CHƯƠNG 3 GIỐNG VI SINH vật CHO sản XUẤT CÔNG NGHIỆP

Nguyên lý của phương pháp này là: Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống vi sinh vật từ mẫu tự nhiên như đất hoặc nước, cỏ cây chẳng hạn…làm các huyền phù pha loãng 1/10 đế

CHƯƠNG 3 GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP

Muốn có sản phẩm tốt, ngoài quy trình công nghệ thì khâu giống là quan trọng nhất,

nó quyết định chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế của quy trình công nghệ sản xuất Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng rộng rãi nhiều loại vi sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) và nhóm Eukaryote (nấm men, nấm mốc, tảo)

3.1 Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng

Để chọn được giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng từ các nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật liệu hữu cơ vô cơ

đã bị phân huỷ ít nhiều

Từ những kỹ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L Pauster và R.Koch đề ra nhiều phương pháp đặc biệt chủng giống thuần khiết dùng cho công nghiệp đã được phát triển, nhất là trong việc tìm chất sản xuất chất kháng sinh mới

Theo kỹ thuật vi sinh vật cổ điển, việc phân lập các chủng thuần khiết mất nhiều công sức và chậm Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệu quả

Nguyên lý của phương pháp này là:

Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống vi sinh vật từ mẫu tự nhiên như đất hoặc nước, cỏ cây chẳng hạn…làm các huyền phù pha loãng 1/10 đến 1/100 từ đất, rồi gieo trên mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh dưỡng và đã cấy một chủng vi sinh vật kiểm định có tác dụng đối kháng

Chỉ có những chất nào trong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa là

có tính chất kháng sinh thì sau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch Ta tách khuẩn lạc của chủng ấy và đem nuôi cấy, thử chất sinh ra và xác định tiếp theo

Cũng có thể đơn giản là đặt các mẫu đất lên các điểm khác nhau trên mặt thạch dinh duỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) hoặc của thạch khoai tây (nếu muốn tìm nấm) đã có chủng kiểm định được nuôi cấy từ trước Giữ đĩa thạch ở 28-37oC trong khoảng 2 ngày, quan sát vùng bị ức chế và quyết định công việc phân lập các chủng vi sinh vật có tác dụng tiếp theo Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chống xác định được tính kháng khuẩn kháng nấm hoặc virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập Phương pháp này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:

- Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định

- Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định

Cấy những chủng đã được phân lập bằng những đường vạch trên mặt thạch dinh dưỡng trong hộp petri Sau đó cấy chủng kiểm định theo đường song song hoặc vuông góc

với đường vạch của chủng nghiên cứu Đặt hộp petri vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợp với chủng kiểm định Tác dụng kháng sinh của mẫu thử sẽ được xác định ở vùng mặt thạch không bị mờ tại các giao điểm đường cấy của chủng bị ức chế

Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh Từ nguyên lý cơ bản phương pháp đã được cải tiến và ngày một phong phú hơn

Để chọn các chủng sản xuất các acid amin người ta đã sử dụng kiểu chọn lọc theo kỹ thuật penicilin Trong phương pháp này các điều kiện được lựa chọn sao cho các tế bào hoang dại

có thể phát triển trong môi trường dinh dưỡng thiếu một acid amin nào đó và bị giết chết bằng pennixilin Chúng ta đã biết, penicilin chỉ có tác dụng lên các tế bào đang sinh trưởng Các tế bào cần acid amin không sinh trưởng được nên sống sót Đối với những vi khuẩn mẫn cảm với penicilin thì dùng chất kháng sinh khác

Để phân lập những chủng có tính chất đặc biệt (như chuyển hoá steroit), người ta dùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy trong cùng một môi trường có chất

mà ta muốn thực hiện sự biến đổi Sau khi nuôi ta chiết xuất và các sản phẩm, phân tích theo các phương pháp sắc ký

3.2 Tạo giống vi sinh vật công nghiệp

Các chủng thu được qua phân lập ở trên được gọi là chủng nguyên thủy, chủng hoang dại hay chủng tự nhiên Các chủng này chưa hẳn đã đáp ứng đầy đủ các yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp Thông thường các chủng này được nghiên cứu tuyển chọn tiếp dựa vào các điều kiện sinh lý, sinh hoá và các điều kiện tích hợp để sao cho có hoạt tính cao và thực hiện được quá trình lên men có tính kinh tế

Những chủng vi sinh vật nguyên thủy đạc biệt là các chủng có hoạt tính siêu tổng hợp - tổng hợp thừa các sản phẩm trao đổi chất bậc 1 và bậc 2 có đặc điểm là không bền vững, thường hay bị biến đổi các tính chất ban đầu

Đồng thời khi nhân tế bào nhân đôi thì liên kết nối giữa purin và pyrimidin của ADN

bị cắt ra, làm khuôn để liên kết với hai nửa phân tử khác gồm những purin, pyrimidin, deoxyriboza và photphat Nếu có sự sai lệch xảy ra trong nửa mới đó của phân tử ADN thì

có thể tạo ra một nhân có thông tin sai lệch Vì vậy trong công nghệ lên men, đặc biệt là lên men các sản phẩmsiêu tổng hợp, không được dùng dịch ở một nồi đã lên men xong để làm giống cho một nồi khác Vì thế, mỗi mẻ lên men công nghiệp người ta phải tiến hành nhân giống từ các ống nghiệm với giống có hoạt lực cao, được cấy ra từ ống giống đong khô hoặc mới tiến hành chọn lại từ những mẻ lên men tốt từ trước đó

Những đột biến tự nhiên tạo ra những cá thể có đặc tính thực tế đáng chú ý hơn Vì thế việc gây đột biến để chọn lọc định hướng các chủng vi sinh vật công nghiệp thành vấn

đề rất đáng quan tâm

3.2.1 Các phương pháp đột biến

Thường các chủng hoang dại trong tự nhiên không có sự tổng hợp thừa Các chủng nguyên thủy thuần khiết sau khi phân lập cũng không bền vững Từ nhu cầu của thực tế sản xuất công nghiệp dẫn đến việc lựa chọn giống có khả năng “siêu tổng hợp” so với chủng nguyên thủy nên phương pháp đột biến đã đáp ứng được yêu cầu

Các tác nhân gây đột biến chia thành hai nhóm :

- Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y hoặc bắn phá bằng hạt nơtron hay electron

- Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozometylguanidin, Metyldicloroetylamin, Nitrit, Hydroxylamin hay Etylametansunfonat

Trong các tác nhân vật lý dùng vào mục đích này là tia cực tím hay là tia tử ngoại Người ta dùng đèn thạch anh phát ra tia cực tím chiếu lên dịch huyền phù giống vi sinh vật được chuẩn bị trong môi trường đẳng trương, đựng trong hộp petri mở nắp và có khuấy hoặc lắc Khoảng cách từ đèn UV đến dịch huyền phù vi sinh vật, thời gian chiếu và cường

độ bức xạ được điều chỉnh sao cho số tế bào bị tiêu diệt và số sống sót tối đa vào khoảng 0,2-0,5%

Dùng các tác nhân hoá học có thể tới mức các thể đột biến cần tìm xuất hiện trong khoảng 105-108 tế bào Nồng độ hoá chất và thời gian chiếu xạ là do thực nghiệm xác định, làm sao cho chỉ còn một số rất nhỏ tế bào vi sinh vật sống sót Những chủng sau khi chịu tác dụng của các tác nhân đột biến được rửa bằng nước đẳng trương vô khuẩn và sau nhiều lần pha loãng liên tiếp được cấy chuyền nhiều lần trên hộp petri để khảo sát đặc tính mới của chúng Việc cấy chuyền được thực hiện bằng kỹ thuật đóng dấu:dùng con dấu nhung chuyển khuẩn lạc từ hộp petri này sang hộp petri khác

Để phân lập được các thể đột biến sai hỏng về cơ chế điều hoà có khả năng sinh tổng hợp thừa các sản phẩm trao đổi chất, người ta dùng hai phương pháp: dùng chất tương đồng chống chất trao đổi, và phân lập các thể hồi biến của các chủng trợ dưỡng

Phương pháp dùng chất tương đồng chống chất trao đổi:

Hai loại chất này có cấu trúc tương tự nhau, ví dụ metioninvà etionin chỉ khác nhau ở

vị trí S của cấu trúc phân tử:

NH2

NH2

CH2

Do giống nhau, các chất chống trao đổi được tham gia vào quá trình trao đổi chất, nhưng không làm được đầy đủ các chức năng trao đổi thực, nên chất giả này thường gây tác dụng ức chế và làm chết tế bào

Có nhiều nguyên nhân gây ra sự ức chế :

Một chất tương đồng với acid amin được tham gia vào cấu trúc enzyme làm cho enzyme này bất hoạt

Chất tương đồng cạnh tranh với chất trao đổi về trung tâm hoạt động của enzyme và

do vậy ngăn cản sự chuyển hoá của chất trao đổi

Các chất tương đồng xuất hiện ở sản phẩm cuối cùng của một chuỗi tổng hợp, do kết hợp với enzyme dị lập thể làm giảm hoạt tính của nó hay do phản ứng của chất kiềm chế làm giảm sự tổng hợp của các enzyme Do vậy, sự tổng hợp chất trao đổi thật bị ngăn cản và sinh sản của tế bào bị ức chế

Cấy trên thạch dinh dưỡng có bổ sung chất chống chất trao đổi một huyền dịch tế bào đặc biệt ( khoảng 108 tế bào/ đĩa ) đã được xử lý bằng một tác nhân gây đột biến Trên mặt thạch sau khi nuôi vẫn xuất hiện một số khuẩn lạc thể hiện bằng các khuẩn lạc vệ tinh bao quanh các khuẩn lạc trên đĩa trước đó được cấy dầy đặc Đây là các tế bào kháng các chất chống chất trao đổi

Phương pháp dùng chất tương đồng giúp ta phân biệt được các thể đột biến bị hư hại trong sự ức chế bằng sản phẩm cuối cùng củng như các thể đột biến bị rối loạn về cơ chế kiềm chế

Phương pháp trợ dưỡng:

Mục đích của phương pháp này là nhằm phân lập được các thể hồi biến từ các thể đột biến trợ dưỡng sản phẩm cuối cùng Ta có thể nhận được thể hồi biến với trung tâm xúc tác trở lại hoạt động bình thường, song trung tâm điều hoà, nơi mà sản phẩm cuối cùng tác động, thì không

Tiến hành cấy khoảng 1010 tế bào dột biến trợ dưỡng lên môi trường dinh dưỡng tối thiểu Hầu hết các tế không sinh trưởng được, nhưng một số ít phục hồi lại khả năng tổng hợp sản phẩm cuối cùng thì mọc được Như vậy, enzyme bị hư trong cá thể này đã phục hồi được hoạt tính xúc tác nhờ đột biến thứ hai Có vài trường hợp thể đột thứ hai phục hồi hoạt tính enzyme, nhưng không phục hồi tính mẫn cảm với chất hiệu ứng dị lập thể Như vậy, có thể đột biến có hoạt tính enzyme đầy đủ, nhưng không có khả năng dị lập thể Nhận biết các thể này nhờ vòng khuẩn lạc vệ tinh

Qua nhiều bước làm đột biến ta có thể nhận được các thể đột biến có chứa các enzyme nhưng đã mất tính mẫn cảm dị lập thể và từ đấy có thể chọn ra phương pháp cần thiết cho việc tạo giống công nghiệp

Nhờ các phương pháp chọn lọc định hướng các thể đột biến ngày càng được cải tiến

và thích hợp, người ta đã chọn được nhiều chủng có năng xuất lên men cao dùng trong sản xuất enzyme, acid amin, vitamin, các chất kháng sinh…một số giống đột biến để tăng hiệu quả trong công nghiệp

Trong những năm gần đây, nhiều công trình tạo giống vi sinh vật công nghiệp bằng đột biến từ tế bào trần đã cho kết quả khả quan Ngoài các phương pháp lai ghép tế bào trần

và biến nạp gen ở tế bào vi sinh vật- các phương pháp kỹ thuật di truyền hiện đại mở ra một trang mới cho công nghệ sinh học, trong đó có việc tạo giống công nghiệp

Các phương pháp lai ghép tế bào trần và biến nạp gen ở các tế bào vi sinh vật đã giúp cho việc tạo giống vi sinh vật công nghiệp Nhiều chủng mới có hoạt tính cao, có khả năng sinh tổng hợp các chất liệu quí mà trước đây chỉ có thể sinh ra ở cơ thể động vật hoặc thực vật thì nay các gen điều khiển tổng hợp chất đó đã được ghép vào tế bào vi khuẩn Công việc sau đó là tổ chức một quá trình lên men và đưa vào sản xuất công nghiệp như các sản phẩm truyền thống khác

Các sản phẩm như interferon, insulin, các kháng thể đơn dòng…đã được sản xuất theo công nghệ lên men Cũng cần lưu ý rằng việc dùng các chủng vi sinh vật đã được thay đổi bộ gen di truyền là một việc làm hết sức quan trọng, vì ra tự nhiên khó kiểm soát được các chủng này và hậu quả thì khó lường được Vì vậy, ở các nước phát triển có qui định ngặt nghèo với việc cho phép sử dụng các chủng tái tổng hợp dùng cho công nghiệp

3.3 Các tiêu chí để chọn giống vi sinh vật cho sản xuất công nghiệp

Một chủng giống vi sinh vật được dùng cho công nghiệp cần phải đáp ừng những nhu cầu sau:

- Chủng vi sinh vật phải thuần, không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác

- Phải đảm bảo khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao, chất lượng tốt, không tạo ra sản phẩm phụ không mong muốn

- Khả năng sử dụng nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền Trên những cơ chất này vi sinh vật phải mọc nhanh và sản sinh lượng lớn sinh khối ổn định Khả năng tách dễ dàng các tế bào hay các sản phẩm tạo ra trong qua trình lên men

- Phải thể hiện tính không mẫn cảm với vi sinh vật tạp nhiễm và thực khuẩn thể

- Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn được đặc tính hoá sinh ban đầu

- Chủng vi sinh vật có khả năng thay đổi đặc tính bằng các kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không ngừng nâng cao năng suất

Việc chọn giống không phải bao giờ cũng đáp ứng đầy đủ các nhu cầu trên, thường khi kích thước tế bào lớn thì dễ tách ra khỏi dịch nuôi cấy, nhưng hoạt tính lại không cao, vì rằng cường độ trao đổi chất của vi sinh vật tỉ lệ nghịch với kích thước tế bào

Tuy nhiên trong quá trình sản xuất các tiêu chuẩn trên không phải gắn liền với nhau

và cùng tồn tại ở một số đối tượng vi sinh vật nào đó Các vi sinh vật thuộc nhóm Eukaryote

có kích thước tế bào lớn thể hình sợi, do đó dễ tách chúng ra khỏi môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp lọc ly tâm thường Nhưng ở chúng thường tồn tại một quy tắc chung là kích thước tế bào tỷ lệ nghịch với hoạt tính trao đổi chất

3.4 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật

Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên cứu

và trong công nghiệp vi sinh vật Nó không chỉ đơn thuần giữ những chủng giống trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy chuyền, mà phải làm htế nào để giống sống sót và giữ được những đặc tính ban đầu Vì vậy công tác này tương đối phức tạp

và khó khăn

Quá trình nuôi cấy đưa ra giống vi sinh vật có hoạt lực cao vào sản xuất cần qua các bước như sau: phân lập, và tuyển chọn giống, nghiên cứu các đặc tính về hình thái, sinh lý, hoá sinh, tuyển chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu Bước đầu tiên cần phải chú ý là việc giữ giống sau khi đã phân lập từ đất, nước hay một cơ chất nào đó Yêu cầu về mặt chọn giống: giống có hoạt lực cao và ổn định với hoạt lực này trong qui trình thích hợp Giống được chọn lần đầu cũng được giữ cho những lần tiếp theo Có thể cho rằng : công việc giữ giống liên quan đến công tác nghiên cứu và trong mọi thời gian của các xí nghiệp dùng vi sinh vật

Nếu không giữ được những đặc tính ban đầu của vi sinh vật thì mọi thành quả thu được coi như vô ích Vì lý do trên mà các nước trên thế giới đã chuẩn bị cho khâu bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập các trung tâm, các bảo tàng giống vi sinh vật, các viện nghiên cứu

Nhiệm vụ của các bảo tàng vi sinh vật là: giữ được quần thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao và các tế bào này giữ được đặc tính ban đầu để phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất Nhưng cũng có những vi sinh vật không có khả năng sống và duy trì những đặc tính ban đầu Thông thường một chủng giữ lâu trên môi trường dinh dưỡng và cấy chuyền nhiều lần có thể có những biến đổi Như vậy cần phải chọn lựa giống và phương pháp bảo quản thích hợp để cho các thế hệ con cháu của nó không sinh ra các đột biến Người ta chọn những khuẩn lạc riêng lẻ có những đặc điểm đặc trưng Chọn như vậy sẽ được những tế bào cùng loại, về nguyên tắc khó gặp những thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến ở chủng ban đầu

Sau khi đã chọn được những chủng cần phải tiến hành bảo quản ngay Ngày nay có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Phần nhiều những phương pháp này giữ chủng giống ở trạng thái tiềm sinh và định kỳ cấy chuyền ở môi trường thích hợp Trong trạng thái tiềm sinh hầu như không xảy ra quá trình sống hoặc với mức độ thấp Bảo quản ở trạng thái này cho phép giữ được những tính chất quí hiếm ban đầu Sự lựa chọn những phương pháp bảo quản tuỳ thuộc vào khả năng của từng phòng thí nghiệm

3.4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và

chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như:

Staphylococi, Coliform có thể sống được vài năm theo cách này Cho dù phương pháp này

là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng

vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc

- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản

- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản

- Tốn nhiều công sức để cấy truyền

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền

Cấy truyền trên môi trường dịch thể:

• Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản

• Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở 25oC trong 72 giờ Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản

• Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC

Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2- 6 tháng

Cấy truyền trên môi trường thạch:

Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%) Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản

từ 3-6 tháng

Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm

Hình 3 Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

Giống vi sinh vật được giữ trên môi trường thạch nghiêng (đối với các giống vi sinh vật hiếu khí) hoặc trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí) Các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3- 50C Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ từng nhóm

vi sinh vật khác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa là 3 tháng Để công tác giữ giống được tốt, lâu hơn và đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên môi truờng

đã được cấy giống vi sinh vật một lớp dầu khoáng như paraffin lỏng Lớp paraffin này sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với oxy không khí (O2) và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do vậy giống có thể bảo quản được lâu hơn và không bị nhiễm tạp, thoái hóa

Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể là hạn chế

sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm Lớp parafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxygen không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch nên nồng độ các chất hoà tan không bị thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật Những chủng đã được xử lý ở trên, sau đó được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C và có thể bảo quản nhiều năm

Cần phải giữ sao cho duy trì sự sống được tốt mà không tạo nên ưu thế sinh sản Đối với mỗi chủng phải thử và chọn phương pháp bảo quản thích hợp Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt Giống bảo quản dưới lớp dầu khoáng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều giống vi sinh vật như: nấm men, nấm mốc,vi khuẩn, xạ khuẩn…

3.3.2 Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt

Do cấu trúc hoá lý, cát và đất là những cơ chất tốt mang các tế bào vi sinh vật- chủ yếu là các bào tử

Bảo quản giống vi sinh vật trong cát: Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần

(đến khi nước không đục), sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá các chất hữu cơ (đun nóng 1000C và rửa lại bằng nước) Sấy khô ở 1200C trong 3 - 4 giờ Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh đã sấy thanh trùng ở 160-1800C khoảng 2 giờ Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường hoá và thịt- pepton vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng Sau đó cho vào tủ

ấm 28-300C khoảng một tuần Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này đục thì coi như cát chưa vô trùng

Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm Úp mặt thạch, dùng que cấy cào bào tử vào cát Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng lắc đều Chỉ bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục, các ống cát giống đậy bằng nút bông Dùng parafin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ phòng hay ở 4-60C

Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào các ống thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyền tiếp theo Phương pháp bảo quản này chủ yếu áp dụng cho những nhóm vi sinh vật sinh bào tử như nấm mốc và xạ khuẩn

Bảo quản giống trong đất khô: nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau Chia đất

nghiền vào các ống nghiệm thêm 1-2 giọt nước,có thể thêm 1-2% CaCO3 để trung hoà các loại đất chua hoặc cho một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho đất sau khi thanh trùng luôn khô Đậy bông và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp thanh trùng hai lần ở 1200C một giờ cách nhau một ngày Kiểm tra độ vô trùng của môi trường giữ giống như đối với cát

và giữ giống trong đất như là ở cát Ngoài ra ta có thể giữ giống trong hỗn hợp cát và đất

Phương pháp này bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum

Giữ giống trên hạt: Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác

nhau Ơû Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn hạt

kê vàng đã làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các hạt thấm ẩm hoàn toàn rồi lọc Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm nguội và các hạt phải rời nhau, rồi cho vào từng lọ (khoảng 15-16 g mỗi lọ thể tích 250ml) Các bình đậy nút kín và thanh trùng ở 1150C khoảng 30-40 phút Thử vô trùng giống các phương pháp trên Cấy vào mỗi bình 2 ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng Lắc nhẹ cho giống đều trên các hạt kê và nuôi ở nhiệt độ 24-280C trong 8 ngày Sau đó sấy trong các thiết bị chân không đến khi độ ẩm kê có giống phát triển không quá 8% Kiểm tra giống và tráng parafin lên nút bông Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và khô

3.3.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp:

3.3.2.1 Phương pháp đông khô:

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây

là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật

Hình 4 Đông khô vi sinh vật

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài

Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở –250C đến –700C Để đảm bảo tế bào

vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu ta cần trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá) như glycerin 15%, huyết thanh ngựa, dung dịch glucose hay lactose 10% Việc làm tiến hành từ từ lạnh được, khi độ lạnh đạt –200C việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 1-20C/ phút Với phương pháp này cũng cấy chuyền và làm lại, nhưng thời gian giữa các lần cấy chuyền kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch

Nếu giữ ở t0=-150C đến -200C : 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lần

Nếu giữ ở t0=-300C : 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lần

Nếu giữ ở t0=400C : 1 năm cấy chuyền và làm lại một lần