công nghệ enzyme trong xúc tác

Quá trình chuy nhiều chu trình chuyển hóa các ch không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà c này được xúc tác bởi một loại protein đ bào được gọi là enzyme ngoại bào.. Bản chất sinh học của e

Khoa Công nghệ Sinh học

**************************

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Tài liệu lưu hành nội bộ)

CBDG: ThS Lê Thanh Hải

HIAST

TPHCM, 03/2013

MỤC LỤC

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme 1

1.2 Khái niệm về enzyme 2

1.2.1 Bản chất sinh học của enzyme 3

1.2.2 Bản chất hóa học của enzyme 4

1.2.3 Cấu trúc của enzyme 5

1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme 7

1.3.1 Cơ chế xúc tác của enzyme 7

1.3.2 Năng lượng xúc tác 8

1.3.3 Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất 8

1.3.4 Động học của phản ứng enzyme 9

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 10

1.3.5.1 Nhiệt độ 10

1.3.5.2 pH 11

1.3.5.3 Chất kìm hãm 11

1.3.5.4 Chất hoạt hóa 12

1.3.6 Tính chất đặc hiệu của enzyme 13

1.4 Phân loại enzyme 13

1.4.1 Danh pháp quốc tế của enzyme 13

1.4.2 Phân loại enzyme 14

1.4.2.1 Oxydoreductase 14

1.4.2.2 Transpherase 14

1.4.2.3 Hydrolase 15

1.4.2.4 Lipase 15

1.4.2.5 Isomerase 15

1.4.2.6 Ligase 15

1.5 Phương pháp tách và làm sạch enzyme 15

1.5.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 15

1.5.2 Phương pháp gây biến tính chọn lọc 16

1.6 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 17

1.6.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E 17

1.6.2 Đơn vị hoạt độ 17

2 KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 18

2.1 Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme 18

2.2 Kỹ thuật cơ bản 19

2.2.1 Các phương pháp cơ học tách enzyme 19

2.2.2 Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật 19

2.2.2.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: 20

2.2.2.2 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học: 20

2.2.2.3 Các phương pháp cô đặc 21

2.2.2.4 Các phương pháp tinh sạch enzyme 21

2.2.2.5 Tạo sản phẩm enzyme 21

3 ENZYME CỐ ĐỊNH 22

3.1 Chuyển hóa sinh học 22

3.1.1 Chuyển hóa vật chất do enzyme tự do hay enzyme hòa tan 22

3.1.2 Chuyển hóa vật chất bằng enzyme không hòa tan 22

3.1.3 Chuyển hóa vật chất do các quá trình lên men 23

3.1.4 Chuyển hóa vật chất do tế bào cố định 23

3.2 Đặc điểm của enzyme cố định 23

3.3 Phương pháp tạo enzyme cố định 23

3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định 23

3.3.2 Phương pháp cố định enzyme 25

3.3.2.1 Chất mang dùng để cố định enzyme 25

3.3.2.2 Phương pháp cố định enzyme 25

3.4 Ứng dụng của enzyme cố định 26

3.4.1 Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase 27

3.4.2 Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định 28

4 THU NHẬN ENZYME 28

4.1 Chọn nguồn nguyên liệu 28

4.2 Thu nhận enzyme 31

5 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 32

5.1 Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới 32

5.2 Ứng dụng trong y học 34

5.3 Ứng dụng trong hóa học 34

5.4 Ứng dụng trong công nghiệp 34

5.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 34

5.4.2 Ứng dụng trong công nghiệp dệt 36

5.4.3 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 36

5.5 Ứng dụng trong nông nghiệp 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

1 MỞ ĐẦU

1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme

Enzyme học là môn học nghiên cứu về vật chất phân tử có hoạt tính sinh học Môn học này phát triển rất mạnh nhờ những thành tựu của môn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học và cả những tiến bộ của ngành hóa học và vật lý học

Bảng 1.1 Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học[2]

STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển

1 1833 Payen và Persoz tách được diastase từ malt

2 1874 Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu

3 1876 Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme

4 1897 Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa

đường glucose thành cồn và CO2

5 1900 Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da

6 1913 Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa

7 1917 Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và ứng dụng trong ngành

dệt

8 1920 – 1928 Will Slitter tinh sạch được enyzme

9 1926 Samner kết tinh được enyme urease

Northrop kết tinh được protease

10 1928 Fleming phát hiện ra penicilline

11 Thế chiến II Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mô hình công nghiệp, sử dụng amyloglucosidase

đường hóa tinh bột Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline

12 1969 Tanabec co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid Sử dụng

glucose isomerase trong sản xuất dịch đường giàu fructose

13 1972 Boyer et al đưa ra kỹ thuật di truyền Kỹ thuật này có tác động tích cực trong

công nghệ enzyme

14 1973 Tanobe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào

Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein

15 1984 Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acrylamide và một loại quá trình sản xuất có sự

tham gia của enzyme

16 1984 - nay

Đã phát hiện hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kết quả cao

Diastase: là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose Diastase là enzyme đầu tiên

được phát hiện ra Nó được chiết tách từ malt vào năm 1833 bởi Anselme Payen và Jean-Francois Persoz – nhà Hóa học tại nhà máy đường của Pháp Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), trong dịch nha nóng, các enzyme này thủy phân tinh bột trong hạt đại mạch thành các đường hòa tan và vì thế

có thể tách phần bỏ malt với phần còn lại của hạt Ngày nay, diastase là α, β hoặc γ-amylase

Rennet là enzyme được sản xuất trong dạ dày của động vật có vú khi còn trong giai đoạn bú sữa mẹ và

thường được sử dụng để làm phomai Rennet là một hỗn hợp enzyme, bao gồm: các enzyme thủy phân protein (protease) gây đông tụ sữa, có thể tách phần sữa đông (phần chất rắn) và phần huyết thanh sữa (phần chất lỏng) Những enzyme hoạt động trong dạ dày bê được gọi là chymosin hoặc rennin Ngoài ra, cũng có những enzyme quan trọng khác như: pepsin và lipase

Protease: (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là enzyme thủy phân protein

α-amylase là enzyme thủy phân liên kết alpha của phân tử polysaccharide như tinh bột và glycogen thành

glucose và maltose Alpha amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra, chúng còn có mặt trong các loại hạt có chứa tinh bột và được tiết ra bởi một số loại nấm

Urease: là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO2) và amoniac (NH3), hiện diện trong vi khuẩn đường ruột Urease được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm men và thực vật

1.2 Khái niệm về enzyme

Sinh vật được phân ra 2 nhóm dựa vào cấu tạo cơ thể của chúng: sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào Mặc

dù chúng có sự khác biệt rất lớn về cấu tạo cơ thể và những đặc điểm sinh lý khác nhau nhưng chúng đều giống nhau về trao đổi chất với môi trường bên ngoài và một số đặc điểm về biến dị di truyền

Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất của cơ thể ở trong tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoài Quá trình trao đổi chất bên trong tế bào và giữa tế bào với môi trường bên ngoài là biểu hiện sinh động nhất của sự sống Sự khác nhau giữa tế bào sống và vật chất không phải sự sống chính là khả năng trao đổi chất này Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết Do đó mối quan hệ giữ cơ thể với bên ngoài là mối quan hệ hữu cơ

Quá trình trao đổi chất bao gồm quá trình dị hóa và quá trình đồng hóa Quá trình dị hóa là quá trình phân giải vật chất để cung cấp cho tế bào năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào, quá trình này có thể xảy ra trong tế bào hoặc ngoài tế bào

Quá trình di hóa xảy ra trong tế bào là quá trình cung cấp năng lượng, vật chất cho quá trình tổng hợp vật

chất để tạo ra sinh khối nhằm làm đổi mới vật chất tế bào

Quá trình dị hóa ngoài tế bào phần lớn chỉ đáp ứng như cầu về vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp các

chất trong tế bào Năng lượng tạo ra từ quá trình dị hóa ngoài tế bào thường được giải phóng ở dạng nhiệt năng

bào Trong quá trình tổng hợp, m

theo mà sẽ thoát ra khỏi tế bào Hi

sinh tổng hợp thừa có liên quan ch

truyền, nhiều khi điều chỉnh hệ gen s

chất được tạo ra do quá trình phân gi

(quá trình dị hóa ngoài tế bào) M

dị hóa trong tế bào)

Quá trình trao đổi chất liên tục đư

chất trong thiên nhiên Quá trình chuy

nhiều chu trình chuyển hóa các ch

không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà c

này được xúc tác bởi một loại protein đ

bào được gọi là enzyme ngoại bào Các enzyme th

nội bào và enzyne ngoại bào đều đư

1.2.1 Bản chất sinh học của enzyme

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứ

sinh vật sống tổng hợp nên và tham gia vào cá

Như vậy, bản chất sinh học của enzyme là s

sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh v

Enzyme được tạo ra trong tế

tạp và được điều khiển, kiểm soát r

Enzyme tham gia phản ứng c

Enzyme tham gia phản ứng trong đi

enzyme được tổng hợp và ho

độ của cơ thể và của tế bào sinh v

động trong khoảng 30 - 40oC

t cho tế bào chỉ xảy ra trong tế bào Quá trình này thư

ng do quá trình dị hóa Như vậy, quá trình trao đổi chất được xem như h

ng xung quanh

Hình 1.1 Hệ thống mở của tế bào sinh vật

i chất tạo ra 2 dạng sản phẩm:

m được tạo ra cả trong quá trình phân giải và cả trong quá trình t

c tham gia trực tiếp nên vật chất tế bào và tham gia các các quá trình t

m cũng được tạo ra từ quá trình tổng hợp và quá trình phân gi

p, một số vật chất được tạo ra không tham gia vào quá trình trao bào Hiện tượng này được coi như quá trình sinh tổng h

có liên quan chặt chẽ đến hệ di truyền có trong tế bào Do đó, vi

gen sẽ thu được lượng lớn các sản phẩm sinh tổng h

o ra do quá trình phân giải sẽ không tham gia vào quá trình trao đổi ch

bào) Một số vật chất khác thoát ra khỏi tế bào vào môi trư

c được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự

t trong thiên nhiên Quá trình chuyển hóa theo con đường sinh vật đóng vai trò r

n hóa các chất có trong thiên nhiên Các phản ứng sinh họ

t mà cả ở ngoài môi trường, bao quanh tế bào đó Các ph

i protein đặc biệt gọi là enzyme Các enzyme tham gia các ph

i bào Các enzyme thực hiện trong tế bào gọi là enzym

u được tổng hợp trong tế bào

a enzyme

ứu về enzyme và đã đi đến thống nhất: enzyme là m

p nên và tham gia vào các phản ứng sinh học

a enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học và thbào sinh vật Các loại enzyme đều có những đặc tính chung như sau:

ế bào sinh vật: quá trình tổng hợp enzyme là một quá trình h

m soát rất chặt chẽ

ng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách kh

ng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa Vì trong quá trình s

p và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhibào sinh vật thường là nhiệt độ thấp Phần lớn nhiệt đ

C

ường phải thu nhận năng

c xem như hệ thống mở

trong quá trình tổng hợp bào và tham gia các các quá trình tế bào

quá trình phân giải của tế

o ra không tham gia vào quá trình trao đổi chất tiếp

ng hợp thừa Hiện tượng bào Do đó, việc điều chỉnh hệ di

ng hợp thừa Môi số vật

i chất nằm ở ngoài tế bào bào vào môi trường (quá trình trình

biến đổi liên tục của vật

ò rất quan trọng trong rất

ọc xảy ra thường xuyên bào đó Các phản ứng sinh học

i là enzyme Các enzyme tham gia các phản ứng ngoài tế

i là enzyme nội bào Cả enzyme

enzyme là một loại protein được

Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học Quá trình chuyển hóa này được

thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme Các enzyme này lần lượt thay thế nhau xúc tác để các phản ứng lần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành chu kỳ chuyển hóa khép kín Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước

sẽ là cơ chất cho phản ứng sau

Enzyme có thể thực hiện một phản ứng: Các phản ứng thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện

chúng trong ống nghiệm) Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn (một phản ứng)

mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng

Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi đó, các phản ứng hóa học

được xúc tác vởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất lớn Nhờ có hoạt động xúc tác của enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng lượng ôn hòa

Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Gen quyết định tổng hợp ra một loại

enzyme Mỗi một enzyme quyết định một phản ứng sinh hóa Các nhà khoa học đưa ra cơ chế sau:

Một gen => một enzyme => một phản ứng Như vậy, gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của enzyme Cơ chế này có một ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật

1.2.2 Bản chất hóa học của enzyme

Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của chúng, ta sẽ thấy chúng thuộc 2 nhóm:

1 Nhóm enzyme đơn cấu tử:

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzyme đơn cấu tử

2 Nhóm enzyme đa cấu tử

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có 2 thành phần:

Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein thuần

Agon: Phần thứ 2 là thành phần không phải protein Phần này thường là những chất hữu cơ đặc hiệu

có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác

Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếu thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu có đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt động được Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này còn được gọi là chất cộng tác (cofactor)

Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất lỏng với phần protein Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích qua màng Ở đây xảy ra 2 hiện tượng:

Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt với protein bằng liên kết đồng hóa trị được gọi là nhóm phụ (prosthetic)

Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúng ra khỏi protein được gọi là coenzyme

Tuy nhiên, sự phân biệt này chỉ mang tính chất tương đối Ngoài ra các nhà khoa học cũng cho thấy, trong thành phần của những enzyme có sự hiện diện của một số kim loại Các kim loại này thường là một trong những thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu

Ví dụ: trong hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin

Các kim loại có trong thành phần của enzyme thường rất dễ tách ra khỏi enzyme Trong trường hợp enzyme mất kim loại, chúng sẽ mất hoạt tính Khi ta đưa các kim loại tương ứng vào các enzyme, hoạt tính enzyme lại được khôi phục Tính chất này mang tính chất thuận nghịch Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ Tuy nhiên các nhà khoa học cũng cho rằng, có thể kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase

Bảng 1.2 Một số enzyme có chứa kim loại [2]

STT Enzyme Kim loại

1 Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe)

1.2.3 Cấu trúc của enzyme

Enzyme là protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn

có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme Không phải toàn bộ các phần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân

tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm:

Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ chất

Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác

Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác Nếu bị tác động bởi các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ các chất, bộ khung này sẽ biến đổi cấu trúc không gian Từ đó làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme

Phần của phân tử enzyme không có liên quan đến hoạt tính enzyme, nếu bị tác động, bị mất đi hoặc bị biến đổi sẽ hoàn toàn không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan Các nhóm hóa học này hoạt động có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme - cơ chất Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm:

Nhóm NH2 của lysine

Nhóm -SH của cysteine

Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid

Các gốc amino acid tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1) Trong thực tế, chuỗi popypeptide của enzyme tồn tại ở trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên các amino acid thường tồn tại gần nhau theo cấu trúc không gian

Do cấu trúc không gian như vậy, trung tâm hoạt động được tạo thành

Trong trung tâm hoạt động của enzyme người ta còn thấy có ion kim loại Các ion kim loại có mặt trong trung tâm hoạt động của enyzme có vai trò xúc tác rất lớn

Ngoài các gốc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học còn cho thấy các nhóm chức của coenzyme cũng được coi như một phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzyme

Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động Tuy nhiên cũng có enzyme có 2 trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase của gan), thậm chí có enzyme có tới 4 trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase của nấm men)

Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động có liên quan tới cơ chất Các nhà khoa học khi nghiên cứu vấn

đề này đã đưa ra 3 quan điểm quan trọng:

1 Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới có thể kết hợp được với trung tâm hoạt động của enzyme để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất

Theo quan điểm này, cơ chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động là hiện tượng kết hợp rất chặt chẽ và mang tính đặc hiệu cao Chính vì thế, mỗi loại enzyme chỉ có thể tham gia xúc tác phản ứng cho một loại cơ chất nhất định

2 Các loại enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian nhất định

Các trung tâm hoạt động thường được hình thành sẵn ở các enzyme Chính những trung tâm hoạt động của enzyme quyết định cho phép những cơ chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động mới được kết hợp vào Quan điểm này do Fisher đề xướng Thuyết của Fisher tuy đã giải thích được các hiện tượng gắn kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme nhưng nhiều kết quả thực nghiệm, thuyết này chưa giải thích được trọn vẹn

3 Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland được nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn

Theo thuyết này, các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa có thể tham gia xúc tác ngay Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme Chính tác động cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức của trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp, chính xác để gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá trình xúc tác

Như vây, Koshland cho rằng trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động cảm ứng của cơ chất Chính cơ chế mềm dẻo này của trung tâm hoạt động đã giải thích được sự cạnh tranh giữa cơ chất và các chất không phải cơ chất nhưng lại có cấu trúc không gian giống cơ chất Khi đó, các chất giống cơ chất chiếm chỗ trong trung tâm hoạt động của enzyme và phản ứng cơ chất không xảy ra

Hình 1.2 Mô hình của Fisher giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất

Hình 1.3 Mô hình của Kosland giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất

1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme

1.3.1 Cơ chế xúc tác của enzyme

Mọi vi sinh vật đều được cấu tạo từ tế bào Các tế bào luôn luôn tiến hành quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài bằng những phản ứng sinh hóa Các phản ứng xảy ra luôn luôn được xúc tác bởi các enzyme của tế bào Như vậy, enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý của tế bào Tác động của enzyme vào các phản ứng sinh hóa mang 2 ý nghĩa đối với tế bào:

1 Làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng

Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điều kiện ôn hòa, trùng với nhiệt độ của cơ thể Các phản ứng enzyme thường không đòi hỏi nhiệt độ cao, do đó nó đảm bảo cho mọi hoạt động sinh lý bình thường của tế bào Trong khi đó, năng lượng chi phí cho những phản ứng hóa học thường rất cao

Đặc điểm làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme có ý nghĩa rất lớn trong sinh lý của sinh vật Đặc điểm này gắn liền với quá trình tiến hóa của sinh vật, nếu nhiệt độ cơ thể tăng sẽ lảm rối loạn toàn bộ quá trình sinh lý của tế bào Khi đó cơ thể sẽ chuyển từ trạng thái sinh lý bình thường sang trạng thái bệnh lý Cơ thể ở trạng thái bệnh lý là kết quả của sự rối loạn các phản ứng enzyme Chính vì thế, việc duy trì trạng thái sinh lý bình thường của tế bào hay của cơ thể đồng nghĩa với việc duy trì hoạt động hài hòa của các phản ứng enzyme

2 Enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hóa thường làm tăng tốc độ phản ứng

Tốc độ phản ứng tăng sẽ làm tăng mức độ chuyển hóa cơ chất Như vậy quá trình trao đổi chất của tế bào

sẽ tăng Kết quả là tế bào sẽ tăng nhanh về số lượng và khối lượng Như vậy, enzyme không chỉ đóng vai trò duy trì trạng thái sinh lý của tế bào mà còn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và sinh sản của

tế bào, duy trì sự chuyển hóa vật chất trong các chu trình chuyển hóa trong thiên nhiên Nhờ có hoạt động của enzyme mà khối lượng cơ chất được chuyển hóa trong một đơn vị thời gian trong tế bào lớn gấp hàng ngàn lần khối lượng tế bào

Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn thay đổi tính chất hóa học Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ

enzyme – cơ chất Phức hệ này thường không bền Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy

ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lượng

Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ

bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra

khỏi enzyme

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme:

Trong đó: E – enzyme (enzyme) S – Cơ chất (substrate) P – Sản phẩm (products)

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác của enzyme 1.3.2 Năng lượng xúc tác

Enzyme tham gia hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể sống Nhờ hoạt động xúc tác của enzyme, các tế bào có thể chuyển hóa lượng cơ chất rất lớn Enzyme sử dụng nguồn năng lượng nào và sử dụng năng lượng bằng cách nào để tiến hành quá trình xúc tác mà khả năng xúc tác lại lớn như vậy?

Các nhà khoa học đưa ra 2 cách sử dụng năng lượng liên kết để tiến hành quá trình xúc tác:

Thứ nhất: enzyme sử dụng năng lượng liên kết để làm giảm năng lượng hoạt hóa Năng lượng này được

giải phóng trong quá trình hình thành liên kết yếu trong tương tác qua lại giữa enzyme và cơ chất

Thứ hai: enzyme sử dụng năng lượng liên kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thông qua cơ chế sau:

Giảm entropy: enzyme và cơ chất luôn ở trạng thái chuyển động trong dung dịch lỏng Nếu không có năng lượng liên kết, enzyme sẽ rất khó định hướng tác động lên cơ chất, giữ cơ chất và định hướng phản ứng

Làm mất vỏ nước bao quanh: nhờ tương tác yếu giữa enzyme và cơ chất có khả năng làm giảm toàn

bộ liên kết hydrogen tồn tại giữa cơ chất và nước bao quanh

Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng làm căng hoặc uốn khúc cơ chất, tạo điều kiện cho enzyme xúc tác phản ứng dễ dàng

Năng lượng liên kết tạo ra cấu hình không gian của enzyme sao cho phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất

1.3.3 Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất

Brown và Henri là những nhà khoa học đầu tiên đưa ra thuyết “phức hợp trung gian” Sau đó, Michaelis

và Menten phát triển thêm

Theo thuyết này, enzyme sẽ kết hợp với cơ chất, tạo ra một phức hợp không gian giữa enzyme và cơ chất

Do tác dụng của enzyme, cơ chất bị biến đổi mạnh và cuối cùng tạo ra sản phẩm Sự tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất thường xảy ra rất nhanh và về bản chất thì phức hợp này hoàn toàn không bền vững Các tính chất này của phức hợp enzyme và cơ chất phụ thuộc rất nhiều ở bản chất hóa học của cơ chất

Để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất có đến năm loại liên kết tham gia Các liên kết này có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau Các liên kết này bao gồm: liên kết phối trí, liên kết hydrogen, liên kết ion, liên kết kị nước lực Van der Waals và liên kết do chuyển dịch điện tích

Enzyme là những phần tử protein có phân tử lượng lớn Trên bề mặt của phân tử enzyme tồn tại rất nhiều nhóm hóa học đặc hiệu Các nhóm chức này đóng vai trò quan trọng trong định hướng và giúp cơ chất enzyme tiếp cận với nhau Khi enzyme và cơ chất tương tác với nhau thường tạo ra liên kết yếu, tạo ra năng lượng kết hợp Năng lượng được tạo ở từng liên kết yếu này thường nhỏ, nhưng có nhiều năng lượng liên kết nên tổng năng lượng trong phản ứng enzyme là rất lớn

Enzyme sẽ sử dụng nguồn năng lượng này để làm giảm năng lượng trong phản ứng enzyme Năng lượng giảm trong phản ứng enzyme được chuyển qua hệ thống các chất tham gia phản ứng Lượng năng lượng giảm trong quá trình hoạt hóa phải bằng lượng năng lượng các chất tham gia phản ứng nhận được

