PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN

1 10.11. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN Phương pháp phân tích acid amin là phương pháp xác định th ành ph ần và hàm lượng các acid amin trong các protein và peptid, c ũ ng như trong các ch ế phẩm thuốc. Ph ương pháp phân tích acid amin được áp d ụng để định tính và định lượng các protein v à peptid d ựa trên các cấu tử acid amin tạo ra chúng , để giúp việc xác định cấu trúc của các protein và peptid cũng như việc xác định cách phân đoạn của chúng nh ằm thiết lập giản đồ peptid và để phát hiện các acid amin không đi ển hình có th ể có mặt trong một protein ho ặc pepti d. Trước khi phân tích acid amin trong protein hoặc peptid, c ần thiết phải thủy phân protein hoặc pepti d thành các acid amin. Sau đó ti ến hành phân tách các acid amin thu được giống như khi ta phân tách các acid amin t ự do có trong các chế phẩm thuốc. Đi ều quan trọng là chúng phải được biến đổi th ành các d ẫn chất thích hợp cho việc phân tách và phát hiện. Thi ết bị Các phương pháp để phân tích acid amin thường dựa tr ên việc tách các acid amin có trong mẫu thử b ằng phương pháp s ắc ký. Các thiết bị sắc ký tự động thường chiếm lợi thế. Thiết bị phân tích acid amin đi ển hình là m ột máy sắc ký lỏng áp suất thấp hoặc áp suất cao, có khả n ăng th ực hiện ch ương trình dung môi để tách các acid amin khi qua cột sắc ký. Máy c ần có th êm thiết bị đi ều chế dẫn chất acid amin sau c ột. Để phát hiện kết quả, thường d ùng detector hấp thụ tử ngoại - kh ả kiến hoặc detector huỳnh quang, tùy thu ộc vào cách đi ều chế dẫn chất đã áp d ụng. Một thiết bị tích phân cho phép chuyển đổi tín hiệu tương t ự đi t ừ detector ra và cho phép định lượng. Các máy chuyên dùng để phân tích acid amin thường được ưa dùng. Chú ý Nhi ễu đường nền luôn l à mối quan tâm của ng ười tiến h ành phân tích acid amin. Để khắc phục, phải dùng các thu ốc thử có độ tinh khiết cao (thí d ụ acid hydrocloric có độ tinh khiết thấp có thể gây nhiễm glycin). Thông thường cách một v ài tu ần lại phải thay mới các thuốc thử. Chỉ dùng các dung môi dùng cho s ắc ký lỏng cao áp. Lọc lại các dung môi tr ước khi d ùng để giảm thiểu sự nhiễm khu ẩ n và các t ạp ch ất. Đậy kín các b ình đựng dung môi. Không để các thiết bị phân tích acid amin tiếp xúc trực tiếp với tia sáng m ặt trời. Ch ất l ượng thực h ành phòng thí nghi ệm có thể quyết định chất lượng phân tích acid amin. Giữ ph òng thí nghi ệm sạch sẽ. