thử nghiệm phương pháp chiết xuất precocen i và prococen ii từ cây cỏ hôi (ageratum conyzoides)

Các công trình nghiên c>u cho th%y thBc v6t thu1c h0 Cúc Asteraceae, Th8u d8u Euphorbiaceae ch>a nhi#u ho$t ch%t có tính di!t sâu.. 2ây là nh:ng ch%t có ho$t tính kháng hormon juvenile..

CH%&NG TRÌNH V%'M %&M SÁNG T(O KH-CN TR)

BÁO CÁO NGHI#M THU

TH* NGHI#M PH%&NG PHÁP CHI+T XU,T PRECOCEN I VÀ PRECOCEN II T- CÂY C HÔI

(AGERATUM CONYZOIDES)

Ch/ nhi0m 12 tài: ThS Lê Ti!n D"ng

Phân vi#n Hóa h$c các H%p ch&t Thiên nhiên

C3 quan ch/ trì: Trung tâm Phát tri'n Khoa h$c và Công ngh# tr(

01 Ph)m Ng$c Th)ch, Qu*n 1, Tp H+ Chí Minh

Thành ph4 H5 Chí Minh, tháng 12/2006

I "#t v$n %& trang 1

II T'ng quan trang 2

2.1 S! l"#c v$ thu%c tr& sâu trang 2 2.2 Juvenile hormon và anti juvenile hormon trang 3

2.3 Gi'i thi(u v$ cây C) hôi, Ageratum conyzoides L trang 4

2.4 Tình hình nghiên c*u trong và ngoài n"'c trang 5 2.4.1 Tình hình nghiên c*u ngoài n"'c trang 5 2.4.2 Tình hình nghiên c*u trong n"'c trang 9

III Nguyên li(u và ph)*ng pháp nghiên c+u trang 12

3.1 Nguyên li(u trang 12 3.2 Hóa ch+t và thi,t b- trang 12 3.2.1 Hóa ch+t trang 12 3.2.2 Thi,t b- trang 12 3.3 Ph"!ng pháp nghiên c*u trang 13 3.3.1 Ph"!ng pháp trích ly tinh d.u trang 13 3.3.2 Ph"!ng pháp xác /-nh thành ph.n hóa h0c tinh d.u trang 16 3.3.3 Ph"!ng pháp /-nh l"#ng precocen trong lá khô trang 16 3.4 1-a /i2m làm th3c nghi(m trang 18

IV K,t qu- và Bi(n lu.n trang 20

4.1 Kh4o sát hàm l"#ng precocen trong tinh d.u trang 20 4.1.1 Tinh d.u lá thu hái trong mùa m"a và mùa n5ng trang 20 4.1.2 Tinh d.u hoa thu hái vào mùa m"a trang 21 4.1.3 Thành ph.n hóa h0c c6a tinh d.u trang 21 4.2 Hàm l"#ng precocen trong d-ch chi,t hexan trang 24 4.3 Bi(n lu7n c+u trúc A32 và A43 trang 27

V K,t lu.n và "& ngh/ trang 32 Ph0 l0c

Tài li(u tham kh-o

S8 TÊN B9NG S8 LI:U TRANG

1 Thành ph.n các c+u t; trong tinh d.u cây C) Hôi < các

vùng khác nhau

8

2 Thành ph.n các c+u t; trong tinh d.u cây C) Hôi, Hà

N=i, Vi(t Nam

9

4 Hàm l"#ng tinh d.u lá C) hôi b>ng ch"ng c+t c? /i2n

và ch"ng c+t có h@ tr# vi sóng

20

5 Hàm l"#ng tinh d.u hoa C) hôi vào tháng 8/2006 21

6 Thành ph.n hóa h0c tinh d.u lá cây C) hôi thu hái vào

10 K,t qu4 s5c ký c=t l.n 2 trên phân /oAn 3 và 4 25

11 So sánh ph? 13C-NMR và DEPT c6a A32 v'i ph? 13

C-NMR và DEPT c6a precocen I

28

12 So sánh ph? 13C-NMR và DEPT c6a A43 v'i ph? 13

C-NMR và DEPT c6a precocen II

30

1 Ly trích tinh d.u b>ng ph"!ng pháp ch"ng c+t c? /i2n 13

2 Ly trích tinh d.u trong /i$u ki(n chi,u xA vi sóng 16

L!I C"M #N

!" #$ng ký và th%c hi&n #'(c #) tài, chúng tôi #ã nh*n #'(c nhi)u s% h+ tr( và giúp #, Các tác gi- xin g.i l/i c-m 0n sâu s1c #2n các #0n v3 và cá nhân sau:

- C0 quan qu-n lý: Ban lãnh #4o S5 Khoa h6c và Công ngh& Tp H7 Chí Minh #ã c8p kinh phí, là ngu7n #9ng l%c khuy2n khích

và c0 s5 #:u tiên cho vi&c th%c hi&n #) tài

- C0 quan ch; trì: Trung tâm Phát tri"n Khoa h6c và Công ngh& tr< Thành #oàn Tp.H7 Chí Minh, #ã giúp #,, h+ tr( chúng tôi trong quá trình #$ng ký, th%c hi&n và b-o v& #) tài

