Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế. Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”. Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này.
CHƯƠNG 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG • Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế. Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”. Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này. • Khả năng tách chiết Kết thúc quá trình lên men, tiêu diệt VSV này mà vẫn giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn. 1. Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật ξ1. VI SINH VẬT • Ổn định gen Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà không có bất cứ lạc hướng nào trong quá trình nuôi cấy liên tục. 2. CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP Danh mục các vi sinh vật và enzim được liệt kê trong bảng • Sản lượng Có khả năng chịu được điều kiện của quá trình lên men công nghiệp. Đạt được những mức thể hiện gen cao trong môi trường nuôi cấy. Về mặt sinh lý học VSV không gây ra sự tăng độ nhớt đáng kể trong quá trình tăng trưởng của tế bào. 3.Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV • Phân lập và tuyển chọn giống VSV Được phân lập từ đất, nước, không khí, từ một số thực vật . hoặc từ bộ sưu tập giống VSV có sẵn Tuyển chọn chủng VSV có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzim mong muốn cao và ổn định . Với mục đích sử dụng trong CNTP, chế phẩm cần phải được kiểm tra kỹ trên phương diện Độ độc. • Cải tạo giống VSV mục đích: Tăng hiệu suất tăng trưởng và hoạt động đặc hiệu liên quan tới tổng hợp protein enzim. Gây đột biến cấu trúc khi enzim là enzim cảm ứng. Cải thiện sức đề kháng tốt với các sản phẩm chuyển hoá. Đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hoá học • Các tác nhân vật lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại) tia X (rơnghen), tia γ, hoặc bắn phá bằng hạt nơtron, electron. Trong đó thường sử dụng nhất là tia cực tím (UV). • Các tác nhân hoá học: các hợp chất chứa nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin, nitrithydroxylamin, etylmetylsulfonat. Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử • Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không cần có sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào. • Phương pháp tiếp hợp gen: vật liệu di truyền (ADN) chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau, do vậy các VSV có khả năng biến nạp thì không có khả năng tham gia tiếp hợp gen • Phương pháp tải nạp: vật liệu di truyền ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage). Trong quá trình tải nạp các đoạn ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận tiếp hợp với ADN của tế bào nhận do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận. ξ2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Các tiêu chí lựa chọn nguyên liệu Đáp ứng được các luật hiên hành ở các nước tiên tiến: không có các chất sát trùng, kháng sinh, thuốc trừ sâu, kim loại nặng … Nguồn cung cấp ổn định về số lượng và chất lượng suốt trong năm. Giá cả rẻ nhất có thể được bao gồm cả bảo quản và vận chuyển. Trong thực tế tất cả các sản phẩm được sử dụng làm môi trường thường được lấy từ các nhà máy nông sản thực phẩm. Nguyên liệu của môi trường lên men bao gồm : • Nguồn cacbon: bột ngũ cốc, bột đậu, bột ngô, khoai tây, cám mì hoặc cám gạo, tinh bột, maltodextrin, xenluloza, glucoza, sacaroza, … nguồn phi gluxit như glyxerol, axit béo . • Nguồn nitơ: tách chiết nấm men, casein (13% nitơ), bột cá, khô lạc, khô đậu, sản phẩm thuỷ phân của casein (nguồn nitơ hữu cơ). Các muối amôn và nitrat … (nguồn nitơ vô cơ). • Các muối vô cơ: mang lại một lượng tối thiểu các kim loại như Mg, Ca, K, Fe, Mn, Zn … Photpho dưới dạng muối photphat và lưu huỳnh dưới dạng muối sulfat. • Các chất tăng trưởng và các chất kích thích tăng trưởng: chất cảm ứng; các coenzym (thiamin tăng sản xuất pyruvat cacboxylase); sản phẩm của phản ứng enzym (maltodextrin đối với a-amylase, maltoza đối với pullulanase). 2. Chuẩn bị và thanh trùng môi trường Nguyên tắc chung • Vệ sinh môi trường nuôi cấy phải được duy trì cho tới thời điểm thu hồi VSV, xử lý tách enzim • Không nên thanh trùng tạo ra các sản phẩm bất lợi cho sự tăng trưởng của VSV và tổng hợp enzim (phản ứng Maillard). Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt • Gồm các nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%). • Bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường. • Trước khi gieo VSV, môi trường cần được làm ẩm đến 50 – 65% và thanh trùng 1 at ở 120 o C để diệt VSV lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40 o C và tiến hành gieo cấy VSV. Đối với phương pháp nuôi cấy chìm • Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men. Sau đó đưa trực tiếp hơi nước nống vào thanh trùng ở nhiệt đô 118 – 125 o C trong 45 – 60 phút. • Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV. 3. QU TRèNH LấN MEN 1. Cỏc phng phỏp lờn men c s dng Phương pháp lên men bề mặt Nguyờn tc: s dng mt cht mang rn, trờn ú nuụi cy VSV (thng l nm si)). Quỏ trỡnh nuụi cy din ra trong thit b dng gin lm m hay dng thựng quay. u im: cho phộp nõng cao hot lc enzim trong sn phmlờn men. Canh trng sau khi sy khụ vn chuyn c d dng. Trỏnh c nhim trựng ton khi canh trng v ớt tn in nng. Nhc im: nng sut thp, khụng nõng cao c nng sut thit b. Tn nhiu cụng lao ng th cụng. Khú iu chnh thnh phn mụi trng. Khú c gii hoỏ v t ng hoỏ. Phương pháp lên men bề sâu Nguyờn tc: s dng mụi trng lng trong thit b phn ng nuụi cy VSV. Tt c cỏc thụng s ca quỏ trỡnh lờn men c kim tra v iu chnh trong sut quỏ trỡnh. u im: Ch ng iu khin quỏ trỡnh lờn men. D c gii hoỏ, t ng hoỏ. Nng sut cao. Cú tớnh liờn tc tit kim c din tớch sn xut. S dng hp lý cỏc cht dinh dng ca mụi trng. ng nht trong mụi trng lờn men tt, thun li cho quỏ trỡnh tỏch chit. Nhc im: Nng enzim trong canh trng thp. Phi cụ c nờn giỏ thnh cao. Tn in nng do sc khớ liờn tc. Khi khụng m bỏo vụ trựng tuyt i d b nhim ton b mụi trng. 2. Quá trình lên men chính 2.1. Khía cạnh sinh học • Khi nuôi VSV tạo enzim có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: sinh khối VSV và tích tụ enzim. Hai quá trình này không phải lúc nào cũng trùng khớp nhau về mặt thời gian. • Theo lý thuyết hiện đại giữa vận tốc ST và vận tốc STH enzim có mối tượng quan phụ thuộc. Hai kiểu phụ thuộc giữa các quá trình này: Kiểu 1: vận tốc ST của VSV hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc STH enzim. Kiểu 2: Sự không trùng khớp của 02 giai đoạn này được xác định bằng « tuổi thọ » của axit ribonucleic thông tin hay axit axit ribonucleic khuôn. • Theo lý thuyết về các quá trình đồng hoá và dị hoá. Ba dạng biểu hiện tương quan các quá trình này: Dạng 1 Dạng 2 Dạng 3 • Dạng 1: Tăng trưởng VSV và STH enzim đi đôi với nhau (hình 1a). Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, cơ chất chính của lên men cũng là chất cảm ứng enzim. • Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, thậm chí sau pha tăng trưởng (hình 1b). Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, nhưng cơ chất chính của lên men và chất cảm ứng enzim là khác nhau. • Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha giữa pha tăng trưởng VSV và STH enzim (hình 1c). Enzim tạo nên bằng con đường đồng hoá. Sự kìm hãm ngừng lại khi nồng độ của chất kìm hãm đã bị giảm xuống do sự tăng trưởng của VSV. 2.2. Khía cạnh hoá sinh Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 tấn oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m 3 ); sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường lên men. Sản sinh ra sinh khối (tăng trưởng từ 1 tới 10 8 chỉ trong 5 – 10 ngày); CO 2 , nhiệt (2106kj/h); tiết ra các sản phẩm trao đổi chất và enzim. 2.3. Các phương pháp lên men bề sâu Trong QTLM với việc lấy mẫu vô trùng môi trường cho phép xác định: • Sự tăng trưởng của VSV (sinh khối; độ nhớt) • Nồng độ enzim (hoạt độ enzim) • Tiêu thụ cơ chất. • Tỷ lệ protein Với các bộ phận thu nhận tín hiệu cho phép đo hay điều chỉnh: • pH, bởi điện cực được gắn trên bình lên men và thùng chứa axit hay bazơ. • Nhiệt độ, bởi lưu lượng nước lạnh chảy bên ngoài hay trong ống xoắn. • Mức độ bọt, bởi một bộ phận có chứa chất chống tạo bọt thực phẩm. • Áp suất, bởi van an toàn nằm giữa 1 – 3 bar. • Hệ số hô hấp QR (CO 2 sinh ra/ O 2 tiêu thụ). • Tỷ lệ tiêu thụ oxy. [...]