Công nghệ chuyển gen C3

Công nghệ chuyển gen

94 Chương Các phương pháp xác định diện biểu gen ngoại lai I Southern blot Southern blot phương pháp trung tâm Sinh học phân tử Nó cịn có tên gọi khác Southern blotting, phương pháp lai Southern hay phương pháp lai DNA Nguyên tắc Southern blot màng lai nitrocellulose có khả tiếp nhận DNA biết từ lâu sử dụng nghiên cứu lai axit nucleic khác vào thập niên 1950 1960 Vào thời kỳ DNA cố định không phân đoạn, đơn giản bao gồm DNA tổng số gắn màng lai nitrocellulose Sự đời phương pháp điện di gel vào đầu thập niên 1970 cho phép đoạn DNA cắt enzyme hạn chế phân tách dựa sở kích thước chúng Từ bước phát triển phương pháp chuyển đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose Phương pháp E M Southern mô tả Ðại học Edingburgh vào năm 1975 Phương pháp Southern blot đơn giản hiệu Mặc dù cải tiến phương pháp sử dụng nhiều phịng thí nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương pháp ban đầu Southern blot bao gồm bước sau: - Cắt DNA enzyme hạn chế thích hợp - Ðiện di sản phẩm cắt gel agarose - Làm biến tính DNA (thơng thường cịn gel): ví dụ nhúng vào dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn chuyển lên màng lai 95 - Chuyển DNA biến tính lên màng lai Thơng thường màng lai sử dụng màng nitrocellulose Người ta sử dụng màng nylon Màng nitrocellulose điển hình có khả tiếp nhận 100µg DNA/cm2, màng nylon có khả tiếp nhận 500µg DNA/cm2 Mặt khác màng nylon có khả giữ DNA đứt gãy Việc chuyển DNA thường tiến hành hoạt tính mao dẫn khoảng vài tiếng dùng thiết bị thấm chân không Nếu dùng thiết bị thấm chân khơng nhanh hơn, khoảng tiếng Trong q trình chuyển, vị trí đoạn DNA giữ nguyên không thay đổi - Lai DNA cố định màng với mẫu dị (probe) DNA có đánh dấu Q trình dựa nguyên tắc bổ sung (giữa DNA màng lai với mẫu dò) Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin mẫu dò phát quang sinh học - Ðịnh vị phân tử lai DNA-mẫu dị Nếu sử dụng mẫu dị đánh dấu phóng xạ dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, sử dụng biotin/streptavidin dùng phương pháp so màu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học phát phát quang Phương pháp Southern blot thiết kế để xác định diện, kích thước, số lượng sao, tính đồng dạng DNA phức hợp Ví dụ, Southern blot sử dụng để phát gen đặc biệt genome nguyên vẹn II Northern blot Sau E M Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người ta dùng phương pháp tương tự để xác định đoạn RNA đặc biệt gọi Northern blot Phương pháp gọi Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương pháp lai RNA Northern blot bao gồm bước sau: 96 - RNA (RNA tổng số mRNA) phân tách điện di gel agarose Hỗnh 3.1: Sồ õọử mọ taớ phổồng phaùp Southern blot - RNA sau phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí gel) 97 - RNA cố định màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép Hình 3.2: Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot - Vị trí mẫu dị phát nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dị gắn với enzyme đem ủ với chất khơng 98 màu Enzyme liên kết với biến đổi thành sản phẩm màu nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp Phương pháp Northern blot cho phép phát có mặt, xác định kích thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA mẫu khác Ðây phương pháp tốt để phân tích biểu gen cần định lượng để phân biệt khác hai mẫu nhạy điện di lượng lớn RNA tổng số mRNA gel III Western blot Western blot phương pháp có độ nhạy cao dựa tính đặc hiệu kháng thể để phát protein điện di gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) chuyển lên màng lai Western blot cho phép xác định có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt mẫu khác Western blot cịn có tên gọi khác Western blotting phương pháp lai thấm protein Western blot bao gồm bước sau: - Protein phân tách điện di gel SDS-PAGE - Các protein chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí phân tách gel - Ủ màng lai cố định protein với kháng thể sơ cấp (primary antibody) Kháng thể sơ cấp kháng thể đặc hiệu, bám vào protein tạo thành phức hợp protein-kháng thể protein quan tâm - Tiếp theo ủ màng lai với kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) kèm Kháng thể thứ cấp bám vào kháng thể sơ cấp giống kháng thể sơ cấp bám vào protein - Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme Nếu việc diễn cách xác phát thấy băng nơi có mặt phức 99 - hợp protein-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác nơi có mặt protein quan tâm Ðặt phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát điểm sáng phát enzyme Hình 3.3: Sơ đồ mơ tả phương pháp Western blot IV ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay) 100 ELISA mô tả lần vào năm 1971 từ trở thành phương pháp sử dụng ngày rộng rãi quan trọng nghiên cứu, chẩn đốn xét nghiệm có khả phát nhạy bén với lượng vật chất nhỏ ELISA thay số kỹ thuật huyết “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh tốn nhiều thời gian mở rộng phạm vi phương pháp phát virus marker liên quan đến nhiễm chúng Xét nghiệm ELISA tiến hành với số phương pháp ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ “cạnh tranh“ Nguyên tắc phương pháp ELISA kháng nguyên hoà tan dung dịch đệm thích hợp phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene) Q trình trực tiếp thông qua kháng thể Khi huyết thêm vào, kháng thể kết hợp với kháng nguyên pha đặc (solid phase) Xét nghiệm ELISA thực đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm đường kính 0,7cm (Hình 3.4) Hình 3.4: Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA 10 Các kháng thể sử dụng phương pháp ELISA gắn với enzyme liên kết đồng hoá trị Kháng nguyên gắn với giếng plastic kháng thể liên kết với enzyme gắn với kháng nguyên Kháng thể không gắn kháng nguyên bị rửa trơi Enzyme giữ lại lượng kháng thể gắn enzyme phát cách cho thêm vào chất làm thay đổi màu hoạt tính enzyme Ðộ màu tạo thành tỉ lệ với lượng enzyme bám giếng plastic, từ suy lượng kháng thể, sau tiếp tục suy lượng kháng ngun (Hình 3.5) Tính nhạy ELISA khuyếch đại hoạt tính enzyme Mỗi phân tử enzyme bám vào kháng thể tạo hàng ngàn phân tử màu hoạt tính enzyme Trước kháng thể gắn enzyme sử dụng rộng rãi, kháng thể phóng xạ sử dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radio immuno assays-RIA) Kỹ thuật RIA đột phá có ý nghĩa người sáng tạo Rosalyn Yalow nhận giải thưởng Nobel Sinh lý Y học vào năm 1977 Hình 3.5: Nguyên tắc phương pháp ELISA 102 V Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp Kary Mullis phát minh vào năm 1985 giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống suối nước nóng) Phần lớn DNA polymerase làm việc nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt DNA polymerase khơng có nhiều khả làm biến tính phần lớn phần phân tử Nhưng polymerase chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao, lên đến 100oC Ở nhiệt độ DNA (dạng thẳng) bị biến tính Các thành phần chủ yếu phản ứng PCR 2.1 DNA mẫu (DNA template) Ðây mẫu DNA sinh học mà muốn khuyếch đại Phản ứng PCR tối ưu xảy DNA thật tinh phản ứng PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm sử dụng enzyme DNA polymerase cho hiệu cao (