- Các thành viên trong H9i #7ng th=m #3nh #) tài #ã #óng góp nhi)u ý ki2n quý báu cho #) tài #'(c kh- thi

- Ban lãnh #4o Phân vi&n Hóa h6c các H(p ch8t Thiên nhiên #ã t4o

#i)u ki&n giúp #, chúng tôi th%c hi&n #) tài

- Cu>i cùng, xin g.i l/i c-m 0n #2n các b4n bè 5 Vi&n Khoa h6c

và Công ngh& Vi&t Nam #ã nhi&t tình h+ tr( trong quá trình th%c hi&n #) tài

Ch; nhi&m #) tài

Lê Ti2n D?ng

PH!N I: "#T V$N "%

Sâu h$i rau màu gây h$i r%t l&n cho ngành nông nghi!p n'&c ta Nhi#u báo cáo trên th( gi&i cho th%y nh)m ng*n ng+a d,ch h$i, nông dân "ã s- d.ng thu/c tr+ sâu Hóa h0c m1t cách liên t.c và kéo dài 2i#u này làm t*ng kh3 n*ng kháng thu/c cho sâu h$i

Cho "(n nay, không th4 ph5 nh6n vai trò r%t quan tr0ng c5a thu/c tr+ sâu trong vi!c phòng tr+ d,ch b!nh, nâng cao n*ng su%t cây tr7ng ph.c v nhu c8u con ng'9i Tuy nhiên, cùng "ó là nh:ng nguy c; cho ng'9i s- d.ng, 3nh h'<ng ô nhi=m môi tr'9ng …

Do "ó, g8n "ây các h'&ng nghiên c>u t6p trung vào vi!c tìm các h?p ch%t thiên nhiên có ho$t tính "1c, ngán *n, xua "u@i hoAc kháng hormon "/i v&i côn trùng v&i m.c tiêu t+ng b'&c thay th( thu/c tr+ sâu Hóa h0c Các công trình nghiên c>u cho th%y thBc v6t thu1c h0 Cúc (Asteraceae), Th8u d8u (Euphorbiaceae) ch>a nhi#u ho$t ch%t có tính di!t sâu Vi!c nghiên c>u ly trích và >ng d.ng các ho$t ch%t này trong nông nghi!p góp ph8n t+ng b'&c gi3m thi4u vi!c s- d.ng thu/c tr+ sâu

G8n "ây có nhi#u th3o m1c "'?c nghiên c>u và >ng d.ng làm thu/c tr+

sâu sinh h0c nh': Cây Neem (Azadiracta indica), Thu/c cá (Derris sp.), cây

Th)n mát, cây Xe-va-"i (Sabadilla lily), Cúc Chrysanthemum sp.…

Cây CC hôi, Ageratum conyzoides L., "ã "'?c xác nh6n ch>a hàm l'?ng

precocen I và II cao 2ây là nh:ng ch%t có ho$t tính kháng hormon juvenile Tuy nhiên ch'a có công trình nào kh3o sát hàm l'?ng precocen theo các ph';ng pháp ly trích khác nhau Trong "# tài này, chúng tôi t6p trung kh3o sát hàm l'?ng precocen trong cây CC hôi b)ng các ph';ng pháp ly trích khác nhau nh)m tìm ra ph';ng pháp t/t nh%t ly trích precocen, >ng d.ng trong nông nghi!p

PH!N II: T&NG QUAN 2.1 S' l()c v* thu+c tr, sâu

Vi!c phòng tr+ sâu h$i hoa màu l';ng thBc "ã có t+ lâu "9i Ngoài vi!c phá ho$i mùa màng, côn trùng còn là nguyên nhân lan truy#n nhi#u b!nh nguy hi4m, loài ng'9i tìm m0i cách gi3m thi4u thi!t h$i do côn trùng gây ra Loài ng'9i xu%t hi!n trên trái "%t kho3ng h;n 3 tri!u n*m, trong khi côn trùng "ã t7n t$i ít nh%t 250 tri!u n*m Chúng ta có th4 dB "oán r)ng bi!n pháp

"8u tiên "'?c s- d.ng b<i t@ tiên nh)m làm gi3m thi!t h$i do côn trùng gây ra

là xông khói hoAc r3i tro lên côn trùng "4 xua "u@i

Nh:ng nhà nghiên c>u l,ch s- "ã tìm th%y d%u v(t vi!c s- d.ng thu/c tr+ sâu kho3ng 1000 n*m tr'&c công nguyên Pliny the Elder (t+ n*m 23-79 sau công nguyên) "ã ghi l$i h8u h(t các ph';ng th>c s- d.ng thu/c tr+ sâu tr'&c

"ó trong cu/n Natural History, bao g7m vi!c s- d.ng ch%t "Dng t+ m6t th)n

l)n "4 b3o v! quá táo khCi sâu Ti(p theo là ph';ng th>c s- d.ng d,ch chi(t t+ cây tiêu và cây thu/c lá; n'&c xà phòng d%m, d8u thông …

V# c; b3n, m0i hóa ch%t dùng "4 xua "u@i hoAc gây ch(t côn trùng "'?c g0i là thu/c tr+ sâu Thu/c tr+ sâu bao g7m:

• Nhóm Clo h:u c; ("ã b, c%m s- d.ng)

