Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm do vi rút viêm gan A gây nên. Bệnh phổ biến với 1,5 triệu người mắc mới hàng năm trên toàn thế giới và có thể dự phòng được bằng vắc xin [33], [51], [72], [94]. Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút viêm gan A nên nhu cầu sử dụng vắc xin viêm gan A là rất lớn [5], [9]. Nhằm thực hiện chiến lược dự phòng viêm gan A, Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta. Vắc xin này đã phát huy được tính hiệu quả, an toàn, đáp ứng được phần lớn nhu cầu vắc xin viêm gan A trong nước [18], [24], [25]. Tuy nhiên, công nghệ sản xuất vắc xin này còn một số hạn chế vì tế bào thận khỉ Maccaca mulatta phải chọn lọc qua việc kiểm soát chặt chẽ các vi rút ngoại lai, khó mở rộng về quy mô sản xuất. Xu hướng hiện nay trên thế giới là sử dụng vắc xin viêm gan A bất hoạt sản xuất trên tế bào lưỡng bội phổi người (MRC5 - Medical Research Council). Sử dụng dòng tế bào này để sản xuất vắc xin có ưu điểm : - Tế bào MRC5 có nguồn gốc từ người nên sử dụng dòng tế bào này để sản xuất vắc xin sẽ hạn chế được nguy cơ dị ứng cho người. - Sử dụng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thì có thể chủ động và dễ mở rộng quy mô sản xuất. - Dòng tế bào này đã được kiểm tra chất lượng và cấp phép sản xuất nhiều loại vắc xin trên thế giới với chất lượng tốt. - Sử dụng dòng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thay thế cho quy trình sản xuất vắc xin từ tế bào thận khỉ sẽ tránh phải sử dụng động vật là nguyên liệu đầu vào cho sản xuất. Hiện nay, chỉ có một số hãng dược phNm lớn như Glaxo Smith Kline, Merck Sharp & Dohme, Aventis Pasteur sản xuất thành công vắc xin VGA trên tế bào lưỡng bội, nhưng giá thành rất cao. Hơn nữa, việc chuyển giao công nghệ sản xuất các loại vắc xin nói chung và vắc xin VGA nói riêng vào Việt Nam còn khó khăn. Để tiến tới tự lực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tế bào MRC5 ở Việt Nam nhằm đáp ứng được nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng cả về số lượng, chất lượng và giá thành, đề tài: “Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm” được tiến hành với 3 mục tiêu: 1. Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin viêm gan A. 2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm. 3. Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phm.

Bộ giáo dục và đào tạo – bộ quốc phòng

Học viện quân y

NGUYễN THị VÂN QUỳNH NGUYễN THị VÂN QUỳ NGUYễN THị VÂN QUỳNH NGUYễN THị VÂN QUỳNH NGUYễN THị VÂN QUỳNH

Lê thanh sơn

A Nghiên cứu áp dụng nội soi ổ bụng trong

B xác định tổn thương giảI phẫu bệnh và khả năng phẫu thuật ung thư 1/3 dưới dạ dày giai đoạn tiến triển

luận án tiến sĩ y học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHềNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN THN VÂN QUỲNH

Nghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạT Nghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạT TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM

luận án tiến sĩ y học

Hà nội - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Gíao sư, Tiến sĩ khoa học Nguyễn Thu Vân Nguyễn Thu Vân Nguyễn Thu Vân –––– Chủ tịch Hội đồng khoa học, Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1; Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt –––– Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 – là những người thầy hướng dẫn, luôn tận tình chỉ bảo và trực tiếp sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm

Chăn nuôi động vật thí nghiệm vật thí nghiệm vật thí nghiệm –––– Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành bản luận án này

Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm viêm gan vi rút, Trung tâm Dự phòng

và kiểm soát bệnh (CDC) đã giúp đỡ chúng tôi trong việc giải trình tự gen vi rút viêm gan A -HM175 hệ chủng gốc giống

Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã đóng góp công sức cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin dành tình cảm sâu nặng nhất cảm ơn gia đình, nguồn

động lực, luôn cổ vũ, động viên và chia sẻ, giúp tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, công tác và nghiên cứu

Nguyễn Thị Vân QuỳnhNguyễn Thị Vân QuỳnhNguyễn Thị Vân Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

công trình nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản

xuất vắc xin viêm gan A trên nuôi cấy tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm” Kết quả công trình này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là

chủ nhiệm đề tài Tôi đã được toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến

sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Vân Quỳnh

1.1 Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A 3 1.1.2 Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A 10

1.2 Các loại vắc xin viêm gan A và quy trình sản xuất 15 1.2.1 Các loại vắc xin viêm gan A 15 1.2.2 Tình hình sản xuất vắc xin viêm gan A ở Việt Nam 19 1.2.3 Quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi cấy tế

1.3 Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A 24 1.3.1 Kiểm tra nguồn nguyên liệu sử dụng cho sản xuất vắc xin 24 1.3.2 Kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản

1.3.3 Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5 37 2.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A

bất hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm 44 2.2.3 Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trên nuôi

cấy tế bào MRC5 trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phNm 48

3.1 Kết quả thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5 57 3.1.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy cho HAV HM175 trên tế bào

MRC5 trong môi trường có huyết thanh 57 3.1.2 Kết quả cấy truyền thích ứng 60 3.1.3 Kết quả sản xuất chủng giống và kiểm tra chất lượng chủng 60

3.2 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất

hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm 67 3.2.1 Kết quả nuôi cấy và chuNn bị tế bào MRC5 67

3.2.2 Kết quả gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút 68

3.3 Kết quả sản xuất thử nghiệm và kiểm tra chất lượng trong quá

3.3.1 Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất 73 3.3.2 Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 77

4.1.4 Kỹ thuật lựa chọn để thích ứng chủng 86 4.1.5 Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu 88

4.1.6 Chất lượng chủng giống vi rút viêm gan A cho sản xuất vắc xin 89

4.2 Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5 91 4.2.1 Quy trình nuôi cấy tế bào 92

4.3 Chất lượng vắc xin viêm gan A sản xuất thử nghiệm

4.4 Ưu điểm, hạn chế và tính mới của nghiên cứu

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

112

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh/ nghĩa tiếng việt

ADN Desoxyribonucleic acid (Axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

CDC Centers of Diseases Control and Prevention

(Trung tâm dự phòng và kiểm soát bệnh – Mỹ)

ECACC The European Collection of Cell Cultures

(Ngân hàng tế bào châu Âu)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(Kỹ thuật miễn dịch gắn men)

FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai)

FDA Food and Drug Administration

(Ủy ban Quản lý thực phNm và thuốc)

HAV Hepatitis A virus (Vi rút viêm gan A)

Ig Immunoglobulin (Globulin miễn dịch)

IRIVs Immunopotentiating Reconstituted Influenza Virosomes (Virosome vi rút cúm tái tạo có tính miễn dịch cao)

KD Kilodalton (Kilô dalton)

MCB Master cell bank (Tế bào giống gốc)

MEM Minimum Essential Medium (môi trường tối thiểu) MOI Multiplicity of Infection (Liều gây nhiễm)

MRC5 Medical Reseach Council 5 (Tế bào lưỡng bội phổi người) MSV Master seed virus (Chủng vi rút giống gốc)

MT Môi trường

P Passage (Đời cấy truyền)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PFU Plaque Forming Unit ( Đơn vị tạo đám hoại tử)

PPLO Pleuropneumonia Like Organism

SIV Simian Immunodeficiency virus

(Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở khỉ)VABIOTECH Công ty Vắc xin và Sinh phNm số 1

VGA Viêm gan A

WCB Working cell bank (Ngân hàng tế bào sản xuất)

WSV Working seed virus (Chủng vi rút giống sản xuất)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành 16 1.2 Các tiêu chuNn của vắc xin viêm gan A 30

3.1 Hiệu giá vi rút theo thời gian hấp phụ 59

3.2 Hiệu giá vi rút qua các đời cấy truyền 60

3.3 Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5 60

3.4 Kết quả kiểm tra vô khuNn chủng giống gốc (MSV) và

3.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá và tính ổn định chủng 64

3.6 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chủng 65

3.7 Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng 66

3.8 Hiệu giá vi rút ở các môi trường duy trì 68

3.9 Hiệu giá vi rút ở các liều khác nhau trên môi trường LH3E 69

3.10 Hiệu giá vi rút trên MRC5 ở môi trường không chứa huyết thanh 71 3.11 Nuôi cấy và chuNn bị tế bào MRC5 của các loạt sản xuất thử nghiệm 73

