Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu và giải phóng enzim khỏi tâm gắn của nó. Phá huỷ thành tế bào, màng tế bào và cấu trúc dưới phân tử. Khống chế mức độ phá vỡ để thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sau này. Không làm biến tính enzim. Quá trình tách chiết thực hiện ở nhiệt độ thấp.
CHƯƠNG 2. MỘT SỐ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT ENZIM Tách chiết enzim Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu và giải phóng enzim khỏi tâm gắn của nó. Phá huỷ thành tế bào, màng tế bào và cấu trúc dưới phân tử. Khống chế mức độ phá vỡ để thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sau này. Không làm biến tính enzim. Quá trình tách chiết thực hiện ở nhiệt độ thấp. • Loại bỏ các mảnh tế bào Loại bỏ toàn bộ các phần tử rắn, kết tủa của các axit nucleic, protein… Chọn phương pháp lọc hoặc ly tâm phụ thuộc vào qui mô SX và bản chất của chất rắn. • Loại bỏ các axit nucleic Axit nucleic làm tăng độ nhớt của môi trường. Cần thiết khi phá huỷ hoàn toàn thành tế bào VSV. 1. Các nguyên tắc chung ξ1. NGUYÊN TẮC TÁCH CHIẾT 2. CƠ SỞ CHUNG ĐỂ TRÍCH LY CÁC ENZIM • Năng lượng cần thiết để phá vỡ tế bào phụ thuộc loại tế bào, trạng thái sinh lý của tế bào. • Phương trình thể hiện quá trình phá vỡ tế bào τ k PP P Ln m m = − Trong đó P m : Lượng protein tối đa được giải phóng P: Lượng protein giải phóng ra tại thời điểm xác định k: Hằng số tỷ lệ τ: Thời gian phá tế bào • Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzim khi phá vỡ tế bào Nhiệt độ: cần loại bỏ lượng nhiệt sinh ra khi phá vỡ TB. Bổ sung cơ chất hoặc các chất tương tự cơ chất hoặc các polyol làm bền enzim Lực cắt: lực cắt có thể phá huỷ enzim; đặc biệt khi có mặt các ion kim loại hoặc trên bề mặt phân tách với không khí. pH: dung dịch đệm rất quan trọng trong việc ổn định hoạt lực enzim. Hoá chất: các chất tẩy rửa và dung môi có thể gây biến tính enzim. Chất chống oxy hoá: các tác nhân khử axit ascorbic, mercapto etanol, ditiotreitol… có thể rất cần thiết. Chất tạo bọt: mặt phân cách lỏng – khí trong các bọt có thể phá huỷ hình thể enzim. Kim loại nặng: các ion đồng, sắt, niken… nhiễm vào từ các thiết bị gây vô hoạt bất thuận nghịch enzim. ξ2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZIM 1. Các phương pháp cơ học Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm Điều kiện: huyền phù VSV; sóng siêu tần 18KHz – 1MHz chuyển động hình sin với bước chuyển dịch nhỏ < 50µm, vận tốc vài m.s -1 , gia tốc lớn 80 000g. Nguyên lý: Vô số vi bọt tạo thành, lớn dần lên và xẹp xuống. Bọt xẹp chuyển năng lượng âm thanh thành năng lượng cơ học gây sốc với áp suất hàng ngàn atm (300MPa). Giải pháp: Một lượng lớn năng lượng chuyển thành nhiệt, nên phải làm lạnh. Sóng siêu âm dễ làm biến đổi cấu trúc enzim và phá huỷ enzim do oxy hoá các gốc tự do, dùng N 2 O giảm được tác dụng xấu này. Ưu điểm: phương pháp phổ biến, hữu ích, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ. Nhược điểm: pH, Nhiệt độ, lực ion của MT huyền phù thời gian tác dụng có ảnh hưởng lớn. Lạnh đông và nhả lạnh đông Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -20 o C, nén dưới áp suất cao (10 – 15 tấn/inch vuông) qua các lỗ hẹp của máy nén. Nguyên lý: Kết quả của việc làm lạnh đông đột ngột tế bào là cô đặc chất hoà tan nằm bên trong tế bào. Sự hình thành các tinh thể bên trong và ngoài tế bào kéo theo việc phá vỡ tế bào. Khi nén, tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích, cũng như do tác dụng của lực cắt các tinh thể đá. Ưu điểm: phương pháp phổ biến, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ. Nhược điểm: năng suất thấp (10kg/h), thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, dễ làm biến tính enzim. Nghiền hay đảo trộn với bột mài – Điều kiện: huyền phù VSV; các hạt thuỷ tinh (hoặc inox) đường kính 0,2 – 1,0mm. Cùng một thể tích viên bi, sử dụng các hạt nhỏ sẽ cho hiệu quả tốt hơn. Số lượng các viên bi tối ưu khi khoảng cách giữa hai viên là 0,22mm. – Nguyên lý: huyền phù tế bào được đảo trộn với các viên bi sẽ bị phá huỷ do lực cắt của chất lỏng cao, do va chạm với các viên bi. Mức độ phá huỷ phụ thuộc vào tốc độ và thời gian đảo trộn, nồng độ VSV, số lượng và kích thước các hạt. – Ưu điểm: phương pháp phổ biến, phá huỷ được tế bào của tất cả sinh khối