• Nhóm phopho h:u c;

• Nhóm carbamate

• Pyrethroid

• Nhóm ch%t "i#u hòa sinh tr'<ng côn trùng

* Ch-t "i*u Hòa S Phát Tri/n Côn Trùng (IGR): là nh:ng h?p ch%t

"i#u khi4n sB phát tri4n và l1t xác c5a côn trùng, chúng tác "1ng lên côn trùng b)ng cách:

- Enh h'<ng, gây r/i lo$n ho$t "1ng c5a juvenile hormon

- Fc ch( ho$t "1ng c5a juvenile hormon: h0p ch%t precocenes

- Fc ch( t@ng h?p chitin

Thay vì gây ch(t trBc ti(p côn trùng, IGR tác "1ng "(n c; ch( phát tri4n bình th'9ng và gây ch(t tr'&c khi côn trùng "(n giai "o$n tr'<ng thành

2.2 Juvenile hormon và anti juvenile hormon

Juvenile hormon là nh:ng hormon "i#u hòa sB sinh tr'<ng và phát tri4n c5a côn trùng SB bi(n thái < côn trùng t+ sâu non thành b'&m tr3i qua nhi#u giai "o$n:

Qua mGi l8n l1t xác, sâu l$i l&n thêm và "'?c "i#u khi4n b<i hromon l1t xác và hormon juvenile Thêm hormon juvenile vào giai "o$n %u trùng sH làm r/i quá trình bi(n thái và gây ch(t %u trùng

Hormon juvenile do tuy(n Corpora allata ti(t ra, n(u cho ch%t >c ch( (precocen) sB ho$t "1ng c5a tuy(n Corpora allata vào giai "o$n %u trùng,

precocen gây nh:ng "1t bi(n s&m >c ch( quá trình sinh t@ng h?p hormon juvenile, t$o r/i lo$n quá trình bi(n thái và côn trùng b, ch(t Hi!n t'?ng rõ nh%t là côn trùng r%t nhC [8]

Hình 1: Các giai 0o1n bi2n thái 3 côn trùng

2.3 Gi4i thi5u v* cây C6 hôi (Ageratum conyzoides L.)

Hình 2: Cây C6 Hôi

Tên khoa h7c: Ageratum conyzoides L

Thu8c h7: Cúc (Asteraceae) Các tên khác: Cây Bù xích, Cây hoa ngI sDc, CC c>t heo

Tên khoa h0c c5a cây CC hôi là Ageratum conyzoides, ch: ageratum bDt ngu7n t+ ti(ng Hy L$p “a geras” có nghJa là không già, "# c6p "(n vi!c s/ng lâu c5a cây Trái l$i, conyzoides bDt ngu7n t+ ti(ng Hy L$p ‘konyz’ là tên ",a ph';ng c5a cây Inula helenium, loài thBc v6t có hình thái gi/ng cây CC hôi

Cây CC hôi là lo$i cây thân th3o, cao 25-50cm, phân cành nhi#u Thân có lông m#m, màu xanh l.c hoAc tím "C Lá m0c "/i, hình b8u d.c, hoAc tam giác,"8u nh0n, dài 2-10cm, r1ng 0,5-5cm, mép có r*ng c'a tròn, hai mAt "#u

có lông, mAt d'&i nh$t h;n mAt trên, ba gân tCa ra t+ g/c lá, vò lá có mùi "At bi!t

Hoa nhC màu tím hoAc trDng, t$o thành c.m hoa hình "8u < ng0n thân hoAc "8u cành Cu/ng c.m hoa có lông m#m, t@ng bao hình "8u g7m nh:ng

lá bDt x(p thành hai dãy; "8u nhC ch>a toàn hoa hình /ng bé và "#u nhau Tràng ngDn có n*m thùy tam giác Qu3 b( màu "en có n*m sóng d0c

Cây có ngu7n g/c t+ châu MK, sau phát tán ra khDp các vùng nhi!t "&i và c6n nhi!t "&i nh': Nam Trung Qu/c, Thái Lan, Lào, Ln 21… M Vi!t Nam

cây CC hôi phân b/ hoang d$i t+ vùng núi cao trên 1500m "(n các tNnh < "7ng b)ng ven bi4n Cây th'9ng m0c g8n nh' thu8n lo$i < các n';ng ngô, bãi sông, ven "'9ng "i và trong v'9n Cây CC hôi thu1c lo$i cây 'a Om, 'a sáng

và ch,u bóng mát H)ng n*m, cây con m0c t+ h$t th'9ng th%y vào gi:a mùa xuân, sinh tr'<ng m$nh trong mùa xuân hè, có hoa qu3 vào mùa thu sau "ó tàn l.i Cây ra hoa qu3 nhi#u, h$t có túm lông, phát tán nh9 gió "i khDp n;i

[3,5]

2.4 Tình hình hình nghiên c9u trong và ngoài n(4c

2.4.1 Tình hình nghiên c9u ngoài n(4c

T+ lâu, cây CC hôi "ã "'?c s- d.ng "4 "i#u tr, nhi#u lo$i b!nh t6t nh': thu/c x@, thu/c h$ nhi!t, làm lành v(t th';ng[12]

Các nghiên c>u v# hàm l'?ng tinh d8u lá cây cho th%y chúng bi(n "@i t+ 0,11% "(n 0,58% tùy theo th9i gian thu hái Thành ph8n ch5 y(u c5a tinh d8u là: terpenoid (caryophyllen và caryophyllenoxid); chromene, chromon (ch5 y(u là precocen I, precocen II) Ngoài ra cây ch>a nhi#u h?p ch%t flavonoid,

"ã có kho3ng 21 flavonoid "'?c phát hi!n [12]

.N*m 1977, Adesogan E Kayode và c1ng sB "ã cô l6p "'?c tinh th4 t+ lá cây CC hôi và "ã xác ",nh d'?c tên là Stigmast-7-en-3-ol [1]

H 3 C

Stigmast-7-en-3-ol

N*m 1978 Adesogan E Kayode và c1ng sB[2] "ã xác ",nh "'?c m1t chromene m&i t+ cây CC hôi là Conyzorigun và 5’-methoxynobiletin

O O

O O

O CH3O

O C H3O

N*m 1998 < Trung Qu/c[9] "ã nh6n di!n 6 h?p ch%t steroid trong cây CC hôi, là !-Sitosterol, stigmasterol, spinasterol, dihydrospinasterol, brassicasterol, dihydrobrassicasterol

N*m 1991 < 2>c,Wiedenfeld Helmut và c1ng sB[17] "ã cô l6p "'?c hai pyrolizidin acaloid và "'?c ",nh danh là lycopsamin và echinatin

N*m 1987 < Ln 21, Borthakur và Baruah "ã nh6n danh precocene I và precocene II là hai h?p ch%t kháng juvenile hormon [4]

N*m 1998, Koteppa pari P J Rao và c1ng sB "ã cô l6p "'?c precocen I

và precocen II cùng 04 h?p ch%t m&i: dimethoxybenzofuran; 2-(1’-oxo-2’-methylpropyl)-2-methyl – 6,7-dimethoxy-chromen; 3-(2’-methylpropyl)-2-methyl-6,8-dimethoxy-chrom-4-one và 2-(2’-methylprop-2-enyl)-2-methyl-6,7-dimethoxy-chroman-4-one t+ tinh d8u cây CC hôi [18]

2-(2’-methylethyl)-5,6-N*m 1999, R.N YadavaU và c1ng sB "ã tách "'?c m1t isoflavone m&i t+ thân cây CC hôi: 5,7,29,49-tetrahydroxy-6,39-di- 3,3-dimethylallyl -

isoflavone 5-O-P-L-rhamnopyranosyl- (1#4) - P -L-rhamnopyranoside[19]

N

O O

H3C

Precocene I

Thành ph8n chính c5a tinh d8u CC hôi t$i các n'&c khác nhau trên th( gi&i:

B:ng 1: Thành ph;n các c-u t< trong tinh d;u cây C6 Hôi 3 các vùng khác nhau

C3 tinh d8u và thành ph8n chính c5a tinh d8u (precocen) có ho$t tính anti juvenile hormon, trong "ó precocen I có ho$t tính cao g%p 4 l8n so v&i tinh

d8u (trên m0t "6u) Khi th- nghi!m trên nh1ng Schistocerca gregaria cho

th%y tinh d8u CC hôi gây ch(t 91% nh1ng Ho$t tính anti juvenile hormon c5a

precocen I và II "ã "'?c ch>ng minh trên nhi#u côn trùng: Sitophilus oryzae, Thlaspida japonica, Leptocarsia chinesis, và Dysdercus flaidus

Hormon sâu non do corpora allata ti(t ra, là hormon hG tr?, nó gi: vai trò

>c ch( bi(n thái nh'ng l$i cho phép l1t xác "4 "3m b3o cho %u trùng l1t xác nhi#u l8n và "$t kích th'&c l&n tr'&c khi thành nh1ng Tinh d8u c5a cây CC hôi tác "1ng "1c tính nghiêm tr0ng "(n sB tr'<ng thành c5a con m0t "6u "Ia,

Callosobruchus maculatus F khi xông khói M 2,5- 10 $l d8u trên 9,5g "6u

2,a "i4m thu hái Precocene I

(%)

Precocene II (%)

!-Caryophylene (%)

Hoa 29

Lá 46 R= 80

ng*n chAn sB "Q tr>ng và sB xu%t hi!n côn trùng tr'<ng thành mà không có h$i "(n sinh lý h0c

Theo t$p chí Science phát hành n*m 1976, Bowers, W S và c1ng sB phát hi!n precocen I và II "'?c cô l6p t+ nh:ng cây thu1c chi Ageratum có ho$t

tính kháng hormon sâu non Thành ph8n có ho$t tính nh%t, pecocen II, "Oy nhanh quá trình bi(n thái c5a %u trùng khi(n chúng b, ch(t[20]

Pereira (1929) "ã nh6n th%y lá cây có tác d.ng xua "u@i côn trùng Ekundayo và c1ng sB (1987) "ã ch>ng minh ho$t tính kháng juvenile hormon c5a precocene I and II "/i v&i côn trùng Hi!n t'?ng ph@ bi(n nh%t là quá trình "1t bi(n s&m t$o nên côn trùng ch(t hoAc không phát tri4n

2.4.2 Tình hình nghiên c9u trong n(4c

Nguy=n Xuân DIng và c1ng sB[6] "ã ti(n hành ph';ng pháp sDc ký khí ghép kh/i ph@ "4 kh3o sát tinh d8u t+ lá t';i cây cC Hôi < m1t vùng g8n Hà N1i và "ã xác ",nh thành ph8n hóa h0c c5a tinh d8u cây cC Hôi < Vi!t Nam

và "ã cho th%y ba thành ph8n chính c5a tinh d8u là !- caryophylen, demethoxy ageratochromen, ageratochromen theo k(t qu3 trình bày trong b3ng 2

B:ng 2: Thành ph;n các c-u t< trong tinh d;u cây C6 Hôi, Hà N8i, Vi5t Nam

B:ng 3: H?ng s+ v@t lý cAa tinh d;u C6 hôi

Cây CC hôi "'?c Khoa tai mIi h0ng b!nh vi!n Phú Th0 (1973) dùng ch:a viêm xoang mIi d, >ng có hi!u qu3 t/t Ngoài ra, khoa tai mIi h0ng B!nh vi!n Vi!t Nam-Cu Ba và phòng khám tai mIi h0ng B!nh vi!n Hai Bà Tr'ng (Hà N1i) "ã áp d.ng các ch( phOm c5a cây CC hôi "4 "i#u tr, các ch>ng b!nh viêm xoang mIi và có nh6n xét nh' sau: các ch( phOm này có kh3 n*ng thay th( cortison trong "i#u tr, viêm xoang, viêm mIi d, >ng Tác

d.ng kéo dài làm gi3m ng$t mIi, gi3m viêm ti(t d,ch, gi3m hDt h;i và s@ mIi nh>t "8u Tác d.ng kém "/i v&i viêm mIi và viêm xoang có m5 "Ac, k4 c3 c%p tính và m$n tính Không gây tác d.ng ph gì "/i v&i c; th4 ng'9i b!nh, tr+ tác d.ng gây s/t trong th9i gian ngDn khi nhC mIi[11]

Nói chung các nghiên c>u v# cây CC hôi t$i Vi!t nam ch'a nhi#u, "Ac bi!t là kh3o sát hàm l'?ng ho$t ch%t precocen I và II trong tinh d8u lá theo các ph';ng pháp ly trích khác nhau

Theo các tài li!u n'&c ngoài "ã "'?c công b/, precocen I và II có ho$t tính kháng hormon juvenile "/i v&i m1t s/ lo$i côn trùng Nh:ng ho$t ch%t này, thu1c nhóm "i#u khi4n quá trình phát tri4n c5a côn trùng, "Oy nhanh sB bi(n thái côn trùng khi(n chúng b, ch(t 21 "1c h$i "/i v&i môi tr'9ng ít h;n

so v&i các thu/c tr+ sâu khác

PH!N III: NGUYÊN LICU VÀ PHDENG PHÁP NGHIÊN CFU

3.1 Nguyên li5u

Cây CC hôi thu hái tNnh VJnh Long trong nhi#u kho3ng th9i gian khác nhau cho nhi#u m.c "ích khác nhau

- MRu "'?c thu hái tháng 03/2006, chúng tôi dùng "4 "i#u ch( cao hexan

và nghiên c>u tinh d8u MRu này dùng "4 "i#u ch( cao hexan "'?c x- lý b)ng cách lo$i bC nh:ng ph8n b, sâu b!nh, ph;i trong bóng mát trong m1t tu8n, sau

"ó "em vào t5 s%y khô < nhi!t "1 50-60o

C "(n khi kh/i l'?ng mRu không thay "@i Kh3o sát tinh d8u thBc hi!n trên mRu nguyên li!u t';i "ã lo$i bC sâu b!nh

- MRu "'?c thu hái vào tháng 08/2006 "'?c dùng "4 ly trích tinh d8u theo ph';ng pháp ch'ng c%t h;i n'&c có hG tr? vi sóng và ch'ng c%t c@ "i4n

- T%t c3 các mRu "#u lBa ch0n lá già, lo$i bC ph8n lá non và ph8n b, sâu b!nh

- S/ l'?ng mRu mGi l8n: 10 kg

3.2 Hóa ch-t và thi2t b> dùng trong nghiên c9u

3.2.1 Hóa ch-t

Eter d8u hCa: ch'ng c%t phân "o$n 60-80oC, làm khan b)ng Na2SO4

Benzen, n-Hexan, Etyl acetate, dietyl eter "'?c ch'ng c%t và làm khan

b)ng Na2SO4

Thu/c th- hi!n hình sDc ký b3n mCng: Vanilin/H2SO4

Silicagel dùng cho sDc ký c1t: dùng l'?ng silicagel g%p 30 l8n l'?ng cao, ho$t hoá < 110oC trong 1 gi9 tr'&c khi s- d.ng

Silicagel 60 (0,063-0,1mm), Merck

3.2.2 Thi2t b>

B1 tách tinh d8u Clavenger

Máy cô quay hi!u BUCHI

C1t sDc ký có kích th'&c 50x600 mm và 25x400 mm

SDc ký l&p mCng lo$i kiesegel 60 F254, Merck

Máy quang ph@ h7ng ngo$i, máy c1ng h'<ng t+ h$t nhân và máy sDc ký khí ghép kh/i ph@ (GC-MS)

Nguyên li!u

Bình ch'ng c%t

Tinh d8u và n'&c

- Cô quay thu h7i dietyl ete < nhi!t "1 th%p

S' 0H 1: Ly trích tinh d;u b?ng ph('ng pháp ch(ng c-t cG 0i/n

b Ly trích có s hI tr) cAa vi sóng

Vi sóng "'?c xem là ph';ng pháp r%t m&i trong vi!c ly trích tinh d8u t+ ngu7n nguyên li!u thBc v6t Vi sóng còn có tên g0i là sóng vi ba (microwave) là sóng "i!n t+ có t8n s/ 30GHz – 300MHz t';ng >ng v&i "1 dài sóng t+ 1cm "(n 1m N*ng l'?ng c5a vi sóng r%t th%p không quá 3.10-3kcal.mol-1, do "ó không th4 làm ">t n/i c1ng hóa tr, c5a h?p ch%t h:u c; (Ec-

c= 83 kcal.mol-1), "7ng th9i cIng không có kh3 n*ng ion hóa phân t- v6t ch%t

mà vi sóng xuyên th%u v6t ch%t và làm nóng v6t ch%t ngay t+ bên trong, n'&c trong các t( bào thBc v6t b, nóng lên, áp su%t bên trong t*ng "1t ng1t làm các

mô ch>a tinh d8u b, vT ra Tinh d8u thoát ra bên ngoài lôi cu/n theo h;i n'&c sang h! th/ng ng'ng t

Hình 3: H5 th+ng ch(ng c-t cG 0i/n

Ngày nay, vi sóng "ã mang l$i r%t nhi#u l?i ích cho cu1c s/ng con ng'9i, t+ các th( h! lò vi sóng gia d.ng "(n nh:ng thi(t b, phát sóng vi ba chuyên dùng Trong công nghi!p, vi sóng "'?c >ng d.ng "4 s%y gG, gi%y, t; s?i, thu/c hút, ngoài ra còn s- d.ng "4 s%y khô, kh- trùng và làm tan "ông các lo$i nông s3n Trong y khoa, vi sóng có th4 t$o ra nh:ng hi!u >ng sinh lý

có l?i cho c; th4 và hi!n nay "ang "'?c nghiên c>u "4 "i#u tr, các kh/i u trong c; th4, "Ac bi!t là c*n b!nh ung th' vú < ph n: Vi sóng "ang "'?c nghiên c>u m< r1ng >ng d.ng trong t@ng h?p h:u c; và ly trích các s3n phOm

tB nhiên có trong thBc v6t

H8u h(t các thí nghi!m trên "#u ti(n hành trong môi tr'9ng khí quy4n, trong "ó có hàm l'?ng oxi cao khi(n cho nhi#u h?p ch%t d= bay h;i b, oxy hóa Chính vì th( chúng tôi "ã có sáng ki(n lDp thêm m1t s/ dây và van dRn khí "4 t$o "i#u ki!n cho quá trình ly trích tinh d8u có sB chi(u x$ vi sóng

"'?c ti(n hành trong môi tr'9ng khí tr;

Radio

Microwave

Infrared (IR) Visible Near UV Vacuum UV

X rays Gamma rays

10 -4

Nguyên li!u t';i (100g) lá t';i, cDt nhC r7i cho vào h! th/ng ch'ng c%t

v&i công su%t chi(u x$ 600W, th9i gian chi(u x$ 15 phút, lAp l$i ba l8n l%y giá

tr, trung bình

3.3.2 Ph('ng pháp xác 0>nh thành ph;n hóa h7c tinh d;u

24 phân tích thành ph8n hóa h0c c5a tinh d8u, chúng tôi dùng ph';ng

pháp sDc ký khí ghép kh/i ph@ (GC/MS) ti(n hành t$i Vi!n v6t li!u >ng d.ng

- Vi!n Khoa h0c và Công ngh! Vi!t Nam

Hi!u máy: Agilent Technologies 6890N Network GC sytem

Agilent Technologies 5973 inert (Mass selective Detecter)

C1t sDc ký: HP 5MS 0,25mm «30m »

S/ hi!u: Agilent 190915433 350oC Max

Ch';ng trình nhi!t: 40oC trong 2 phút, 1phút t*ng 2o "(n 200oC gi:

trong 2 phút, t*ng 10oC 1 phút "(n 250oC

3.3.3 Ph('ng pháp 0>nh l()ng precocen trong d>ch chi2t hexan

H?p ch%t precocen I và II là nh:ng ch%t không phân cBc, chúng tôi ch0n

dung môi hexan "4 ly trích precocen ra khCi nguyên li!u thu "'?c cao hexan

Dung d,ch n'&c

Ti(n hành xà phòng hóa cao hexan b)ng KOH/c7n "4 lo$i bC lipid thu "'?c cao hexan "ã xà phòng hóa (ch>a precocen "ã làm giàu)

2,nh l'?ng preocen b)ng sDc ký c1t silicagel v&i dung môi gi3i ly có "1 phân cBc t*ng d8n, theo dõi quá trình sDc ký b)ng sDc ký b3n mCng Ho$t ch%t precocen thu "'?c qua sDc ký c1t "'?c khUng ",nh l$i c%u trúc b)ng các ph';ng pháp ph@ nghi!m: IR, NMR, MS