... là các dầu thực vật, động vật và silicon Các chất này ảnh hưởng không tốt tới sự vận chuyển oxy và đối với VSV 2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM • Oxy hoá môi trường: thông số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển trong qui mô công nghiệp Khó khăn ở chỗ các cấu phần chung “lên men thiết bị lên men” tuân theo các luật tự nhiên khác nhau: QT vật lý (chuyển khối), QT sinh lý (các VSV),... và nuôi cấy 2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM 2.4.1 Các thông số vật lý • Nhiệt độ: Lượng nhiệt giải phóng có thể đạt 2106kcal/h Cần phải làm nguội • pH: pH phải được điều chỉnh liên tục nhờ các điện cực bằng các chất kiềm (NaOH, KOH, …) hoặc các chất đệm photphat hoặc axit vô cơ (photphoric, sulfuric…) • Bọt: Khi khuấy trộn môi trường giàu protein sinh ra bọt Bổ sung các chất chống... đặc hiệu sinh học tinh tế hơn để nhận được một phân tử enzim tinh khiết ξ6 QUÁ TRÌNH CÔ ĐẶC VÀ HOÀN THIỆN SẢN PHẨM Cô đặc – Siêu lọc: màng bán thấm dạng sợi xốp hay sợi màng; lọc ở áp suất cao (vài atm); các phần tử nhỏ đi qua màng bán thấm (nước và muối vô cơ) – Làm bay hơi nước ở áp suất thấp (cô đặc chân không) – Làm bay hơi nước ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (sấy phun) Hoàn thiện sản phẩm... sự xuất hiện của chúng trong QTLM ξ4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM 1 Làm lạnh môi trường nuôi cấy ngay khi QTLM kết thúc tới 3 – 5oC • Tránh vô hoạt enzim • Tránh nguy cơ nhiễm tạp VSV 2 Phân tách pha chứa enzim Đối với enzim ngoại bào • Điều chỉnh pH môi trường tới giá trị pH tối ưu của enzim và duy trì suốt trong QTTC • Bổ sung các chất trợ lắng như bột diatomit, silic, xenluloza • Phân tách các vật. .. trợ lắng như bột diatomit, silic, xenluloza • Phân tách các vật liệu tế bào và các vật liệu không hoà tan: vi lọc, ly tâm, lọc màng • Siêu lọc dung dịch protein vô trùng để thu nhận được tối đa enzim mong muốn với ngưỡng cắt màng và lưu lượng dòng chảy được lựa chọn Nồng độ enzim nhận được tăng 20 – 40 lần ξ4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM Đối với enzim nội bào Sự phân bố enzim trong tế bào VSV Cấu... sợi khi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s trong thiết bị LM có dung tích lớn – Độ hoà tan của oxy trong nước ở 25oC, dưới áp suất 1at (oxy tinh khiết) chỉ là 1,29mM (hoặc 0,041g/l) và giảm xuống khi nhiệt độ tăng lên 2.4.2 Các thông số sinh lý • Cân bằng năng lượng: Một lượng lớn năng lượng phát tán dưới dạng nhiệt cần phải loại bỏ bằng hệ thống làm nguội của thiết bị Cần phải hướng vi c sử dụng năng lượng... glucan Khu trú của enzim trong cấu trúc vi thể của tế bào VSV: - Enzim ngoại bào: Enzim được STH trong tế bào và được tiết ra bên ngoài môi trường trong QTLM - Enzim nội boà: Enzim được STH và sử dụng hoàn toàn bên trong tế bào Chúng tồn tại dưới dạng liên hợp, dạng liên kết hay dạng “bị nhốt trong các bào quan của tế bào - Enzim périplasmique: Enzim nzừm ngoài màng sinh chất nhưng bên trong tế bào Phân... enzim periferique • Sóng siêu tần (20 MHz) • … Khi enzim được giải phóng khỏi tế bào các xử lý tiếp theo giống nhau đối với enzim ngoại bào ξ5 QUÁ TRÌNH TINH CHẾ ENZIM Thành phần của dịch chứa enzim: nhiều loại enzim; protein; các tạp chất khác Quá trình phân tách được phân ra 03 giai đoạn: – Giai đoạn 1: Trích ly cho phép nhận được hỗn hợp phân tử dưới dạng hoà tan có các tính chất lý hoá học rất... tổng hợp một vài loại enzim Trong trường hợp này sục khí quá mạnh sẽ không có lợi • Áp suất O2: Oxy có tác dụng khác nhau trong các giai đoạn sinh trưởng hay tổng hợp enzim: – Tổng hợp penicilinaxylase bởi E coli: Tỷ lệ oxy hoà tan cao tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng, nhưng không thuận lợi cho STH enzim – Tổng hợp glucooxydase bởi Asp Niger: tăng áp suất oxy liên quan tới tăng độ tăng trưởng và... sung các chất nền để điều chỉnh nồng độ hoạt độ enzim của chế phẩm – Dạng lỏng: Bổ sung các chất bảo quản NaCl, socbitol, glyxerol, benzoat ξ7 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM Chất lượng VSV (Không có các mầm bệnh) Hoạt độ enzim Chất lượng sản phẩm Độ ổn định của enzim trong bảo quản . chọn vi sinh vật ξ1. VI SINH VẬT • Ổn định gen Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà không có bất cứ lạc hướng nào trong quá trình. liên tục. 2. CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP Danh mục các vi sinh vật và enzim được liệt kê trong bảng • Sản lượng Có khả