tế bào dạng sợi đơn bào, đơn giản, năng suất tương đối cao có thể đạt 340kg/h huyền phù sinh khối. – Nhược điểm: thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, hiệu suất phá vỡ tế bào không cao, dễ làm biến tính enzim. Phá huỷ ở áp suất cao – Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -25 o C được nén dưới áp suất 1 – 2,5 tấn/cm 2 qua một đĩa có kích thước lỗ 1,5 – 2,5mm. Nhiệt độ của máy được duy trì không đổi nhờ dòng tác nhân lạnh glycol -25 o C. – Nguyên lý: dưới áp suất lớn huyền phù tế bào đi qua cửa thoát sẽ được phá vỡ tế bào. – Nhược điểm: năng suất thấp, thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, dễ làm biến tính enzim. Đồng hoá dưới áp suất cao – Điều kiện: huyền phù VSV được bơm vào máy với áp suất 8000 – 20000PSI (150MPa; 10tấn/inch vuông) với lưu lượng 10 000l/h qua một van xả có miệng hẹp, sau đó áp suất nhanh chóng được đưa đến áp suất khí quyển. – Nguyên lý: các tế bào bị nén lại va chạm với nhau, sau đó nổ vỡ ra bởi áp suất giảm đột ngột khi qua van là nhân tó chủ yếu phá vỡ tế bào. Protein được giải phóng tương ứng với phản ứng bậc 1 (đối với nấm men): Nk RR R Ln m m = − R m : Lượng protein tối đa được giải phóng (96mg/g nấm men) R: Lượng protein giải phóng ra sau N lần qua máy k: Hằng số động học giải phóng protein: với Sacharomyces cerevisiae k = k’P 29 ở dưới 75MPa với Escherichia coli k’: hằng số tỷ lệ - Ưu điểm: lực làm biến dạng tế bào không làm biến tính các enzim tự do - Nhược điểm: Không thích hợp với tế bào dạng sợi, thích hợp dạng đơn bào. Sự khu trú enzim trong tế bào ảnh hưởng đến các điều kiện đồng hoá. 2. Các phương pháp không phải cơ học Xử lý kiềm: pH môi trường pH = 11,5 – 12,5 cho phép thuỷ phân màng TB. Kỹ thuật này chỉ áp dụng cho enzim bền trong MT này ít nhất 20 – 30 phút (L asparaginase, pH = 12,0, τ = 20 phút). Sử dụng chất tẩy rửa: chất tẩy rửa ở dạng ion hoặc không sẽ liên kết với các lipoprotein màng tạo ra các mixen trong một số điều kiện pH, lực ion, nhiệt độ làm cho màng TB trở nen thẩm thấu. Chất tẩy ion laurylsulfat natri (CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 -SO 4 -Na, Tween 20; chất tẩy không ion Triton X100. Sốc thẩm thấu: huyền phù TB trong môi trường ưa trương (dung dịch 20% sacaroza trong nước) ở 4 o C tạo ra sốc thẩm thấu trên màng TB. Kỹ thuật này chỉ sử dụng cho vi khuẩn Gram âm để trích ly enzim periplasmic. Không làm biến tính enzim, tinh chế enzim đơn giản. Năng suất thấp 400 dm 3 cho 10kg huyền phù TB. Dung giải bằng enzim: lysozim xúc tác thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucozit của các peptidoglucan giữ vai trò duy trì độ cứng của TB VK. Sử dụng kết hợp lysozim với etilendiamin tetraaxetic axit (EDTA) để tạo phức với Ca làm giải phóng các lipopolisacarit và phá huỷ màng TB. Lysozim lòng trắng trứng là enzim dung giải duy nhất được sử dụng ở qui mô thương mại. Kỹ thuật này chỉ áp dụng ở qui mô nhỏ vì KT thao tac và giá thành cao. 3. Các phương pháp tách chiết bằng dung môi Nguyên tắc tách chiết: Sau khi phá vỡ tế bào tiến hành tách các chất không phải protein enzim trên cơ sở tính hoà tan. Một dung môi tách chiết tốt phải đảm bảo enzim hoà tan suốt trong quá trình tinh chế nếu có sự thay đổi về tính đệm MT, T, pH. Định luật Raoult: Các phân tử hoà tan và dung môi độc lập với nhau. Hai hướng của luật này là: • Dương: nếu tương tác CHT – CHT; DM – DM mạnh, còn CHT – DM yếu. • Âm: nếu tương tác CHT – DM mạnh. Hướng dương tương ứng tính tan yếu, hướng âm với tính tan mạnh. Dung môi tách chiết: • Các dung môi có cực như dung dich muối vô cơ tương tác mạnh với enzim làm cho chúng trở nên hoà tan, nhưng khi nồng độ muối đậm đặc hơn xảy ra hiện tượng giảm tính hoà tan mới. • Các dung dịch ít có cực như dung môi hữu cơ làm giảm ĐHT của enzim. Trong trường hợp này tách các chất hoà tan không phải protein ra khỏi enzim. Dung môi hữu cơ thường dùng butanol, axeton. Các yếu tố ảnh hưởng: pH, nhiệt độ, một số ion đặc hiệu. . CHƯƠNG 2. MỘT SỐ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT ENZIM Tách chiết enzim Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu và giải phóng enzim khỏi tâm gắn của nó.. pháp tách chiết bằng dung môi Nguyên tắc tách chiết: Sau khi phá vỡ tế bào tiến hành tách các chất không phải protein enzim trên cơ sở tính hoà tan. Một