* "i*u ch2 cao hexan

Nguyên li!u lá t';i (7,5kg) lo$i bC nh:ng lá sâu, vàng r7i "em s%y khô

< 50-60o

C cho "(n khi kh/i l'?ng không "@i, xay nhuy=n B1t thô c5a lá cây

"'?c t6n trích v&i hexan trong máy trích Soxhlet L0c d,ch trích hexan, cô quay < áp su%t th%p, thu "'?c cao hexan (70g)

* "i*u ch2 cao hexan ph;n không xà phòng hoá

Hòa tan 70 gam cao hexan c5a lá cây CC hôi và 70 gam KOH v&i 800ml EtOH 95% T%t c3 cho vào bình c8u 2 lít "un hoàn l'u trong 4 gi9 24 ngu1i, cho NaCl rDn vào hGn h?p trên, khu%y "#u "4 dung d,ch tách l&p, l0c l%y ph8n dung d,ch có màu xanh "en Pha loãng b)ng n'&c c%t

Chi(t dung d,ch trên nhi#u l8n v&i eter etil Ph8n d,ch eter etil r7i r-a nhi#u l8n v&i n'&c c%t "(n khi n'&c r-a có pH=7, làm khan d,ch eter etil b)ng

Na2SO4 Cô quay thu h7i dung môi, thu "'?c 11,93 gam cao hexan ph8n không xà phòng hóa

* ">nh l()ng precocen I và precocen II trong cao hexan 0ã xà phòng hóa

ThBc hi!n sDc ký c1t silicagel trên 10g cao hexan "ã xà phòng hóa v&i "i#u ki!n sau:

- Kích th'&c c1t: 30*800 mm

- S- d.ng 300 gam silicagel "ã ho$t hoá

- N$p c1t '&t v&i dung môi eter d8u ho3

- Dung môi gi3i ly: eter d8u ho3, CHCl3 và hGn h?p c5a chúng v&i "1 phân cBc t*ng d8n

MGi phân "o$n sDc ký 100ml "'?c h>ng vào các l0 có "ánh s/ th> tB Nh:ng l0 có k(t qu3 sDc ký l&p mCng gi/ng nhau "'?c g1p chung l$i Thu

"'?c 6 phân "o$n

ThBc hi!n sDc ký c1t l8n hai trên phân "o$n 3, và phân "o$n 4, ch%t h%p

ph silicagel, dung môi gi3i ly n-Hexan, Etylacetate và hGn h?p c5a chúng M phân "o$n 16-35 thu "'?c d8u vàng (0,025g), "At tên A32 M phân "o$n 36-53 cho tinh th4 màu trDng (0,016g), "At tên là A43

A32 "'?c nh6n danh là precocen I và A43 "'?c nh6n danh là precocen II

3.4 ">a 0i/m làm th.c nghi5m

- Các thí nghi!m ly trích tinh d8u b)ng ph';ng pháp c@ "i4n và vi sóng;

ly trích và cô l6p precocen I, precocen II "'?c ti(n hành t$i t$i thí nghi!m nghiên c>u các ch%t có ho$t tính sinh h0c - Phân vi!n Hóa h0c các H?p ch%t Thiên nhiên t$i Tp.H7 Chí Minh, 01 M$c 2Jnh Chí, qu6n 1

70g Hexan thô

& 70g KOH / 800ml EtOH 95%

& 2un h7i l'u trong 4 gi9

& Thêm NaCl

& Pha loãng b)ng n'&c

& T6n trích b)ng eter etyl

Pha n'&c Pha eter etyl

- Thành ph8n hóa h0c tinh d8u "'?c xác ",nh trên máy GC/MS c5a Vi!n V6t li!u >ng d.ng – 01 M$c 2Jnh Chi, qu6n 1

- Các ph@ NMR, MS và IR "'?c xác ",nh t$i Vi!n Hóa h0c- 18 Hoàng Qu/c Vi!t – Hà N1i

PH!N IV: KJT QUK VÀ BICN LULN 4.1 Kh:o sát hàm l()ng precocen trong tinh d;u

4.1.1 Tinh d;u lá theo mùa m(a và nMng

Cây CC hôi thu hái vào tháng 03/2006 và tháng 8/2006 "'?c trích ly tinh d8u b)ng ph';ng pháp c@ "i4n và ph';ng pháp ch'ng c%t có sB hG tr? vi sóng theo s; "7 ly trích 1 và 2 cho k(t qu3 nh' sau (b3ng 4)

B:ng 4: Hàm l()ng tinh d;u lá C6 hôi b?ng ch(ng c-t cG 0i/n

Qua k(t qu3 phân tích, chúng tôi nh6n th%y ph';ng pháp c@ "i4n thu

"'?c hàm l'?ng tinh d8u ít h;n so v&i ph';ng pháp có sB hG tr? c5a vi sóng Nguyên nhân có th4 là do ph';ng pháp vi sóng có tác d.ng "un nóng nguyên li!u t+ bên trong, làm cho nhi!t "1 và áp su%t bên trong c5a tuy(n tinh d8u t*ng, nên các tuy(n tinh d8u d= b, phá vT, thoát ra ngoài và "'?c lôi cu/n theo

Trong c3 hai ph';ng pháp ly trích, hàm l'?ng tinh d8u thu "'?c "/i v&i cây m0c < mùa m'a cao h;n so v&i cây m0c trong mùa khô 2i#u này hoàn toàn h?p lý do cây CC hôi phát tri4n m$nh vào mùa "ông và xuân, r%t 'a Om, 'a sáng và ch,u bóng mát Do "ó vào mùa m'a cây sinh tr'<ng m$nh nên hàm l'?ng tinh d8u thu "'?c trong lá cao h;n so v&i lá cây thu hái < mùa khô

4.1.2 Tinh d;u hoa C6 hôi

Hoa CC hôi "'?c thu hái vào tháng 8/2006, lo$i bC nh:ng hoa khô héo Nguyên li!u "'?c ly trích tinh d8u theo s; "7 1 và 2 cho k(t qu3 nh' sau (b3ng 5)

B:ng 5: Hàm l()ng tinh d;u hoa C6 hôi vào tháng 8/2006

K2t qu: (%)

L;n thí nghi5m Vi sóng CG 0i/n

Trong các ph';ng pháp trên, ph';ng pháp vi sóng t/n ít th9i gian h;n ph';ng pháp c@ "i4n vì các tuy(n tinh d8u d= dàng vT ra d'&i tác "1ng trBc ti(p c5a vi sóng, còn ph';ng pháp c@ "i4n ph3i tr3i qua giai "o$n thOm th%u, khu(ch tán tinh d8u bên trong t( bào và n'&c < bên ngoài

Ngoài nh:ng 'u "i4m trên, ph';ng pháp vi sóng còn h$n ch( các ph3n >ng

ph làm gi3m ch%t l'?ng tinh d8u do nhi!t "1 cao và th9i gian ch'ng c%t kéo dài nh' trong ph';ng pháp ch'ng c%t lôi cu/n h;i n'&c c@ "i4n

4.1.3 Kh:o sát thành ph;n và hàm l()ng các ch-t trong tinh d;u

24 phân tích thành ph8n hóa h0c c5a tinh d8u, chúng tôi dùng ph';ng pháp sDc ký khí ghép kh/i ph@ (GC/MS)

Hi!u máy: Agilent Technologies 5973 inert ( Mass selective Detector) C1t sDc ký: HP 5MS 0,25mm «30m » 0,25$m

S/ hi!u: Agilent 190915433 350oC Max

K(t qu3 phân tích thành ph8n hóa h0c tinh d8u lá và hoa cây CC hôi cho k(t qu3 sau:

B:ng 6: Thành ph;n hóa h7c tinh d;u lá cây C6 hôi thu hái vào 8/2006

mùa nDng là precocene I, precocene II, ! - caryophyllene 2i#u "ó ch>ng tC

thành ph8n hoá h0c c5a tinh d8u cây CC hôi không có sB khác bi!t nhi#u so v&i các tài li!u "ã công b/ tr'&c "ây Tuy nhiên hàm l'?ng ho$t ch%t cIng có

sB khác bi!t "áng k4 Qua b3ng s/ li!u phân tích cho th%y hàm l'?ng

precocene II trên mRu chúng tôi khá trùng h?p trên cây CC hôi m0c t$i Congo[29] và Nigieria [10] Hàm l'?ng precocen I cao h;n r%t nhi#u so v&i cây m0c t$i mi#n BDc – Vi!t Nam Nguyên nhân < "ây có th4 do "i#u ki!n th@ nh'Tng, khí h6u

Trong cùng m1t lo$i nguyên li!u (lá và hoa), ph';ng pháp ly trích có hG tr? c5a vi sóng cho hàm l'?ng precocen I cao (60%-86%), ng'?c l$i ph';ng pháp c@ "i4n cho hàm l'?ng precocen II cao h;n so v&i ph';ng pháp vi sóng Nh' v6y ph';ng pháp t/t "4 ly trích precocen trong cây CC hôi là ph';ng pháp vi sóng, v&i 'u "i4m sau:

- Th9i gian ly trích ngDn, chN c8n 15 phút là trích ki!t tinh d8u 2i#u này r%t có giá tr, do ti(t ki!m th9i gian và n*ng l'?ng s- d.ng so v&i ch'ng c%t c@

"i4n; Hàm l'?ng precocen I trong tinh d8u r%t cao (t+ 60 – 86%) so v&i ly trích b)ng ph';ng pháp c@ "i4n

4.2 Hàm l()ng precocen trong d>ch chi2t hexan

N$p 10 gam cao hexan "ã xà phòng hóa theo s; "7 3 c5a cây CC hôi vào c1t sDc ký v&i ch%t h%p ph silicagel, h! dung ly eter d8u hCa, CHCl3 và hGn h?p c5a chúng v&i "1 phân cBc t*ng d8n

Theo dõi quá trình sDc ký c1t b)ng sDc ký l&p mCng v&i h! dung môi gi3i

ly hexan : etyl acetat 9:1, thu/c th- hi!n hình là dung d,ch vanilin/H2SO4"Ac K(t qu3 sDc ký c1t silicagel trên cao eter d8u ho3 v&i 6 phân "o$n