Theo ý kiến của các nhà khoa học, đầu tiên cơ chất phải được hoạt hóa để chuyển sang trạng thái chuyển tiếp tạm thời để tương tác với cơ chất tạo nên phức enzyme – cơ chất (ES) Sau đó phức hợp này lại được hoạt hóa để chuyển thành trạng thái chuyển tiếp tạm thời sang phức hợp EP (P là sản phẩm) Sau đó phức hợp EP lại chuyển sang trạng thái tạm thời khác để tạo thành P và giải phóng E tự do Năng lượng của sản phẩm sẽ thấp hơn mức năng lượng của cơ chất ban đầu Toàn bộ quá trình phản ứng được diễn giải chính thức như sau

E + S => ES => EP => E + P Năng lượng cần thiết để làm giảm năng lượng hoạt hóa quá trình xúc tác, đồng thời cũng tạo ra tính đặc hiệu cho phân tử enzyme Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng nhận biết, chọn lọc cơ chất để tiến hành các phản ứng riêng theo bản chất từng loại enzyme

1.3.4 Động học của phản ứng enzyme

Năm 1913 hai nhà khoa học Michaelis và Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E) Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới

Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mô hình chuyển hóa trong phản ứng enzyme với một cơ chất duy nhất như sau:

Trong đó: k1, k2, k3, k4: là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

Khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme, người ta thường xác định vận tốc ban đầu của phản ứng khi

Lượng sản phẩm P tạo thành chưa đáng kể nên K4 là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ P và E nhỏ nhất và xấp xỉ bằng 0

Đồng thời nồng độ cơ chất rất lớn so với nồng độ enzyme tổng [Eo] Ngoài ra, phản ứng chuyển hóa

từ ES thành E + P là phản ứng quan trọng nhất, quyết định toàn bộ quá trình chuyển hóa S thành P Vận tốc phản ứng ES thành P + E tỷ lệ với nồng độ ES, khi nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng cao nên:

Giả sử nồng độ enzyme ban đầu được kí hiệu là [Eo], nồng độ phức enzyme – cơ chất là [ES], nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt được điểm cân bằng là [E] Ta sẽ có:

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất Ta có thể tính được vận tốc phản ứng trong trường hợp sau:

Thay (2, 3, 4, 5) vào (6) ta được:

k1([Eo] – [ES])[S] = (k2 + k3)[ES] (7)

Khi [S] >> [Eo] tất cả enzyme đều tham gia tạo phức ES và vận tốc phản ứng Vi sẽ đạt cực đại (Vmax),

ta có [ES] = [Eo]

Có thể viết:

Vi/Vmax = [ES]/[Eo] = 1/(1+km/[S]) (11) Phương trình Michaelis – Menten

Vi = Vmax[S]/(km + [S]) (12)

Hình 1.5 Phương trình Michaelis Menten

Nếu [S]<<km: ở nồng độ cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S]

Nếu [S]>>km: vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S] Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], V cũng không tăng theo

Nếu [S] = km; vận tốc phản ứng bằng ½ vận tốc cực đại

Người ta dễ dàng xác định được km và Vmax bằng cách nghịch đảo cả 2 vế của phương trình michaelis – menten:

1/Vi = (km + [S])/(Vmax[S]) (13) Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng y = ax + b

Nếu vẽ đồ thị, đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở -1/km và độ nghiêng bằng km/Vmax

Hình 1.6 Phương trình nghịch đảo của Michaelis Menten

Từ phương trình trên, ta dễ dàng xác định được vị trí Vmax, km trong thí nghiệm xác định tốc độ Vi của phản ứng enzyme với nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme

1.3.5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng

tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt

độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt

động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50oC Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác nhau Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70oC, thậm chí

có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 90oC

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu

Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo

vệ Người ta thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Hình 1.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme

VD: một số protease hoạt động ở pH kiềm (protease kiềm), một số lại hoạt động ở pH acid (protease acid)

và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính (protease trung tính)

Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật…

Hình 1.8 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme

1.3.5.3 Chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và

cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng

Các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết đồng hóa trị Theo đó, các chất kìm hãm gắn rất chặt vào enzyme, tạo thành phức enzyme – chất kìm hãm (EI) Phức hợp này bị phân rã rất chậm Tùy thuộc vào bản chất của chất kìm hãm mà người ta chia ra những chất kìm hãm sau:

Chất kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của

cơ chất Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động Nếu chất kìm hãm đã chiến được vị trí trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với

cơ chất Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm

Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều có xu hướng chiếm vị trí trong trung tâm hoạt động Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào 2 yếu tố:

Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất canh tranh Nếu nồng độ cơ chất đủ lớn sẽ loại trừ được hiện tượng cạnh tranh

Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với enzyme

Chất kìm hãm không cạnh tranh:

Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì

cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme

Khi chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme sẽ làm vận tốc phản ứng enzyme bị giảm mặc dù quá trình này không làm thay đổi ái lực giữa enzyme và cơ chất Mức độ kìm hãm của chất kìm hãm không cạnh tranh không phụ thuộc vào tương quan nồng độ cơ chất và chất kìm hãm Cơ chất dù có lượng lớn bao nhiêu cũng không loại trừ được tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm

Các chất kìm hãm không cạnh tranh có thể là các chất sau:

1 Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm

hãm không cạnh tranh Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và B Khi đó sản phẩm P1, P2 được xem là chất kìm hãm không cạnh tranh

2 Kìm hãm do thừa cơ chất: trong phản ứng enzyme thông thường thì: E + S <=> ES => E + P

Khi ES được tạo thành rất có thể có một cơ chất gắn với ES tạo thành ESS làm chúng không thể chuyển hóa tạo tiếp tục được để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme tự do

Hình 1.9 Chất kìm hãm cạnh tranh Hình 1.10 Chất kìm hãm không cạnh tranh

Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạ

khả năng phá vỡ một số liên kết

chức năng trong trung tâm hoạt đ

1.3.6 Tính chất đặc hiệu của enzyme

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện kh

Khi tham gia vào các phản ứng , các lo

nhiên không phải cơ chất nào cũng có kh

enzyme Người ta phân tích đặc hi

A – đặc hiệu tuyệt đối

Là khả năng xúc tác của enzyme đ

có khả ngăng xúc tác đối với một cơ ch

B – đặc hiệu tương đối

Là khả năng xúc tác của enzyme tác d

C – đặc hiệu quang học (đặc hiệu l

Là khả năng xúc tác của enzyme đ

và trans)

1.4 Phân loại enzyme

1.4.1 Danh pháp quốc tế của enzyme

Khi số lượng enzyme mới được phát hi

người tìm ra nó Dần dần, theo th

ấy có tính chất gần giống nhau ho

những quy ước quốc tế về tên gọ

enzyme đó thuộc nhóm nào và bả

Theo quy ước quốc tế, tên gọi củ

kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó, tên g

ạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen ho

t trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác d

t động của enzyme

Hình 1.11 Chất hoạt hóa enzyme

a enzyme

n khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhấ

t đặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rất l

ả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều cơ ch

nh Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiệu ở một số ki

ng biểu hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho m

nh trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứ

ng , các loại cơ chất phải gắn với trung tâm hoạt đũng có khả năng tiếp cận và gắn được vào với trung tâm ho

c hiệu cơ chất theo mức độ sau:

a enzyme đối với một cơ chất nhất định Ngoài cơ chất này ra, enzyme

t cơ chất nào khác nữa

a enzyme tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định

u lập thể)

a enzyme đến một trong 2 dạng đồng phân quang học của cơ ch

a enzyme

c phát hiện còn ít, người ta thường gọi tên enzyme theo ý thích c

n, theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày một nhiều và nh

ng nhau hoặc giống nhau, người ta phân loại chúng thành t

ọi enzyme để khi nghiên cứu và ứng dụng chúng ai c

ản chất hóa học của chúng ra sao

ủa enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu ctham gia Theo đó, tên gọi của 1 enzyme thường có 2 phầ

xúc tác cho một kiểu phản ứng ứng chuyển vị, phản ứng

t động của enzyme Tuy

i trung tâm hoạt động của

t này ra, enzyme này không

a cơ chất (đồng phân cis

i tên enzyme theo ý thích của từng

Phần đầu là tên cơ chất: trong trường hợp phản ứng đó là phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên

gọi của 2 cơ chất viết cách nhau hai chấm

Phần sau chỉ khái quá bản thân của phản ứng:

Ví dụ: enzyme urease có tên gọi hệ thống là carbanite-amideohydrolase

Các enzyme thường ở cuối tên có đuôi “…ase”

Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại Ví dụ như trypsin, chimotrypsin, pepsin…

1.4.2 Phân loại enzyme

Năm 1960, hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp Mỗi lớp lại chia ra làm nhiều tổ, mỗi tổ lại chia ra làm nhiều nhóm, chính vì thế, theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thường có 4 chữa số: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số thứ 4 chỉ enzyme

1 Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

2 Transpherase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

3 Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân

4 Liase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi

hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi

5 Isomerase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

6 Ligase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP… 1.4.2.1 Oxydoreductase

Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử Các enzyme này là những enzyme phức tạp Chúng bao gồm 2 thành phần Phần coenzyme của chúng là NAD+, NADP+, FMN, FAD, heme… Lớp enzyme này được phân hóa thành những nhóm sau:

A- Dehydrogenase: nhóm này tham gia vào các phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển chúng đến NAD+, NADP+, FMN, FAD