3.12 Hiệu giá vi rút của 3 loạt sản xuất thử nghiệm 74

3.13 Kết quả kiểm tra hiệu giá sau cô đặc thNm tích hỗn dịch vi rút 75

3.14 Kết quả kiểm tra bất hoạt vi rút 3 loạt vắc xin viêm gan A 75

3.15 Kết quả kiểm định các loạt bán thành phNm 76

3.16 Kết quả thử nghiệm vô khuNn 3 loạt vắc xin viêm gan A 77

3.17 Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin viêm gan A 78

3.18 Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột nhắt 78

3.19 Kết quả kiểm tra an toàn chung vắc xin trên chuột lang 79

3.20 Kết quả kiểm tra công hiệu của 3 loạt vắc xin 80

3.21 Kết quả kiểm tra các thành phần hóa học trong vắc xin 80

4.1 Các vắc xin vi rút sản xuất trên MRC5 84

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Hình ảnh vi rút viêm gan A dưới kính hiển vi điện tử 4

1.3 Cấu tạo hệ gen của vi rút viêm gan A 5

1.4 Sự nhân lên của vi rút viêm gan A trong tế bào gan 7

1.5 Diễn biến huyết thanh học trong bệnh viêm gan A 11 2.1 Tiêm phúc mạc kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang 52 2.2 Tiêm tĩnh mạch tai thỏ kiểm tra chất gây sốt 54

3.1 Hình ảnh vi rút viêm gan A trong tế bào MRC5 trên kính hiển vi điện tử 57 3.2 Nhận dạng vi rút viêm gan A bằng phương pháp RT-PCR 62

3.3 Hình ảnh vi rút viêm gan A chủng WSV trong tế bào MRC5 trên

kính hiển vi điện tử 62

3.4 Hình ảnh điện di sản phNm PCR kiểm tra Mycoplasma trong chủng giống MSV và WSV 63

3.5 ChuNn độ hiệu giá chủng bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử 64

3.6 Hình ảnh tế bào MRC5 qua các đời cấy chuyển 67

3.7 Máy Cogen Scale để cô đặc thNm tích vi rút viêm gan A 74

3.8 Hình ảnh kiểm tra bất hoạt vi rút trên tế bào 76

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1 Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm 58 3.2 Đường cong sinh trưởng của vi rút 58 3.3 Hiệu giá vi rút theo nhiệt độ nuôi cấy 59 3.4 Hiệu giá vi rút trong môi trường LH3E với các pH khác nhau 70

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.3 Thay môi trường và lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi rút 46 2.4 Tiêm vắc xin và theo dõi chuột trong kiểm tra an toàn chung 51 2.5 Tiêm vắc xin và lấy máu chuột trong kiểm tra công hiệu 55

Nhằm thực hiện chiến lược dự phòng viêm gan A, Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên

phát Maccaca mulatta Vắc xin này đã phát huy được tính hiệu quả, an toàn,

đáp ứng được phần lớn nhu cầu vắc xin viêm gan A trong nước [18], [24], [25] Tuy nhiên, công nghệ sản xuất vắc xin này còn một số hạn chế vì tế bào

thận khỉ Maccaca mulatta phải chọn lọc qua việc kiểm soát chặt chẽ các vi rút

ngoại lai, khó mở rộng về quy mô sản xuất

Xu hướng hiện nay trên thế giới là sử dụng vắc xin viêm gan A bất hoạt sản xuất trên tế bào lưỡng bội phổi người (MRC5 - Medical Research Council) Sử dụng dòng tế bào này để sản xuất vắc xin có ưu điểm :

- Tế bào MRC5 có nguồn gốc từ người nên sử dụng dòng tế bào này để sản xuất vắc xin sẽ hạn chế được nguy cơ dị ứng cho người

- Sử dụng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thì có thể chủ động và dễ

mở rộng quy mô sản xuất

- Dòng tế bào này đã được kiểm tra chất lượng và cấp phép sản xuất nhiều loại vắc xin trên thế giới với chất lượng tốt

- Sử dụng dòng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thay thế cho quy trình sản xuất vắc xin từ tế bào thận khỉ sẽ tránh phải sử dụng động vật là nguyên liệu đầu vào cho sản xuất

Hiện nay, chỉ có một số hãng dược phNm lớn như Glaxo Smith Kline, Merck Sharp & Dohme, Aventis Pasteur sản xuất thành công vắc xin VGA trên tế

bào lưỡng bội, nhưng giá thành rất cao Hơn nữa, việc chuyển giao công nghệ

sản xuất các loại vắc xin nói chung và vắc xin VGA nói riêng vào Việt Nam

còn khó khăn

Để tiến tới tự lực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tế bào MRC5 ở Việt

Nam nhằm đáp ứng được nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng cả về số

lượng, chất lượng và giá thành, đề tài: “Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm

gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm”

được tiến hành với 3 mục tiêu:

1 Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tế bào MRC5 để sản

xuất vắc xin viêm gan A

2 Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi

cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm

3 Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản xuất và

vắc xin thành ph m

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN

1.1 Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A

1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A

Vi rút VGA (Hepatitis A virus - HAV) được Feinstone phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 nhờ phương pháp hiển vi điện tử miễn dịch [1], [19] Đến năm 1979, Phillip J Provost và Maurice R Hilleman đã nuôi cấy thành công vi rút này trên tế bào và mở đầu cho nhiều nghiên cứu về vi rút cũng như phát triển vắc xin VGA [81]

1.1.1.1 Phân loại

Vi rút VGA thuộc họ Picornaviridae Họ này gồm các vi rút có kích

thước rất nhỏ, lõi chứa sợi ARN Từ “pico” theo tiếng La Tinh là nhỏ Tên gọi

Picornavirus được hình thành từ việc ghép hai từ trên đã nói lên đặc điểm sinh học cơ bản của họ vi rút này [21] Dựa trên đặc tính về trình tự gen và độ

nhạy với a xít, người ta chia Picornaviridae thành chín chi Trong đó, có năm chi gây bệnh cho người là: Enterovirus, Rhinovirus, Hepatovirus,

ở người thuộc kiểu gen I và III với 80% thuộc về kiểu gen I [43] Kiểu gen

IV, V và VI bao gồm các chủng phân lập từ khỉ [33]

1.1.1.2 Hình thái cấu trúc và sức đề kháng

Vi rút VGA có kích thước rất nhỏ, hình khối đa diện đều, đường kính 27-28 nm Lõi chứa ARN sợi đơn cấu tạo bởi 7500 nucleotit Vi rút VGA có

trọng lượng phân tử 2,5 triệu Dalton Protein cấu trúc gồm 04 chuỗi polypeptit: VP1, VP2, VP3, VP4 với trọng lượng phân tử khác nhau và tạo nên capsid đối xứng hình khối với 20 mặt là các tam giác đều Vi rút không

có vỏ bọc bên ngoài – là một vi rút trần [1], [21], [19], [43], [69], [102]

Hình 1.1 Hình ảnh vi rút viêm gan A dưới kính hiển vi điện tử (tỷ lệ 1/10 6

)

(Nguồn: theo WHO (2007) [94])

Hình 1.2 Cấu trúc vi rút viêm gan A

(Nguồn: theo Martin A (2006) [69])

Vi rút VGA có sức đề kháng cao, có thể tồn tại được ở nhiệt độ 600C trong 1 giờ, 100oC trong 5 phút, 37oC trong 72 giờ, nhiệt độ phòng trong 1 ngày Vi rút có thể bảo quản ở nhiệt độ từ -80oC đến -20oC trong nhiều năm

Tồn tại trong cồn 70o trong 3 phút và chịu được môi trường pH ≤ 3 trong 1 giờ, nhờ vậy vi rút VGA có thể vượt qua hàng rào dịch vị

Vi rút VGA bị bất hoạt khi tiệt trùng ướt ở 1210C/20 phút hoặc khô ở

1800C/1 giờ; formallin (1:4000 trong 72 giờ, 370C) [7], [19], [94]

1.1.1.3 Cấu tạo hệ gen

Cấu tạo hệ gen của vi rút VGA là sợi đơn ARN (+) bao gồm 7500 nucleotid với cấu trúc bậc 2, 3 phức tạp và một khung đọc mở (ORF – open reading frame) mã hóa cho tất cả các protein của vi rút

Hình 1.3 Cấu tạo hệ gen của vi rút viêm gan A

(Nguồn: theo Martin A (2006) [69])

Có ba phần chính trong bộ gen:

a) Đầu 5’ gồm 742 nucleotid không dịch mã, nối với protein VPg bằng liên kết đồng hóa trị Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5’ rất quan trọng, tạo thành điểm gắn với ribosom có vai trò điều khiển dịch mã polyprotein của vi rút

b) Khung đọc mở (ORF) nằm ở vị trí trung tâm gồm 6681 nucleotid mã hóa cho một polyprotein Polyprotein được mã hóa bởi 3 vùng P1-2A, 2BC,

P3 Vùng cấu trúc tiền P1-2A về sau sẽ được tách ra bởi proteaza của vi rút tạo thành VP4, VP2, VP1-2A và VP3 VP1-2A là protein cấu trúc quan trọng khi hình thành hạt vi rút

Khung đọc mở được dịch mã tạo ra polyprotein Polyprotein này sau đó được tách ra bởi một proteaza (3Cpro) để tạo thành 4 protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) và 7 protein không cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D) Kháng thể kháng vi rút VGA gắn vào VP1 và/hoặc VP3 [33], [60], [69], [94] c) Đầu 3’ không mã hóa, gồm 63 nucleotid

Protein VPg gắn với đầu 5’ ở đoạn đầu của gen ARN và đóng vai trò như là một protein khởi đầu cho sự tổng hợp ARN Đột biến vùng 5’ làm tăng khả năng thích ứng của vi rút VGA trong nuôi cấy tế bào [33], [54] Nghiên cứu của Atsuko Totsuka và Yasuo Moritsugu (1999) xác định được đột biến ở vùng 2B, 2C và 3A làm đNy nhanh quá trình nhân lên của vi rút khi thích ứng trên nuôi cấy tế bào [88]

Một hạt vi rút VGA là một hình khối 20 mặt bao gồm một ARN và 60 tiểu thể VP1, VP2, VP3 và VP4 của capsid Trình tự bộ gen của vi rút VGA gây bệnh trên người ở các khu vực khác nhau đã được xác định đầy đủ và cho thấy có sự tương đồng cao giữa các chủng này

1.1.1.4 Sự sao chép và nhân lên

Vi rút VGA sao chép và nhân lên hoàn toàn trong tế bào chất của tế bào gan theo cơ chế liên quan đến một ARN phụ thuộc ARN polymerase Vật liệu

di truyền ARN (+) của vi rút VGA có trình tự nucleotid giống với trình tự của mARN nên đảm nhiệm luôn chức năng của mARN để tổng hợp polyprotein Hạt vi rút trưởng thành có gen mã hóa cho ARN polymerase – là gen lớn nhất trong hệ gen và độc lập hoàn toàn với nhân tế bào chủ trong sao chép và phiên

mã

Hình 1.4 Sự nhân lên của vi rút viêm gan A trong tế bào gan

(Nguồn: theo Martin A (2006) [69]) Quá trình nhân lên của vi rút VGA trong tế bào chủ gồm các giai đoạn [69]:

a Vi rút nhận diện và gắn vào thụ cảm thể trên màng tế bào chủ

b Sợi ARN (+) được giải phóng vào tế bào chất

c Khởi đầu quá trình dịch mã là một ribosom nội bào vào vị trí 5’của gen

để dịch mã tạo chuỗi polyprotein của vi rút

d Chuỗi polyprotein tiếp tục dịch mã đồng thời nhờ protease của vi rút phân cắt thành các phân tử nhỏ có chức năng khác nhau như protein cấu trúc tạo capsid, ARN polymerase, protease, VPg

e Tổng hợp sợi ARN (-) bổ sung trên ARN (+) khuôn mẫu, bắt đầu từ đầu 3’với sự tham gia của ARN polymerase

f Sợi ARN (-) vừa được sao chép làm khuôn để tổng hợp ra nhiều sợi ARN (+) mới của vi rút

g ARN (+) mới được tổng hợp có thể làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN (-) rồi từ đó tổng hợp nhiều sợi ARN hoặc dùng làm mARN để tổng hợp polyprotein

h Lắp ráp sợi ARN (+) với protein cấu trúc để tạo ra hạt vi rút mới

i Hạt vi rút mới nNy chồi qua những vị trí trên màng tế bào chủ ra ngoài

Vi rút viêm gan A trong nuôi cấy tế bào:

Nuôi cấy vi rút VGA trên tế bào giữ vai trò quan trọng trong nghiên cứu vi rút này Để có thể phát triển trên các tế bào ngoài tế bào đích (tế bào gan), vi rút VGA cần phải trải qua quá trình thích ứng với sự tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào Năm 1979, Phillip J Provost và Maurice R Hilleman là những người đầu tiên nuôi cấy thành công vi rút này trên tế bào [81] Vi rút

VGA khác với Enterovirus khác ở quá trình nhân lên chậm, kéo dài, thường

không gây hủy hoại tế bào và sản lượng vi rút thấp Do đó, việc nhân nuôi vi rút để sản xuất vắc xin gặp nhiều khó khăn [28], [73], [80], [81] Các nghiên cứu đột biếnthích ứng vi rút VGA trên nuôi cấy tế bào đã được tiến hành và qua đó, phân lập được các chủng có khả năng nhân lên trên nuôi cấy tế bào [29], [45], [35], [69], [81], [52], [55], [86], [100] Do vậy cho đến năm 1995, vắc xin VGA bất hoạt đầu tiên mới được cấp phép sử dụng trên người

Phương pháp thích ứng chủng vi rút VGA trên tế bào: Hầu hết các

chủng vi rút VGA trong sản xuất vắc xin trên thế giới là kết quả của quá trình cấy truyền liên tiếp chủng trên tế bào và hoặc trên mô của động vật Từ các chủng vi rút VGA gây bệnh thành dịch, qua quá trình cấy truyền liên tiếp đã tạo được chủng giảm độc lực, nhưng vẫn còn giữ được tính kháng nguyên có khả năng sinh miễn dịch bảo vệ [29], [50], [55], [86]

Funkhouser A W và cộng sự (1999), khi nghiên cứu sự nhân lên của vi rút VGA trên tế bào MRC5 để xác định yếu tố hạn chế sự nhân lên của vi rút Tác giả đã phát hiện thấy vi rút VGA chủng HM175 sử dụng để sản xuất vắc xin có 4 đột biến tự nhiên ở vùng 5’, những đột biến này xảy ra khi chủng HM175 được cấy truyền trên MRC5 Các chủng HM175 này có khả năng nhân lên tốt trên tế bào MRC5 [53] Nuôi cấy vi rút VGA trên dòng tế bào lưỡng bội MRC5 là một tiến bộ quan trọng trong sản xuất vắc xin VGA [52], [83], [91] Vi rút VGA sao chép và nhân lên trong tế bào MRC5 qua các giai đoạn : tổng hợp các hạt vi rút VGA trưởng thành xuất hiện vào ngày thứ 2 - 4

sau gây nhiễm và đạt hiệu giá cao nhất vào ngày thứ 8 Từ ngày thứ 14 sau gây nhiễm, khi vi rút nhân lên đã đạt đến mức ổn định, sự tổng hợp ARN vi rút giảm dần Sự nhân lên của vi rút VGA không làm gián đoạn quá trình tổng hợp protein, ADN, ARN cũng như không gây hủy hoại tế bào trong thời gian

ủ kéo dài Những điều này liên quan tới sự nhân lên kéo dài của vi rút trong nuôi cấy trên tế bào Vi rút được giải phóng ra khỏi tế bào theo cơ chế nNy chồi [35] Do đó các chủng vi rút VGA trong nuôi cấy tế bào được đặc trưng bởi việc giải phóng khoảng 30- 50% vi rút (vi rút ngoại bào) và có một số lượng lớn 50-70% các vi rút nằm trong tế bào – đây chính là nguyên liệu để tinh chế thành vắc xin [65], [87], [74], [78], [79]

Sự nhân lên của vi rút VGA trên tế bào được xác định bằng việc phát hiện kháng nguyên hoặc phát hiện vi rút Hiệu suất nuôi cấy vi rút thu được phụ thuộc vào một số điều kiện nuôi cấy như : nhiệt độ, thời gian, môi trường nuôi cấy và liều vi rút gây nhiễm Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp dao động từ 32 đến 35oC Liều gây nhiễm 0,05-0,1 PFU/tế bào tùy từng công nghệ sản xuất [29], [83], [77], [101],[52], [36], [100], [29], [59]

Vi rút VGA phân lập từ người đã được nuôi cấy thành công trên các dòng tế bào khác nhau và sử dụng cho sản xuất cả hai loại vắc xin

VGA bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực [18], [61], [80], [82]

1.1.1.5 Kháng nguyên và tính sinh miễn dịch

Tính kháng nguyên của vi rút VGA phụ thuộc vào hình thái của hạt vi rút Hạt vi rút nguyên vẹn có tính kháng nguyên cao, nhưng nếu hạt vi rút không nguyên vẹn thì tính kháng nguyên của nó trở nên rất thấp Tính kháng nguyên của hạt vi rút VGA nguyên vẹn tương tự như tính kháng nguyên của một hạt rỗng [30]

Các kháng nguyên quan trọng kích thích sản xuất kháng thể trung hòa nằm tập trung ở VP1 (Ser 102 và Ser 114) và VP3 (Asp 70) trên capsid [33]

Vi rút VGA bị trung hòa bởi cả hai kháng thể IgG anti-HAV và IgM anti-HAV Không thấy phản ứng chéo về huyết thanh giữa vi rút VGA và các

vi rút viêm gan khác Vi rút VGA chỉ có một týp huyết thanh đã được xác định và nhiễm trùng tự nhiên sẽ tạo miễn dịch bền vững Các chủng vi rút khác nhau cho phản ứng giống nhau đối với kháng thể đơn dòng kháng vi rút VGA Đây là cơ sở miễn dịch để có thể sản xuất vắc xin VGA từ nhiều loại chủng vi rút VGA khác nhau [94]

1.1.2 Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A

1.1.2.1 Khả năng gây bệnh

Đường lây bệnh chủ yếu của vi rút VGA là đường phân – miệng Sau khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, vi rút vào máu sau đó nhân lên ở tế bào gan [1], [19] Một số đường lây nhiễm khác nhưng hiếm gặp cũng đã được đề cập tới như: đường máu, tình dục đồng giới nam [43], [49], [72], [85]

Diễn biến lâm sàng của VGA cấp tính thường không phân biệt được với các loại viêm gan vi rút khác Thể lâm sàng biểu hiện ở các giai đoạn tiền cấp tính (thời kỳ khởi phát) với triệu chứng sốt, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn, khó chịu ở bụng Thời kỳ cấp tính (toàn phát) biểu hiện lâm sàng gồm vàng

da, gan to và đau kéo dài khoảng hai tuần Mức độ nghiêm trọng và tỷ lệ tử vong tăng dần theo nhóm tuổi Diễn biến nặng nhất của bệnh là VGA tối cấp, chiếm khoảng 0,3% số bệnh nhân với triệu chứng đặc trưng là suy giảm nhanh chóng chức năng gan, tỷ lệ tử vong rất cao Bệnh VGA thường phục hồi chậm với cảm giác mệt mỏi, buồn nôn, chán ăn kéo dài Hiện nay chưa có thuốc kháng vi rút đặc hiệu [4], [19], [21], [89]

1.1.2.2 Đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vi rút viêm gan A

Đáp ứng miễn dịch tự nhiên với vi rút VGA rất phức tạp và có sự tham gia của một vài thành phần khác nhau trong hệ miễn dịch Có bằng chứng cho thấy tế bào giết tự nhiên (NK - natural killer), tế bào T gây độc và các kháng

thể được sản xuất ra từ dòng tế bào B tham gia vào đáp ứng miễn dịch với nhiễm vi rút VGA Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Lemon S (1993), chỉ riêng kháng thể dịch thể cũng đủ khả năng bảo vệ không bị bệnh VGA trên lâm sàng [64] Đáp ứng miễn dịch dịch thể liên quan chủ yếu đến kháng thể trung hòa Kháng thể này bao gồm hai lớp IgG và IgM Sự có mặt của IgM kháng vi rút VGA chứng tỏ bệnh nhân đang ở thời kỳ cấp tính của bệnh Sự xuất hiện và tồn tại của mỗi loại kháng thể trên được tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân từ giai đoạn khởi phát đạt cao nhất 7 - 21 ngày, và thường biến mất trong vòng một đến hai tháng Tuy nhiên, một số trường hợp hiếm gặp, chúng có thể tồn tại nhiều tháng sau khi bệnh nhân đã khỏi hoàn toàn [63], [93], [97], [73] Ngoài IgM kháng vi rút VGA, người ta còn thấy IgG kháng vi rút VGA Kháng thể này cũng bắt gặp từ giai đoạn khởi phát của bệnh và kéo dài trong nhiều năm Sự có mặt của IgG kháng vi rút VGA chứng

tỏ bệnh nhân đang hoặc đã mắc VGA trong quá khứ Như vậy, ở giai đoạn phục hồi, IgG kháng vi rút VGA trở thành chủ yếu và tồn tại rất lâu, có khả năng chống tái nhiễm [51], [63], [73], [93], [97]

Hình 1.5 Diễn biến huyết thanh học trong bệnh viêm gan A

(Nguồn: Nguyễn Thu Vân (2002) [22])

1.1.2.3 Tình hình nhiễm vi rút viêm gan A

* Trên thế giới: Vi rút VGA phổ biến ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới

Tỷ lệ nhiễm vi rút VGA khác nhau ở các khu vực, dao động từ 15 – 100% dân

số và có liên quan chặt chẽ với tình trạng kinh tế, xã hội và vệ sinh môi trường Ước tính có khoảng 1,5 triệu người mắc VGA cấp tính hàng năm và

số lượng nhiễm trùng vi rút VGA thật sự có thể cao hơn gấp 10 lần [24], [25], [33], [37, 51] Trong khi nhiễm vi rút VGA ở trẻ em thường không có triệu chứng thì ở người lớn, tỷ lệ có triệu chứng tăng dần theo tuổi Với nhóm bệnh nhân VGA, tỷ lệ vàng da ở trẻ dưới 6 tuổi khoảng 10%; ở trẻ lớn hơn và người lớn, tỷ lệ này khoảng 70% [4], [19], [22], [70] Những nước có mức độ lưu hành thấp, nhiễm vi rút VGA xảy ra chủ yếu ở những người có nguy cơ cao (người đi vào vùng dịch, nhân viên khoa truyền nhiễm, giáo viên nhà trẻ, công nhân vệ sinh môi trường) Những nước có mức độ lưu hành trung bình, nhiễm vi rút VGA xảy ra trong toàn bộ cộng đồng và rải rác có các vụ bùng

nổ dịch Những nước có mức độ lưu hành cao, nhiễm vi rút VGA gặp nhiều ở ngay cả trẻ dưới 10 tuổi và thường không có triệu chứng [22], [27], [56] ,[57], [75]

* Ở Việt Nam: Việt Nam là nước có mức độ lưu hành cao của vi rút VGA

Theo các nghiên cứu dịch tễ, tỷ lệ nhiễm vi rút VGA trong cộng đồng là 97%

Tỷ lệ này tăng dần theo nhóm tuổi, từ 62% (ở nhóm dưới 5 tuổi) tới gần 100% (ở nhóm trên 10 tuổi) Một số tác giả khác cũng cho kết quả tương tự [5], [7]

Tỷ lệ IgM anti-HAV ở các bệnh nhân viêm gan cấp tại các bệnh viện theo một

số nghiên cứu trong nước giao động từ 36,89 – 51,35% [7]

1.1.3 Các biện pháp dự phòng

Dự phòng VGA cần phải xem xét đến các yếu tố sinh miễn dịch và các đường lây chính của bệnh Có hai biện pháp cơ bản là ngăn chặn sự xâm nhập của vi rút VGA vào cơ thể và tạo miễn dịch với vi rút VGA [1], [9], [19], [22], [51]

1.1.3.1 Dự phòng không đặc hiệu

Vệ sinh cá nhân: rửa tay trước khi ăn hoặc chế biến thực phNm và sau khi đi vệ sinh Không để thức ăn, nước uống, bàn tay và vật dụng ăn uống bị nhiễm bởi phân của bệnh nhân ở giai đoạn ủ bệnh Vệ sinh môi trường có ý nghĩa rất quan trọng Việc sử dụng nguồn nước sạch, vệ sinh thực phNm, xử lý

và quản lý chất thải tốt sẽ hạn chế nguy cơ lây nhiễm vi rút VGA qua đường tiêu hóa [1], [19], [99]

1.1.3.2 Dự phòng đặc hiệu

* Miễn dịch thụ động (dự phòng bằng globulin miễn dịch)

Globulin miễn dịch (Ig) – là một hỗn hợp kháng thể chống lại các bệnh nhiễm trùng đặc biệt là VGA Biện pháp này được áp dụng cho những đối tượng đã có phơi nhiễm với vi rút VGA nhưng chưa được tiêm vắc xin hoặc những người chưa phơi nhiễm với vi rút VGA nhưng sắp đi vào vùng có vi rút VGA lưu hành cao Có thể dùng một liều đơn tiêm bắp 0,02 ml/kg và một liều vắc xin ở vị trí giải phẫu đối diện [1], [8], [19], [49]

Những người cần có miễn dịch bảo vệ đối với VGA nhưng bị dị ứng với các thành phần của vắc xin, phụ nữ mang thai hoặc những người mắc bệnh suy giảm miễn dịch, viêm gan mạn hoặc các bệnh mạn tính khác có thể dùng globulin miễn dịch Tiêm globulin miễn dịch trong vòng hai tuần sau phơi nhiễm sẽ ngăn ngừa sự phát triển hoặc giảm mức độ trầm trọng của bệnh Tuy nhiên, Ig chỉ tạo ra sự bảo vệ trong khoảng sáu tháng sau khi sử dụng một liều đơn 100UI và giảm khả năng bảo vệ đối với mũi tiêm cho lần phơi nhiễm sau [49]

Dự phòng bằng globulin miễn dịch tuy có hiệu quả cao nhưng không thực tế ở những đối tượng có phơi nhiễm nhiều lần với vi rút VGA Tác dụng bảo vệ cũng không lâu dài (được 4-6 tháng tùy lượng kháng thể đưa vào), hơn nữa globulin miễn dịch cũng không sẵn có Muốn bảo vệ kéo dài hơn thì dùng

lại liều khác sẽ phức tạp, đòi hỏi kinh phí lớn và ít có giá trị phòng bệnh cho cộng đồng Globulin miễn dịch có thể ảnh hưởng tới các vắc xin sống giảm độc lực (sởi, quai bị, Rubella, Varicella ) Do vậy sau khi tiêm globulin miễn dịch, phải trì hoãn ít nhất là ba tháng đối với vắc xin sởi, quai bị, Rubella - MMR và năm tháng đối với vắc xin Varicella Không tiêm globulin miễn dịch trong vòng hai tuần sau gây miễn dịch bằng vắc xin sống giảm độc lực [8], [49]

* Miễn dịch chủ động (dự phòng bằng vắc xin)

Vắc xin VGA bất hoạt được đăng ký sử dụng lần đầu tiên vào năm

1995 Hiện nay có ít nhất 4 loại vắc xin bất hoạt (Havrix, Vaqta, Epaxal và Avaxim) được cấp phép sử dụng trên thế giới Vắc xin VGA an toàn, có tính sinh miễn dịch cao và tạo ra sự bảo vệ lâu dài (20 năm) Vắc xin này có thể được tiêm đồng thời với một số vắc xin khác (bạch hầu, bại liệt, uốn ván, thương hàn uống, tả, viêm não Nhật Bản, dại, sốt vàng và viêm gan B) mà không ảnh hưởng tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh [9], [24], [49]

Trong những năm gần đây, nhiều nước đã áp dụng tiêm vắc xin VGA như một biện pháp dự phòng có hiệu quả Mức độ kháng thể bảo vệ từ 20mIU/ml trở lên là đủ khả năng bảo vệ cá thể Hơn 95% người lớn và trẻ em

có đáp ứng miễn dịch sau mũi tiêm đầu tiên và hiệu giá kháng thể kéo dài sau mũi tiêm nhắc lại 6 tháng sau đó [24], [25], [67], [71] Hiệu giá kháng thể trung hòa giao động trong khoảng 1:320 đến 1:1280 sau khi tiêm vắc xin Kháng thể bảo vệ do vắc xin tạo ra tồn tại trong nhiều năm trong khi kháng thể này khi dùng globulin miễn dịch chỉ trong vòng 6 tháng và hiệu giá rất thấp (1:10 – 1:40) Lượng kháng thể này đã được chứng minh là có hiệu lực phòng VGA lâm sàng khi có tiếp xúc với vi rút [24], [25], [32] Nghiên cứu của Fenn P (1998) so sánh chi phí của việc sử dụng vắc xin VGA bất hoạt với globulin miễn dịch để bảo vệ du khách phòng bệnh VGA thấy rằng, chi phí

dự kiến của tiêm vắc xin là thấp hơn năm lần so với dùng globulin miễn dịch tại các khu vực có nguy cơ trong 10 năm [47]

1.2 Các loại vắc xin viêm gan A và quy trình sản xuất

1.2.1 Các loại vắc xin viêm gan A

Nuôi cấy thành công vi rút VGA trên tế bào (in vitro) mở ra sự phát triển các vắc xin VGA sống giảm độc lực và bất hoạt Vắc xin VGA được đăng ký sử dụng lần đầu tiên tại Mỹ năm 1995, hiện nay một số nước đã sản xuất vắc xin phòng VGA bất hoạt toàn tế bào như Mỹ, Bỉ, Nhật Bản Tính an toàn và hiệu lực đáp ứng miễn dịch của các vắc xin này đã được thử nghiệm

Ở Trung Quốc và một vài nước đã tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm vắc xin sống, giảm độc lực [103]

Các hướng nghiên cứu khác cho phát triển vắc xin bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật ADN thông thường hay công nghệ tái tổ hợp để có được vắc xin tiểu đơn vị, capsid rỗng, peptit tổng hợp Vắc xin polypeptit tái tổ hợp tạo ra bằng công nghệ tái tổ hợp ADN để cài đặt gen mã hoá của các protein VP0, VP1, VP3 vào vector biểu hiện (vi rút, vi khuNn, nấm men) để tạo ra các polypeptit tương ứng Tuy nhiên các vắc xin này đang nghiên cứu và chưa được đưa vào sử dụng [84]

Bảng 1.1 Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành

(Glaxo Smith Kline)

HAVRIXTM 720 Junior

(Glaxo Smith Kline)

TWINRIXTM

(Glaxo Smith Kline )

20 µg HBsAg

TWINRIXTM Junior

(Glaxo Smith Kline )

ly giải tạo thành dạng hỗn dịch và tinh chế thông qua quy trình siêu lọc, sắc

ký lọc gel Vi rút được bất hoạt bằng formallin 250 µg/ml trong 15 ngày ở

370C và sau đó được hấp phụ trên hydroxit nhôm Có hai loại hàm lượng kháng nguyên 1440EU/1ml/1 cho người lớn và 720EU/0,5ml/1 cho trẻ em lưu

hành trên thị trường [49]

VAQTA là vắc xin VGA do hãng Merck Sharp & Dohme sản xuất

Chủng gốc giống để sản xuất là biến chủng F'(p18) của chủng CR326 Đây là chủng đã được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người và là chủng giảm độc lực tốt, an toàn Chủng HAV CR326 F’ được nuôi cấy trên tế bào MRC5

trong bình nuôi cấy với microcarrier, sau đó tách chiết bằng dung môi hữu cơ

và cô đặc bằng phương pháp tủa với polyethylen glycol Vi rút được tinh chế bằng phương pháp sắc ký và bất hoạt với formallin trong 5 ngày ở 370C, sau

đó được hấp phụ với hydroxit nhôm Kháng nguyên vi rút VGA của vắc xin

có tính tinh khiết cao và ổn định qua quá trình bất hoạt bằng formallin Hàm lượng kháng nguyên là 50 đơn vị kháng nguyên/1ml/1liều người lớn (≥18 tuổi) và 25 đơn vị kháng nguyên/1 liều trẻ em (từ 2 – 17 tuổi), lịch tiêm là 0 –

6 tháng Những nghiên cứu về tính an toàn và tính gây miễn dịch của vắc xin này cũng cho kết quả không khác biệt đáng kể so với HAVRIX [28], [49], [74]

AVAXIM là vắc xin của hãng Pasteur Merieux (Pháp) được cấp phép năm 1997 và sử dụng ở Pháp, Hà Lan, Thụy Điển và Anh Đây là vắc xin VGA tinh khiết bất hoạt toàn tế bào, sản xuất từ chủng GBM nuôi cấy trên tế bào MRC5 Vi rút được bất hoạt bằng formallin 1:4000 ở 37oC trong 14 ngày, hấp phụ với hydroxit nhôm Mỗi liều vắc xin chứa 160 đơn vị kháng nguyên/0,5ml/1 liều người lớn và 80 đơn vị kháng nguyên/1ml/1 liều trẻ em [74]

EPAXAL là vắc xin VGA tinh khiết bất hoạt toàn tế bào, sản xuất từ chủng RG-SB nuôi cấy trên tế bào MRC5 và hấp phụ với visosome vi rút cúm Visosome này sẽ vận chuyển kháng nguyên tới những tế bào có thNm quyền miễn dịch Công ty Crucell (Thụy Sĩ) đã nghiên cứu kỹ thuật kết hợp

để tạo thành IRIVs (Immunopotentiating Reconstituted Influenza Virosomes) trong sản xuất vắc xin viêm gan IRIVs là các liposome lecithin phospholipid cấu trúc màng đôi có gắn các phân tử bề mặt haemagglutinin của vi rút cúm

Vi rút VGA bất hoạt sau đó được hấp phụ với IRIVs tạo thành virosome có mang kháng nguyên vi rút VGA Trong cơ thể, các virosome nhanh chóng kết hợp với receptor tương ứng của đại thực bào và receptor của tế bào lympho B,

kích thích tế bào lympho B nhân lên Trong endosome của đại thực bào, peptit liên hợp của heamagglutinin cúm hoạt động, giúp liposome sau khi bị thực bào có thể hòa trực tiếp vào màng endosome, trình diện kháng nguyên lên bề mặt tế bào Trình diện kháng nguyên tăng cường và sự kích thích lần lượt tế bào lympho T sẽ kích hoạt tế bào lympho B sản xuất ra kháng thể kháng lại vi rút VGA Vắc xin này được dung nạp tốt do cấu trúc virosome không gây phản ứng lạ trong cơ thể [74]

Nhìn chung, bốn loại vắc xin VGA bất hoạt đang được sử dụng trên thế giới là HAVRIX, VAQTA, AVAXIM và EPAXAL đều được sản xuất từ chủng vi rút đã được thích ứng trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội phổi người Qui trình cơ bản trong sản xuất các vắc xin này là: nhân nuôi vi rút VGA trên tế bào MRC5, tinh chế vi rút từ tế bào đã được ly giải, bất hoạt bằng formallin

và hấp phụ với hydroxit nhôm Mặc dù chưa có chuNn quốc tế để xác định hàm lượng kháng nguyên vi rút VGA trong vắc xin và mỗi nhà sản xuất đã phát triển phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên trong vắc xin và xây dựng tiêu chuNn cơ sở cho thông số này Tuy nhiên các vắc xin này tạo ra gần 100% kháng thể bảo vệ trong 1 tháng sau tiêm liều thứ nhất Cả bốn loại vắc xin trên có sự tương đồng về hiệu lực bảo vệ cũng như tác dụng phụ Các vắc xin thường được dùng theo đường tiêm và một liệu trình gồm 2 liều cách nhau 6 -18 tháng Liều vắc xin, lịch tiêm, lứa tuổi được cho phép tiêm vắc xin

và thành phần kháng nguyên trong vắc xin dùng cho trẻ em và người lớn khác nhau theo từng hãng sản xuất Không có vắc xin VGA nào được sử dụng cho trẻ em dưới 1 tuổi [74], [26]

1.2.1.2 Vắc xin sống giảm độc lực

Một số chủng vi rút VGA giảm độc lực trong quá trình thích nghi với

sự phát triển nuôi cấy tế bào Các chủng này được sử dụng để làm vắc xin

Vắc xin VGA sống giảm độc lực đã được phát triển, sản xuất và cấp phép sử dụng trong chương trình tiêm chủng ở Trung Quốc Hai chủng H2 và LA-1 đã được phát triển từ các chủng phân lập ở 2 trẻ em bị viêm gan Các chủng này được làm giảm độc lực bằng cách cấy truyền 25 lần trên nuôi cấy tế bào Chủng giảm độc lực sau đó được nuôi cấy trên nguyên bào sợi phổi người lưỡng bội KMB-17 Sau khi tinh chế vắc xin được bổ sung các chất phụ gia (trehalose, sodium glutamate, argine và dextran) để ổn định hiệu giá vi rút khi đông khô Hơn 10 triệu liều vắc xin sống từ chủng H2 và LA1 được sử dụng hàng năm ở Trung Quốc Vắc xin VGA sống từ chủng H2 đã đáp ứng được tiêu chuNn quốc gia Trung Quốc và của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) Ở Ấn

Độ vắc xin VGA sống sản xuất từ chủng H2 được cấp phép vào năm 2005 [51], [96]

Một số thử nghiệm lâm sàng vắc xin VGA sống giảm độc lực chủng H2 cho kết quả an toàn, tạo ra hiệu quả bảo vệ lâu dài đối với nhiễm vi rút VGA

và không có sự khác biệt khi so sánh với vắc xin bất hoạt [36], [68]

1.2.2 Tình hình sản xuất vắc xin viêm gan A ở Việt Nam

Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành vi rút VGA cao, theo các nghiên cứu tỷ lệ mang IgG anti-HAV trong quần thể người trưởng thành tới

95 – 100% Viêm gan A có thể gây thành những vụ dịch lớn trong cộng đồng,

có thời gian bệnh kéo dài và chi phí điều trị cao Phòng bệnh bằng vắc xin là biện pháp chủ động có hiệu quả, do đó nhu cầu dùng vắc xin VGA trong nước rất lớn

Năm 2002 Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin VGA bất hoạt từ

nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta (PMMK) Qui trình sản

xuất vắc xin trên tế bào thận khỉ tiên phát gồm: gây nhiễm chủng sản xuất HM175 vào tế bào thận khỉ tiên phát l lớp Các tế bào thận khỉ dùng trong sản

xuất vắc xin VGAkhông nhiễm các vi rút ngoại lai và đạt yêu cầu về chất lượng cho sản xuất vắc xin Kết thúc giai đoạn nuôi cấy tiến hành đông tan 3 lần và thu hoạch vi rút giải phóng ở nước nổi Cô đặc vi rút bằng màng siêu lọc Millipore Pellicon Cassette Bất hoạt vi rút bằng formallin 1/2000 ở 370C/96 giờ Lọc vô khuNn, hấp phụ với hydroxit nhôm, pha và kiểm tra chất lượng vắc xin Vắc xin VGA do Việt Nam sản xuất có tên thương mại là Havax [24], [25] Các kết quả thử nghiệm phòng thí nghiệm, thực địa lâm sàng cho kết quả tốt về tính an toàn và sinh miễn dịch [5], [25] Hiện nay vắc xin này đang được sử dụng tại Việt Nam với khoảng 300.000 liều mỗi năm Tuy nhiên sản xuất vắc xin này phải phụ

thuộc vào nguồn tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta có hạn, do đó hạn

chế trong việc mở rộng sản xuất với quy mô lớn

1.2.3 Quy trình sản xuất vắc xin viêm gan bất hoạt A trên nuôi cấy tế bào MRC5

Hiện nay, các vắc xin VGA trên nuôi cấy tế bào chủ yếu là sử dụng tế bào lưỡng bội phổi người

Quy trình sản xuất : Chủng vi rút VGA thường được nuôi cấy trên dòng tế

bào lưỡng bội phổi người (tế bào MRC5), sử dụng môi trường nuôi cấy thích hợp Hỗn dịch vi rút được thu hoạch, hộn lại, tinh sạch, bất hoạt, bổ sung chất bảo quản, lọc, pha loãng, bổ sung tá chất và đóng lọ theo quy trình đã được phê duyệt Các bước chính của quy trình sản xuất vắc xin VGA trên nuôi cấy

tế bào bao gồm:

+Nhân nuôi tế bào: chai nuôi cấy tế bào một lớp hoặc hệ thống chai lăn

(roller bottle) là một trong những giải pháp được sử dụng để nhân nuôi tế bào

Để tăng hiệu suất và mở rộng quy mô sản xuất, các chai khuấy (spinner flask) hoặc hệ thống nuôi cấy sinh khối (bioreactor) được sử dụng Các tiểu giá thể (microcarrier) trong hệ thống nuôi cấy sinh khối là một giải pháp tiên tiến cho phép tăng diện tích bề mặt bám dính của tế bào, từ đó làm tăng số lượng tế

bào lên nhiều lần để tạo ra một lượng kháng nguyên vi rút tối ưu [6], [34], [77], [78], [101]

Theo hướng dẫn của Ngân hàng tế bào châu Âu, tế bào MRC5 được nhân nuôi trước khi gây nhiễm vi rút là môi trường MEM có bổ sung huyết thanh động vật Huyết thanh được sử dụng là huyết thanh bào thai bê (FBS) Huyết thanh này phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng sử dụng trong quá trình sản xuất các chế phNm sinh học sử dụng cho người Nhiệt độ nuôi cấy tế bào MRC5 là 370C Thời gian nuôi cấy tế bào tùy thuộc vào nồng độ tế bào đưa vào nuôi cấy ban đầu và dao động từ 3-4 ngày Thời gian nuôi cấy sẽ kết thúc khi tế bào mọc kín 80-85% trên chai nuôi cấy hoặc trên hạt microcarrier

Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy bao

gồm: kiểm tra vô khuNn, kiểm tra Mycoplasma, kiểm tra các vi rút ngoại lai,

kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu

+ Gây nhiễm và nhân nuôi vi rút: gây nhiễm vi rút vào tế bào được tiến hành

ở cuối pha sinh trưởng (pha log) Hiệu suất vi rút phụ thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, liều lượng vi rút gây nhiễm, thời gian và số lần thu hoạch Đây là “bí quyết” công nghệ của các hãng sản xuất nên không có được nhiều thông tin về vấn đề này Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp dao động từ 32 đến 35oC [28] Liều gây nhiễm 0,05- 0,1 PFU/tế bào tùy từng hãng sản xuất [77], [101]

Sau gây nhiễm, vi rút VGA sẽ nhân lên trong tế bào MRC5, sau đó giải phóng ra nước nổi đồng thời có một số lượng lớn vi rút nằm trong tế bào Trong giai đoạn này việc lựa chọn môi trường duy trì và pH thích hợp cho vi rút phát triển là rất quan trọng Nước nổi nuôi cấy tế bào qua các mẻ gặt đơn

và tế bào MRC5 chứa vi rút ở cuối giai đoạn nuôi cấy sẽ là nguyên liệu để tinh chế thành vắc xin Kết quả của quá trình nuôi cấy vi rút sẽ được đánh giá bằng các phương pháp xác định hiệu giá vi rút VGA [78], [79]

+ Tinh sạch vi rút

- Nước nổi từ các mẻ gặt đơn và tế bào MRC5 chứa vi rút được tinh sạch nhằm loại bỏ các mảnh vỡ của xác tế bào và giữ lại các hạt vi rút nguyên vẹn Phương pháp được sử dụng trong tinh sạch hỗn dịch tế bào là ly tâm Ly tâm với tốc độ thấp là phương pháp thường được các nhà sản xuất áp dụng

Ly tâm chỉ giúp loại trừ các mảnh vỡ tế bào có kích thước lớn Đối với các mảnh vỡ có kích thước nhỏ trên dưới 1µm, cần được loại bỏ bằng các hệ thống lọc sử dụng màng siêu lọc

- Cô đặc và tinh khiết:đối với các vắc xin sản xuất trên nuôi cấy tế bào,

cô đặc và tinh khiết kháng nguyên vi rút là những quy trình thường xuyên được tiến hành Một vài phương pháp hiện được nhiều nhà sản xuất sử dụng

là cô đặc bằng siêu lọc và thNm tích Cụ thể, sử dụng hệ thống bơm để đảm bảo áp lực dòng chảy và áp lực nén trên màng Các protein có trọng lượng phân tử lớn hơn giới hạn trọng lượng phân tử của màng siêu lọc sẽ được giữ lại, còn muối, nước và các phân tử có trọng lượng thấp hơn sẽ thoát ra khỏi màng Cuối cùng protein đích sẽ được cô đặc và tinh chế ở một mức độ nhất định Thông thường sử dụng phương pháp siêu lọc để làm giảm thể tích trước khi thNm tích Sau quá trình thNm tích sản phNm còn lại trong màng chứa protein đích và loại bỏ được nước cũng như các thành phần vô cơ, các phân tử trọng lượng thấp [6], [76]

- Tinh chế vi rút VGA liên kết trong tế bào: quá trình tinh chế nhằm

loại bỏ mảnh vỡ của tế bào và các yếu tố tăng trưởng được sử dụng trong quá trình nuôi cấy vi rút để thu được hạt vi rút VGA nguyên vẹn với độ tinh khiết cao Các nghiên cứu gần đây khẳng định có hơn 70% sản lượng vi rút và kháng nguyên có trong cặn tế bào Đây là nguồn chính để thu hoạch vi rút VGA trong sản xuất [59]

Tinh chế vi rút bằng các phương pháp khác nhau như siêu âm tế bào, tách chiết với dung môi hữu cơ (2% Triton X100 hoặc các dung dịch đệm, chất tNy) để tinh sạch và tách chiết bào tương, sau đó ly tâm thu nước nổi, sắc

ký trao đổi ion và cuối cùng là sắc ký lọc qua gel [31], [34], [79],[87], [78], [77]

+ Bất hoạt vi rút: Hầu hết các vắc xin VGA đang sử dụng được bất hoạt bằng

formallin Nhiệt độ và thời gian bất hoạt thay đổi theo mỗi loại vắc xin Nồng

độ formallin sử dụng thường là 1/2000 - 1/4000 với thời gian bất hoạt từ 4-15 ngày ở 35oC hoặc 37oC [34], [77], [78], [79]

Mẫu sau bất hoạt được thNm tích trong PBS để loại bỏ formallin và thử nghiệm kiểm tra bất hoạt vi rút được tiến hành ngay để đánh giá sự có mặt của vi rút sống bao gồm thử nghiệm khuếch đại HAV (amplication test) trên nuôi cấy tế bào Mẫu sau bất hoạt đạt yêu cầu về bất hoạt nếu không có các vi rút sống tồn lưu [40], [90]

+ Pha vắc xin: Hỗn dịch vi rút sau khi được tinh sạch, bất hoạt bổ sung chất

bảo quản, chất bổ trợ và được đóng lọ Phần lớn các vắc xin VGA trên nuôi cấy tế bào được giữ ở dạng lỏng và thời hạn sử dụng thường là 2 đến 3 năm

kể từ ngày sản xuất

Xu hướng phát triển các vắc xin VGA mới hiện nay là tìm kiếm các công nghệ có giá thành rẻ nhưng vẫn có hiệu quả tốt Một trong những xu hướng được nhiều nhà sản xuất áp dụng là tiến hành nuôi cấy vi rút trên hệ thống nuôi cấy sinh khối với các tiểu giá thể nuôi cấy tế bào và sử dụng các môi trường không chứa huyết thanh (serum-free medium) [65], [66] Môi trường không chứa huyết thanh đã hạn chế được các nhược điểm của các môi trường có huyết thanh Những hạn chế của môi trường chứa huyết thanh thường được kể tới như dễ gây ra các phản ứng quá mẫn ở người được tiêm, không có tính đồng nhất giữa các mẻ huyết thanh, dễ bị nhiễm bởi các tác

nhân vi sinh vật (vi khuNn, nấm, Mycoplasma, vi rút ở động vật) và giá thành

sản xuất cao Bên cạnh đó, sử dụng môi trường không chứa huyết thanh cho phép tinh chế vi rút dễ dàng và hiệu quả hơn

1.3 Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A

Kiểm tra chất lượng vắc xin là yêu cầu bắt buộc vì vắc xin khi đưa ra sử dụng phải bảo đảm an toàn và có công hiệu bảo vệ

Sản xuất vắc xin VGA bất hoạt gồm có 3 bước cơ bản Nhân nuôi vi rút trên nuôi cấy tế bào; tinh chế vi rút, bất hoạt và cuối cùng là pha vắc xin thành phNm Trong quá trình sản xuất tất cả các khâu đều được kiểm tra từ nguyên liệu nguồn, các bước của quy trình sản xuất và thành phNm cuối cùng

1.3.1 Kiểm tra nguồn nguyên liệu sử dụng cho sản xuất vắc xin

Các nguyên liệu nguồn sử dụng cho sản xuất vắc xin cần được kiểm tra đảm bảo chất lượng trước khi sử dụng Các nguyên liệu này bao gồm tế bào, môi trường nuôi cấy, chủng giống vi rút

1.3.1.1 Tế bào

Tế bào chính là một trong những nguyên liệu quan trọng sử dụng để

nhân nuôi vi rút trong sản xuất vắc xin Tiêu chí lựa chọn dòng tế bào để sản xuất vắc xin là đảm bảo được chất lượng và tính an toàn cho người sử dụng

* Yêu cầu chất lượng tế bào

+ Không nhiễm các tác nhân gây bệnh tiềm Nn bao gồm vi khuNn, nấm,

Mycoplasma, Mycobacteria, vi rút

+ Không gây ung thư, không có các đặc tính sinh khối u

+ Các đặc tính nuôi cấy, cấy truyền và di truyền phải ổn định

+ Nhạy cảm với chủng vi rút dùng để sản xuất vắc xin [91], [92]

* Hệ thống ngân hàng tế bào giống gốc và giống sản xuất

Thông thường, hệ thống ngân hàng tế bào được xây dựng 2 tầng bao gồm tế bào giống gốc (Master cell bank – MCB) và tế bào giống sản xuất

(Working cell bank – WCB) Đôi khi, ngân hàng tế bào có 3 tầng bao gồm cả

tế bào giống cha mẹ (parent cell bank) chứa các ống tế bào gốc ban đầu

Tế bào WCB có thể được nhân giống từ một hay một vài ống tế bào giống gốc bằng cách cấy truyền một vài lần liên tiếp Các tế bào này được hộn lại sau đó chia vào các ống để tạo tế bào giống sản xuất đồng nhất Một hoặc một vài týp tế bào giống sản xuất được sử dụng để nhân giống tạo tế bào sản xuất vắc xin Nếu sử dụng nhiều týp tế bào WCB để nhân giống làm tế bào sản xuất vắc xin thì hỗn dịch tế bào từ các týp này phải được đông tan cùng một lúc sau đó hộn lại rồi mới nuôi cấy và cấy truyền các đời tiếp theo để đảm bảo rằng tế bào sản xuất vắc xin đồng nhất [46]

* Tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin viêm gan A

Hiện nay hầu hết các vắc xin VGA thương mại đều được sản xuất từ việc nuôi cấy vi rút VGA trên dòng tế bào MRC5 Tế bào thuộc dạng này có

số lần cấy truyền có hạn (< 46 đời) [46], [62], [95]

1.3.1.2 Môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào là thành phần rất quan trọng để nhân nuôi tế bào

* Môi trường nuôi cấy tế bào được thNm định để đảm bảo năng suất và

hiệu quả trong sản xuất vắc xin Các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy phải đảm bảo tuyệt đối vô khuNn và an toàn [38]

* Huyết thanh sử dụng để nhân nuôi tế bào đảm bảo không nhiễm vi khuNn, nấm, Mycoplasma, các vi rút lây nhiễm từ động vật và đạt các yêu cầu

của WHO [46], [90],[91]

* Các kháng sinh bổ xung vào môi trường cần đạt theo các yêu cầu của

WHO và Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phNm y tế về nồng độ tối thiểu cũng như loại kháng sinh sử dụng Penicillin và kháng sinh nhóm Beta-lactam không được phép sử dụng trong nuôi cấy tế bào [46] Do các kháng

sinh nhóm này có thể gây dị ứng và không có tác dụng với Mycoplasma (tác

nhân nhiễm phổ biến trên nuôi cấy tế bào), mặt khác do tính kháng kháng sinh của các vi sinh vật hiện nay với Penicillin rất cao

* Trypsin sử dụng để chuNn bị nuôi cấy tế bào cũng cần kiểm định và không

có vi khuNn, nấm, Mycoplasma và các vi rút lây nhiễm khác [90], [91]

1.3.1.3 Chủng giống vi rút sử dụng trong sản xuất vắc xin

* Yêu cầu chất lượng chủng giống

+ Đạt tiêu chuNn về vô khuNn, vô nấm, không nhiễm Mycoplasma

+ Không nhiễm vi rút ngoại lai và các tác nhân gây bệnh tiềm Nn khác + Ổn định về các đặc tính di truyền và tính sinh miễn dịch qua các đời cấy truyền từ MSV tới vi rút sản xuất vắc xin [46], [92]

* Yêu cầu chất lượng chủng vi rút viêm gan A cho sản xuất vắc xin

Chủng sản xuất vắc xin VGA được lựa chọn và kiểm tra nhận dạng vi rút, các đặc tính di truyền sau khi thích ứng, tính sinh miễn dịch Ngoài các yêu cầu cơ bản của chủng giống như vô khuNn, vô nấm, không nhiễm

Mycoplasma và các vi rút ngoại lai Chủng HAV được sử dụng làm chủng giống phải có hồ sơ lý lịch ghi chép các thông tin về nguồn gốc và đạt được các tiêu chuNn đặt ra cho chủng vi rút sử dụng để sản xuất vắc xin của WHO [40], [90], [92]

WHO quy định về chất lượng chủng HAV cho sản xuất vắc xin như sau:

+ Chủng sản xuất được sản xuất dựa trên hệ thống chủng vi rút giống gốc giảm độc lực được phê chuNn bởi cơ quan thNm quyền

+ Nhận dạng và khả năng gây huỷ hoại tế bào: nhận dạng vi rút VGA

bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu (thử nghiệm huyết thanh học phù hợp ELISA hoặc thử nghiệm trung hòa vi rút VGA bằng huyết thanh mẫu chuNn hoặc kháng thể đơn dòng đã biết để trung hòa vi rút VGA)

Khả năng gây huỷ hoại tế bào và nhân lên của mỗi loạt chủng vi rút VGA được kiểm tra trên nuôi cấy tế bào

+ Vô khu!n (vô khu!n, nấm và không nhiễm Mycoplasma): loạt chủng

sản xuất cần đạt các yêu cầu trên về chủng cho sản xuất vắc xin

+ Hàm lượng vi rút: hàm lượng vi rút của mỗi loạt chủng gốc hoặc

chủng sản xuất được định lượng để kiểm soát sự ổn định trong sản xuất Hiệu giá tối thiểu của chủng giống được xác định tùy theo nhà sản xuất và tùy thuộc vào sản phNm, tế bào, chủng vi rút

+ Vi rút ngoại lai: vi rút ngoại lai (VRNL) được kiểm tra bằng nuôi

cấy trên tế bào thận khỉ và tế bào người trong điều kiện nuôi cấy như khi sản xuất chủng nhưng bằng loạt tế bào khác Trung hòa vi rút VGA có thể không cần thiết cho một số thử nghiệm kiểm tra vi rút ngoại lai của chủng vì vi rút VGA thường không gây hủy hoại tế bào và có giới hạn vật chủ nhất định Các nuôi cấy tế bào được ủ 35-37oC và theo dõi ít nhất 14 ngày song song với tế bào chứng Quan sát các nuôi cấy tế bào dưới soi ngược để kiểm tra sự hủy hoại tế bào Cuối giai đoạn theo dõi, tế bào hoặc nước nổi nuôi cấy được kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu và các tác nhân ngoại lai khác (bằng cách nuôi cấy nước nổi tế bào thu được trên loạt tế bào mới) Nếu tạo chủng vi rút từ thích ứng trên nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát, cần phải kiểm tra các tác nhân ngoại lai từ khỉ như SIV (Simian Immunodeficiency virus), SV40, vi rút B và

vi khuNn lao [39], [90]

Theo dược điển Châu Âu, kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật bao gồm các thử nghiệm trên chuột trưởng thành, chuột sữa và chuột lang và theo dõi các dấu hiệu bất thường Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu có ít nhất 80% số chuột khỏe mạnh đến cuối thời gian theo dõi [39]

Theo hướng dẫn của FDA (Mỹ -2010), trong một vài trường hợp đặc biệt khi phải trung hòa vi rút VGA để kiểm tra tác nhân ngoại lai in vitro và in vivo Khi đó cần chỉ ra rằng việc trung hòa HAV không làm ảnh hưởng tới việc phát hiện vi rút ngoại lai và kỹ thuật áp dụng đã trung hòa hoàn toàn