Công nghệ sản xuất Thu nhận enzime ficin từ trái sung

Tính chất vật lý của ficin các nguồn thu nhận khác ở nhau được trình bày ở bảng sau:...  Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin Các yếu tố hoạt hoá: o Nhân tố khử như: cyanide

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang

SINH VIÊN: Thái Quốc Hiền Em Huỳnh Văn Hiệu

Lại Thị Thuỳ Dương Phạm Thị Ngọc Lan

Trần Thị Liệu

ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZIME FICIN

Ficin (ficain) là một protease được tìm thấy

trong nh a củacây thuộc họ ficus (sung, vả), ự thuộc họ Moraceae, bộ Urticales.

Cây sung có xuất sứ từ vùng Tây Á và phân bố

ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới.

Ở Việt Nam, có nhiều loài sung khác nhau: sung (Ficus racemosa L.); sung trổ (Ficus variegata); sung ba thuỳ ( Ficus hirta); sung thằn lằn (ficus pumila L.); vả (Ficus auriculata lour)

1.Lịch sử nghiên cứu :

• N m 1930 B.H.Robins nh n th y trong nh a ă ậ ấ ự

c a cây thu c h sung m t lo i enzym cĩ kh ủ ộ ọ ộ ạ ả

n ng tiêu di t ă ệ đượ c giun trịn Ascaris.

• Đặc điểm nguồn thu nhận ficin:

Cây sung ngọt

 có kích thước vùa hoặc nhỏ, cây cao từ 3-9m

 Cây có nhiều nhựa màu trắng đục

 Lá đơn, màu xanh sáng

Theo tài liệu của Phân Khoa Nông Nghiệp Mỹ

ở Washington D.c,thành phần các chất trong 100g trái như sau:

Thành phần Quả tươi Quả khô Năng lượng 80 calo 270 calo Độ ẩm 77,5-86,8 g 23g Protein 1,2-1,3 g 4,3g Lipid 0,14-0,3 g 1,3g Carbohydrate 17,1-20,3 g 69,1g

Chất xơ 1,2-2,2 g 5,6g Tro 0,48-0,85 g 2,3g Calcium 35-78,2 mg 126mg Phosphorus 22-32,9 mg 77mg

Sắt 0,6-4,09 mg 3mg

• TÍNH CHẤT CỦA ENZIME FICIN:

• Cấu tạo hoá học:

• Ficin là m t protease th c v t trong c u trúc ộ ự ậ ấ

Stt Amino acid Tên tác giả nghiên cứu

Marini bettoolo

 Tính chất vật lý:

 Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000

 Nhiệt độ hoạt động: 30-80oC nhiệt độ tối hảo cho hoạt

tính xúc tác: 50-65oC.

 Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S.

 Điểm đẳng điện: 9-10.

 Không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan

một phần trong nứơc và glycerin.

Tính chất vật lý của ficin các nguồn thu nhận khác ở

nhau được trình bày ở bảng sau:

Nguồn

thu

nhận

Phương pháp tinh sạch

Hệ số sa lắng (S o )

Trọng lượng phân tử

Điể

m đẳng điện

Hệ số tinh sạch

A 280 A 260

Hệ số tắt

Bước sóng hấp thu

pH 7

25.50 0±

750 23.80

2.56 26.00

0

Bernh ard và Gutfre und Liener

cellulose, pH 7

>9.

6

1.88 20.2 Kram

er và Whita ker

o

Tính chất hoá học

• pH hoạt động tối thích của ficin rộng: 4-9.5

(dịch nhựa sung có pH 5),

• gelatin: pHopt = 5;

• casein: pHopt = 9.5;

• hemoglobin: pHopt = 7.

• Benzoyl-L-arginine ethyl ester,

benzoyl-L-argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt = 6.5.

 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin

Các yếu tố hoạt hoá:

o Nhân tố khử như: cyanide, cysteine, 1,2-

dimercaptopropandol hoặc mercaptoethanol.

o Cysteine hoặc 1,2- dimercaptopropandol nồng độ

0.005-0.05M HCN 0.075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất

o Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa

khi phối hợp giữa HCN với cystein.

• Các yếu tố kìm hãm:

o Các chất ức chế như HgCl2, N- ethylmalenide,

iodo acetic acid, chloroacetamide hay

iodoacetamide kết hôp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzime sẽ bị bất hoạt

o Các chất kìm hãm hoạt động của các protease

động vật khi liên kết với gốc cystein của

enzime ficin cũng có thể làm bất hoạt ficin

o Trong lòng trắng trứng có một loại protein có

một loại protein có khả năng kìm hãm hoạt

động của ficin

Tính bền vững:

• Bền vững với nhiệt độ: Cohen nhận thấy chúng

có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2h ở 50oC

• Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng

(4.5-9.5) độ bền vững của enzime ficin đạt đến

mức cực đại

-pH hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có

tính bền vững ở mức tối thiểu.

-Cơ chế xúc tác của enzyme:

Cơ chế thuỷ giải này gồm có hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hoá”.

Giai đoạn 2: giai đoạn “deacyl hoá” có sự tham gia của phân tử nước

Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thuỷ

phân protein của ficin:

• Nhiệt độ:

Hoạt động thuỷ giải protein của enzime

ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ

• Độ pH:

– Tác động vào trạng thái ion hoá của phân tử

enzime.

– Tác động vào trạng thái ion hoá của cơ chất.

– Tác động vào độ bền của phân tử enzime.

– Tác động vào sự kết hợp giữa phần protein và phi

protein của phân tử enzime…

Dịch nhựa sung

Pha nước cất

Khuấy tr n ộ

Ly tâm

Thu dịch bên trên

Thu lấy các phân đoạn

Loại bỏ tủa

Tủa bằng ethanol

Ch ph m enzyme thơ ế ẩ

Từ nhựa thân Từ lá và quả xanh

Dịch nhựa sung

Pha nước cất

Khuấy tr n ộ

Ly tâm

Thu dịch bên trên

Thu lấy các phân đoạn

Loại bỏ tủa

Tủa bằng ethanol

Ch ph m enzyme thơ ế ẩ

lọc gel

Thu phân đoạn enzyme

Chế phẩm enzyme

Sấy khô

Enzyme thơ

Xấc nh ho t tính đị ạ cac phan o n đ ạ

Độn với tinh bột

(tỉ lệ 1:1)

PHƯƠNG PHÁP LỌC GEL (GEL FILTRATION)

phương pháp

 Phương pháp lọc gel hay sắc kí rây phân tử là một loại sắc ký được sử dụng để tách, phân tích, xác định kích thước, trọng lượng phân tử của

các chất cao phân tử, nó cũng được sử dụng để điều chế và tinh sạch protein.

khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel

CTCT sephalex

 Các loại sephalex:sephalex-G75,G100,G200

Máy sắc ký rây phân tử

Phương pháp này có thể xác định được trọng lượng phân tử của các protein cũng như có thể xác định được độ tinh sạch của chế phẩm

enzyme khi k t h p v i ph ế ợ ớ ươ ng phap s c kí ắ

Nguyên tắc :

Trong hệ thống này, khi cho hỗn hợp protein vào thì các protein sẽ kết hợp với các chất bề mặt mang điện tích âm là SDS ( Sodium

Dodecyl Sulfate) để trở thành các phức hợp

mang điện tích âm