Các dehyrogenase xúc tác cho giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp, vận chuyển đồng thời cả proton và electron Ngoài ra, chúng còn tham gia xúc tác cho chiều ngược lại, chuyển H từ NADH+H+ hoặc NADPH+H+, FMNH2, FAD-H2 đến cơ chất và khử cơ chất Đây là những phản ứng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp

B – Oxydase: đây là phản ứng xúc tác cho quá trình chuyển electron đến oxy Chúng hoạt hóa oxy làm cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với oxy

C – Oxygenase: đây là enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp chất hữu

cơ có vòng thơm

Nhóm này có 2 loại, oxygenase và hydroxylase, oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy Hydrogenase xúc tác cho phản ứng kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH) vào hợp chất hữu cơ

D – Peroxydase: đây là enzyme có coenzyme là heme, xúc tác cho phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ khi có H2O2

1.4.2.2 Transpherase

Transpherase cũng thuộc lớp enzyme phức tạp Coenzyme của transpherase có bản chất hóa học rất khác nhau tùy theo vào bản chất của nhóm được chuyển vị Lớp transpherase bao gồm những enzyme tiêu biểu sau:

A – acyltranspherase: enzyme này tham gia chuyển hóa nhóm acyl thông qua coenzyme A, tạo thành phức CoAS-acyl Khi đó, nhóm carboxyl của acid kết hợp với nhóm –SH của coenzyme A tạo thành liên

kết thioester giàu năng lượng Các enzyme này có vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid và phân giải glucose

Glucosyltransferase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng vận chuyển đường hexose, pentose từ chất cho đến chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc của gốc phosphate, nguyên tử nitrogen của nhân vòng

Ngoài ra, enzyme này cũng tham gia xúc tác cho quá trình tạo cấu trúc phân nhánh trong phân tử glycogen, amylopectin

Phosphotransferase: enzyme này tham gia xúc tác chuyển hóa gốc phosphoryl Trong phản ứng này thường có sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho Gốc phosphate được chuyển từ ATP đến nhóm hydroxyl của alcohol hay saccharide

Năm 1960, Hartley chia proteinase ra làm 4 nhóm chính:

Proteinase serine: trong enzyme này, gốc serine đóng vai trò xúc tác ở trung tâm hoạt động Nhóm này bao gồm trypsin, chymotrypsin, elastase, các proteinase làm đông máu, acrosin

Proteinase thiol: trong trung tâm hoạt động có nhóm –SH trực tiếp tham gia phản ứng, bao gồm papain, bromelin, ficin

Proteinase kim loại: trong trung tâm hoạt động, kim loại có đóng vai trò quan trọng trong xúc tác

Proteinase acid (aspartic proteinase): trong trung tâm hoạt động có nhóm gammar carboxyl

B – lipase: enzyme này tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerol (dầu thực vật và

mỡ động vật) tạo thành acid béo tự do và glycerol Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết chứ không phải cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc

1.4.2.4 Lipase

Pyruvate decarboxylase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 ra khỏi phân tử pyruvic

acid, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde Đây là phản ứng quan trọng trong lên men rượu Enzyme này là enzyme đa cấu tử, coenzyme của chúng ta là thiamipiro phosphate

Fumarate hydrolase: enzyme này là xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước khỏi malic

acid tạo thành fumaric acid (acid có một nối đôi)

Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp Các phương pháp phá

vỡ tế bào thường sử dụng như:

1 Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa

bằng thiết bị đồng hóa…

2 Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm

3 Phương pháp hóa học: dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate

Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý:

Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó

Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài

Enzyme là protein Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất hóa lý rất giống protein enzyme Do đó, việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định

1.5.2 Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên Dịch chiết thu được người ta gọi là chế phẩm enzyme thô sở di gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này ngoài enzyme còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế bào

Như vậy việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme Công việc này hoàn toàn không dễ dàng Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài

sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme

Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện một số phương pháp sau:

1 Phương pháp gây biến tính chọn lọc: phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm

biến tính chọn lọc các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu aicd và bền nhiệt Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50 – 70oC và pH < 5 ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính Sau đó bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải enzyme mà ta mong muốn

2 Phương pháp kết tủa phân đoạn: dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối

khác nhau, người ta thường sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, người ta còn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme Phương pháp kết tủa này thường làm biến tính rất nhanh Vì thế trước khi tiến hành kết tủa, người ta tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme

3 Phương pháp hấp thụ chọn lọc: người ta có thể hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho

dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi

là hydrocyapatite Người ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC Sau khi hấp thụ người ta lại tiến hành quá trình chiết enzyme (quá trình phản hấp thụ) bằng dung môi thích hợp

4 Phương pháp sắc ký: dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi giữa protein tan trong nước và tác nhân trao

đổi ion, người ta áp dụng phương pháp người ta sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme Người ta thường sử dụng tác nhân trao đổi ion sau:

Nhựa trao đổi ion

Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose