng

Đỉnh 1636.63 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O trong nhóm cacboxylic acid.Đỉnh 1466.62 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H dao động biến dạng

Đỉnh 1219.46 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O dao động biến dạng

Từ những phân tích các dao động phổ đã thực hiện cho 16-mercaptohexadecanoic acid, mercapto-1-undecanol và hạt nano vàng biến tính ta đưa ra những nhận xét như sau:

11 Các liên kết trong thành phần phổ của các hạt nano vàng biến tính cho thấy sự gắn kếtthành công của nhóm thiol có gắn nhóm chức alcohol và cacboxylic acid

- Trong phổ đồ của hạt nano vàng biến tính cũng không thấy sự xuất hiện của liên kếtS-H so với các hợp chất ban đầu, như vậy liên kết S-H đã biến mất sau khi biến tính,điều này thể cũng thể hiện sự gắn kết thành công của nhóm thiol có gắn nhóm chứcalcohol và cacboxylic acid lên bề mặt hạt nano vàng

- So sánh đỉnh phổ của liên kết C-H trong nhóm ankyl ta cũng có thể thấy đỉnh phổ của liên kết C-H trong hạt nano vàng biến tính có cường độ yếu hơn so với đỉnh trong các hợp chất ban đầu, điều này được giải thích là do ái lực điện tử của Au (Au-S-) tác