Công nghệ gen trong nông nghiệp c3.pdf

Công nghệ gen trong nông nghiệp

Chương Công nghệ chuyển gen động vật 3.1 Công nghệ gen tạo giống vật nuôi Mục đích cơng tác chọn giống nhân giống cải tiến tiềm di truyền vật nuôi nhằm nâng cao suất hiệu chăn nuôi Trong công tác nhân giống truyền thống, người ta sử dụng chủ yếu phương pháp lai tạo chọn lọc để cải tạo nguồn gen động vật Tuy nhiên, động vật thu qua lai tạo chọn lọc mang gen không mong muốn tổ hợp hai nhiễm sắc thể nguyên vẹn tinh trùng bố tế bào trứng mẹ Một hạn chế việc lai tạo tự nhiên thực cá thể loài Lai xa, lai lồi khác nhau, gặp nhiều khó khăn thường bất thụ: sai khác nhiễm sắc thể bố mẹ số lượng lẫn hình thái; cấu tạo quan sinh dục không tương hợp; chu kỳ sinh sản khác nhau, tinh trùng loài bị chết đường sinh dục lồi kia; tập tính sinh học Gần đây, nhờ thành tựu công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ gen động vật đời cho phép khắc phục trở ngại công tác tạo giống truyền thống để tạo động vật mang tính trạng mong muốn thời gian ngắn xác Bằng kỹ thuật tiên tiến công nghệ sinh học đại, Palmiter cộng (1982) chuyển gen hormone sinh trưởng chuột cống vào chuột nhắt, tạo chuột nhắt “khổng lồ“ (Hình 3.1) Từ đến hàng loạt động vật nuôi chuyển gen đời như: thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá Cơng nghệ gen động vật q trình phức tạp lồi khác khác nhiều phương thức bao gồm bước sau: - Tách chiết, phân lập gen tạo tổ hợp biểu tế bào động vật Người ta phân lập gen mong muốn từ sản phẩm biểu mRNA protein 73 Hình 3.1 Chuột nhắt chuyển gen hormone sinh trưởng có kích thước lớn nhiều lần so với chuột nhắt bình thường Từ mRNA tác dụng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) tổng hợp DNA bổ sung mạch đơn (single strand complementary DNA, ss cDNA), cDNA mạch kép (ds cDNA) cDNA khác với DNA gốc không chứa đoạn intron mà bao gồm exon Sự sai khác gây ảnh hưởng tới hoạt động gen bổ trợ hệ thống tế bào động vật Từ sản phẩm protein, suy trình tự nucleotide gen cấu trúc sở trình tự amino acid phân tử protein Ðiều cho phép tạo đoạn mồi (primer) để dị tìm đoạn gen mong muốn Gen cấu trúc muốn hoạt động để biểu protein mà quy định hệ thống tế bào định phải có promoter thích hợp với hệ thống mà hoạt động Promoter tế bào động vật có nguồn gốc từ động vật methallothionein (mt), thymidine kinase (tk) từ virus động vật simian virus (SV40), rous sarcoma virus (RSV) - Tạo sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú, giai đoạn biến nạp gen thích hợp trứng thời kỳ tiền nhân (pronucleus), lúc mà nhân tinh trùng trứng chưa dung hợp (fusion) với Ở giai đoạn tổ hợp gen lạ có hội xâm nhập vào genome động vật nhờ tái tổ hợp DNA tinh trùng trứng Do tế bào phôi chưa phân chia phân hóa nên tổ hợp gen lạ biến nạp vào giai đoạn có mặt tất tế bào kể tế bào sinh sản động vật trưởng thành sau 74 Trường hợp động vật có vú, trứng chín thu nhận phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình xây dựng cho loài phương pháp nuôi cấy trứng ống nghiệm (in vitro) Sau thụ tinh nhân tạo để tạo trứng tiền nhân Trường hợp cá, biến nạp gen thích hợp giai đoạn phơi có từ 1-4 tế bào Phôi đuợc tạo cách thu nhận trứng tinh dịch nhờ phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố sinh dục thai người-HCG, não thùy thể cá chép) thụ tinh nhân tạo - Chuyển gen vào động vật Có nhiều phương pháp khác để chuyển gen vào động vật như: phương pháp vi tiêm (microinjection), sử dụng vector virus, sử dụng tế bào mầm phôi (embryonic stem cell-ESC), phương pháp xung điện (electroporation) - Nuôi cấy phôi ống nghiệm (đối với động vật bậc cao) Tế bào trứng tiền nhân sau vi tiêm nuôi cấy in vitro để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) phôi nang (blastocyst) Ở giai đoạn màng (pellucida) bị bong phơi làm tổ Cấy chuyển phôi vào nhận gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể Ðối với động vật bậc thấp cá không cần giai đoạn Tuy nhiên, cá người ta phải tiến hành loại màng thứ cấp (chorion), kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột - Kiểm tra động vật tạo từ phôi chuyển gen Ðể khẳng định động vật có chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào máy di truyền động vật trưởng thành hay không sản phẩm gen lạ có tổng hợp hay không Trường hợp thứ nhất, người ta sử dụng phương pháp lai phân tử pha rắn (phương pháp Southern blot dot (slot) blot) PCR 75 Trường hợp thứ hai, phải khẳng định gen lạ có hoạt động hay không Ðể phát protein gen lạ tổng hợp người ta sử dụng phương pháp Western blot hay kỹ thuật ELISA kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) - Theo dõi hệ sau động vật chuyển gen để xác định gen lạ có di truyền hay không Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen việc tạo giống vật nuôi tập trung vào hướng trình bày đây: 3.1.1 Tạo giống vật ni có tốc độ lớn nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao Trong hướng này, người ta tập trung chủ yếu vào việc đưa tổ hợp gen cấu trúc hormone sinh trưởng promoter methallothionein vào gia súc Cho đến nay, người ta đưa thành công gen vào thỏ, lợn cừu Kết động vật chuyển gen không to lên chuột Ở Ðức, trường hợp lợn chuyển gen hormone sinh trưởng lượng mỡ giảm đáng kể (từ 28,55 mm xuống 0,7 mm) hiệu sử dụng thức ăn cao Ở Australia, lợn chuyển gen hormone sinh trưởng có tốc độ lớn nhanh đối chứng 17%, hiệu suất sử dụng thức ăn cao 30% Tuy nhiên, động vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng có biểu bệnh lý lớn cỡ chưa có ý nghĩa lớn thực tiễn Các nhà khoa học Granada (Houston, Mỹ) tạo bò chuyển gen tiếp nhận estrogen người (human estrogen receptor) có tốc độ lớn nhanh Họ thành công việc đưa gen hormone sinh trưởng giống insulin bò (bovine insulin like growth hormone) vào gia súc để tạo giống gia súc thịt khơng dính mỡ Ðể tạo động vật chuyển gen thật có ý nghĩa thực tiễn cho chăn ni cần phải tìm gen khởi động (promoter) thích hợp Gần đây, Sutrave (1990) khám phá gen Ski, mà tác động gen protein tổng hợp mạnh, lượng mỡ lại giảm đáng kể Phát mở triển vọng tạo giống lợn nhiều nạc, mỡ, hiệu suất sử dụng thức ăn cao Ðể tăng biểu hormone sinh trưởng nhằm tăng sản lượng, người ta thành công việc tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng Cá chuyển gen hormone sinh trưởng người lớn nhanh gấp hai lần so với cá đối chứng không chuyển gen (Zhu, 1985) Các nhà khoa học Canada 76 chuyển gen hormone sinh trưởng tái tổ hợp vào phôi cá hồi phát triển tạo cá hồi chuyển gen Cá hồi chuyển gen khơng có chu kỳ sinh sản ngắn mà cịn có trọng lượng lớn gấp 11 lần so với cá hồi khơng chuyển gen (Hình 3.2 ) Hình 3.2 Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng có trọng lượng lớn gấp 11 lần so với đối chứng Ở Việt nam, Nguyễn Văn Cường cộng nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào chuột, cá vàng (Carassius auratus), cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) cá chép (Cyprinus carpio) Với số kết đạt được, việc nghiên cứu tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng tiếp tục tiến hành 3.1.2 Tạo giống vật nuôi chuyên sản xuất protein quý dùng y dược Ðây hướng có nhiều triển vọng nhiều protein dược phẩm q khơng thể sản xuất qua đường vi sinh sinh vật bậc thấp, sinh vật khơng có hệ enzyme để tạo protein có cấu tạo phức tạp Ý định sử dụng tuyến sữa động vật bậc cao để sản xuất protein quý lần Clark (1987) đề xuất Nội dung kỹ thuật 77 gắn gen cấu trúc với β-lactoglobulin (là promoter điều khiển biểu gen tuyến sữa) Khi đưa tổ hợp có chứa promoter β-lactoglobulin vào cừu chuột ơng thấy chúng biểu cao tuyến sữa (Hình 3.3) Promoter Gen quan tâm β-lactoglobulin Trứng thụ tinh Vi tiêm vào DNA nhân Kim giữ Cấy phôi vào mẹ thay ế Thế hệ chuyển gen phát hiệnh PCR Sự biểu gen quan tâm giới hạn mô vú Thu nhận sữa từ động vật chuyển gen Sản phẩm gen quan tâm tiết sữa Phân đoạn protein sữa Hình 3.3 Sơ đồ qui trình sản xuất protein thơng qua tuyến sữa Cho đến nhiều protein dược phẩm quý nghiên cứu để sản xuất qua tuyến sữa động vật như: 78 - α1-antitripsin yếu tố làm đông máu IX (blood clotting factor IX) người tiết sữa cừu với nồng độ 25 mg/ml - Họat tố plasminogen mô người (human tissue plasminogen activator) làm tăng đông máu tiết sữa dê - Gen urokinase người đưa thành công vào lợn tiết tuyến sữa nhờ gen khởi động α-casein bò - Protein C người tạo từ sữa lợn chuyển gen GenPharm, công ty Công nghệ sinh học California, tạo bò đực chuyển gen lactoferrin người (human lactoferrin-HLF) có tên Herman (Hình 3.4) HLF có chức kháng khuẩn vận chuyển sắt người Hiện nay, nhiều bò hệ Herman sản xuất sữa chứa HLF GenPharm có ý định phát triển đàn bị chuyển gen để sản xuất HLF thương mại với qui mô lớn Hình 3.4 Bị đực Herman chuyển gen HLF Mặt khác, protein dược phẩm mong muốn tạo dịch thể không thuộc mô vú máu Cho đến nay, phương pháp sử dụng để biểu hemoglobin người với mức cao lợn chuyển gen (Sharma, 1994) 79 Hiện tại, có hai protein sản xuất đường α1antitripsin người hoạt tố plasminogen mô người Chất đầu sản xuất qua sữa cừu với nồng độ 35 g/l, chất sau sản xuất qua sữa dê Hãng Genetech (Mỹ) hàng năm thu 196,4 triệu USD từ sản phẩm hoạt tố plasminogen mô với giá 2,2 USD/liều Hormone sinh trưởng người sản phẩm kỹ thuật gen vi sinh vật tổng hợp với mức thu hàng năm 122,7 triệu USD Hiện tại, nhà khoa học Mỹ muốn giảm giá thành sản phẩm cách sản xuất qua sữa thỏ Người ta dự đoán giá thành sản xuất hormone qua sữa thỏ 1/3 giá thành sản xuất nhờ vi sinh vật Lý chu kỳ sinh sản thỏ ngắn lượng protein sữa thỏ lại cao Trong năm lượng protein sữa sáu thỏ bò Tập đoàn Genzymee Transgenic (Mỹ) sản xuất nhiều loại protein quý từ sữa chuột dê chuyển gen (Bảng 3.1) Bên cạnh hai phương pháp trên, nhà khoa học phát triển động vật chuyển gen sản xuất dược phẩm bàng quang chúng Khả sử dụng nước tiểu động vật để sản xuất protein tăng lên vào năm 1995, Sung cộng (Ðại học New York) chứng minh có gen hoạt động bàng quang Các gen mã hoá cho protein uroplakins Protein thành phần tham gia hình thành nên màng bàng quang Kerr (1998) nghiên cứu tạo chuột chuyển gen sản xuất hormone sinh trưởng người từ nước tiểu Gen hormone sinh trưởng người nối với promoter urolapkin Promoter kiểm sốt vị trí thời gian hoạt động gen Chuột mang gen ngoại lai tạo 500 ng hormone sinh trưởng người ml nước tiểu thải Mặc dù sản phẩm chuột chuyển gen lượng nhỏ chúng cho thấy tương lai nước tiểu vật nuôi lựa chọn Nước tiểu có ưu vượt trội so với sữa Cả động vật đực tiết nước tiểu, bắt đầu sau sinh Nước tiểu đại gia súc chứa nhiều protein sữa chúng Mặt khác, thực tế chi phí cho việc tinh chế thuốc từ nước tiểu thấp so với sữa Một vài protein khơng thích hợp việc khai thác từ sữa chúng làm tổn thương mô vú 80 Bảng 3.1 Mức độ biểu số protein sữa động vật chuyển gen (nguồn: Pollock Daniel P, 1999) Loại protein AAT Longer acting tPA AT III BR 96 Mab Single chain antibody α-Human transferring receptor Soluble receptor CD4 AT III Syn Antibody fusion protein β-IFN Mab Chitotriosidae Galactosyl transferase Sialyl transferase GAD Human growth hormone Proinsulin Myelin basic protein Single chain antibody fusion protein Prolactin Soluble HMW receptor CFTR membrane protein Factor Xa Urokinase Human transferrin receptor MAb Chuột (g/l) 35 10 1 0,2 0,1 8-14 0,2 0,2 0,001 0,3 1 Dê (g/l) 20 10 14 3.1.3 Tạo giống vật nuôi kháng bệnh thay đổi điều kiện môi trường Ðến nay, người ta biết số gen có khả kháng bệnh vật nuôi Tiêm gen Mx vào lợn để tạo giống lợn miễn dịch với 81 bệnh cúm Người ta, thành công việc tiêm gen IgA vào lợn, cừu, mở khả tạo giống vật nuôi miễn dịch với nhiều bệnh Trong tự nhiên, cá sống nước lạnh hai cực đất, biển nhiệt đới ấm áp vùng nước ơn hịa Ở nơi điều kiện nhiệt độ thay đổi theo ngày thay đổi theo mùa Trải qua trình tiến hóa lâu dài, cá có chế sinh lý thích nghi với điều kiện nhiệt độ thay đổi Cũng nhiều loài động vật khác, cá sử dụng gen sốc nhiệt để phản ứng với điều kiện nhiệt độ tăng cao, điều kiện lạnh vài lồi cá tiến hóa theo hướng gen chống lạnh Gen mã hóa protein giữ cho máu khỏi đông De Vries ( ) phát protein chống lạnh (antifreeze protein, AFP) Theo De Vries, cá vùng Bắc cực Nam cực gen AFP biểu suốt năm lồi cá sống vùng nước ơn hịa gen AFP biểu mùa đông Các protein AFP cho phép cá sống điều kiện nhiệt độ thấp Hew (1988) vi tiêm gen AFP cá bơn mùa đông vào cá hồi, tạo cá hồi chuyển gen có khả chịu điều kiện lạnh với mục đích mở rộng khả sống sót cá hồi vào mùa đông bể nuôi cá nước mặn Ðây thuận lợi lớn cho việc nuôi trồng nguồn thủy sản quan trọng 3.1.4 Tạo giống vật ni có suất chất lượng cao cách thay đổi đường chuyển hóa thể động vật Trong hướng bật nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu cách chuyển gen lactose vào đối tượng quan tâm Sự biểu gen điều khiển promoter tuyến sữa Trong sữa động vật chuyển gen này, đường lactose bị thủy phân thành đường galactose đường glucose Do vậy, người khơng quen uống sữa sử dụng sữa mà khơng cần q trình lên men Hiện người ta ý tới việc đưa số gen vi sinh vật vào thể động vật Tiến bật hướng đưa gen mã hóa enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp cysteine vào cừu Cysteine amino acid tổng hợp từ serine nhờ hai enzyme serine transacetylase Oacetylserine sulfahydrylase Hai gen chịu trách nhiệm tổng hợp hai enzyme Cys E Cys K Cysteine amino acid quan trọng 82 Hình 3.5 Tóm tắt phương pháp chuyển phơi bị 1: Gây siêu rụng trứng bò cho gonadotropin 2: Thụ tinh nhân tạo (5 ngày sau bắt đầu gây siêu rụng trứng) 3: Thu nhận phôi phương pháp không phẫu thuật (6-8 ngày sau thụ tinh nhân tạo) 4: Ống Foley để thu nhận phôi 5: Tách phân loại phôi 6: Bảo quản phôi không hạn định nitrogen lỏng 37 0C nhiệt độ phịng ngày 7: Chuyển phơi vào nhận phương pháp phẫu thuật không phẫu thuật 8: Chẩn đoán thai sờ nắn qua vách trực tràng 1-3 tháng sau chuyển phôi 9: Sinh đẻ (9 tháng sau chuyển phôi) Trong cấy chuyển phôi phương pháp không phẫu thuật, bước quan trọng đưa dụng cụ vào súng cấy chuyển phôi đến cổ sừng tử cung Sự sử dụng không cẩn thận dụng cụ làm tổn thương cổ màng tử cung gây chảy máu Do đó, di chuyển dụng cụ biết vị trí chúng q trình đưa dụng cụ vào tử cung kiểm tra điều chỉnh qua trực tràng 90 Ở nước phát triển, tỷ lệ đậu thai bò sau cấy chuyển phôi 60-70% phôi tươi 55-65% phôi đông lạnh Ở Việt Nam, tỷ lệ đậu phôi đạt thấp hơn: 30-40% phơi tươi 38-44% phơi đơng lạnh (Hồng Kim Giao, 1997) 3.2.3.5 Sinh thiết phôi Sinh thiết từ phơi sinh đơi trứng xác định giới tính đặc tính di truyền dịng vơ tính Có thể hút tế bào từ phôi để xét nghiệm dùng dao cắt phần phôi 3.2.3.6 Thụ tinh in vitro (in vitro fertilization) Thụ tinh in vitro kỹ thuật công nghệ sinh học đại nhằm kết hợp trứng tinh trùng ống nghiệm để thu hợp tử Các nhà khoa học sử dụng phương pháp thụ tinh nhân tạo để giải vấn đề tính hữu thụ người nhiều năm qua Ðối với gia súc, kỹ thuật công nghệ sinh học sử dụng lần thỏ (Daizien, 1971), sau bị lợn (Iritani, 1978), dê (Kim, 1981) Vào năm 1982, bê sinh thụ tinh in vitro (Hanada, 1982) Từ đến kỹ thuật thụ tinh in vitro áp dụng rộng rãi chăn ni bị nhiều nước giới Nói chung, kỹ thuật thụ tinh in vitro bao gồm bước: - Trước hết tiến hành thu nhận trứng chưa thụ tinh từ buồng trứng cho (có thể sử dụng thuốc gây siêu rụng trứng không) Trứng thu nhận vào thời gian chu kỳ sinh sản (đối với bò) - Sau nuôi thành thục tủ ấm (khoảng 20-24 bò), trứng thụ tinh với tinh trùng hoạt hóa Sự hoạt hóa tinh trùng thực đường sinh dục hay ống nghiệm với môi trường ni cấy thích hợp - Ni hợp tử cho phát triển đến giai đoạn phôi dâu phôi nang - Cấy chuyển phôi thu nhận vào nhận Ở bò tỷ lệ thụ thai từ thụ tinh in vitro thường nằm khoảng từ 4050% 91 Sử dụng thụ tinh in vitro cho phép khai thác tiềm sinh sản gia súc đơn thai, rút ngắn khoảng cách hệ gia súc có vịng đời dài, thành lập ngân hàng gen công nghiệp hóa ngành chăn ni 3.2.4 Tạo dịng vơ tính động vật Tạo dịng vơ tính (somatic cloning) thuật ngữ dùng để tập hợp cá thể (từ hai trở lên) có xuất xứ từ cá thể ban đầu qua q trình sinh sản vơ tính Tạo dịng vơ tính vật ni phát triển với số kỹ thuật: 3.2.4.1 Chia tách phơi (embryo spliting) Với kỹ thuật cho hai hay nhiều phôi từ phôi ban đầu, tạo hàng loạt cá thể giống hệt mặt di truyền hay nói cách khác tạo nên dịng vơ tính Có hai phương pháp chia tách phơi: phương pháp dùng kim (Hình 3.6) phương pháp dùng dao cắt Phương pháp dùng dao đơn giản dễ dàng nhiều so với phương pháp dùng kim Ðể thực chia tách phôi cần phải có dung dịch ni phơi, kính hiển vi soi ngược (inverted microscope), thiết bị vi thao tác để điều khiển kim dao cắt, kim giữ để cố định phôi Trước hết cho phôi dùng để chia tách vào đĩa petri chứa dung dịch nuôi cấy; cố định phôi kim giữ; điều khiển thiết bị vi thao tác để dịch chuyển dao cắt theo hướng thẳng đứng từ xuống hay theo hướng nằm ngang cho lưỡi dao đặt vào khối tế bào phôi; cắt phơi thành hai, ý thao Hình 3.6 Tách phơi kim tác nhanh, dứt khốt xác; chuyển phôi sau tách vào dung dịch nuôi để nuôi cấy khoảng 2-3 trước chuyển vào vật nhận gây động dục đồng pha; ni cấy tiếp tục chia tách lặp lại thu nhận nhiều phôi 92 ... khởi động α-casein bò - Protein C người tạo từ sữa lợn chuyển gen GenPharm, công ty Công nghệ sinh học California, tạo bò đực chuyển gen lactoferrin người (human lactoferrin-HLF) có tên Herman... mg/ml - Họat tố plasminogen mô người (human tissue plasminogen activator) làm tăng đông máu tiết sữa dê - Gen urokinase người đưa thành công vào lợn tiết tuyến sữa nhờ gen khởi động α-casein bò... dịch phóng xạ (RIA) - Theo dõi hệ sau động vật chuyển gen để xác định gen lạ có di truyền hay khơng Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen việc tạo giống vật nuôi tập trung vào hướng trình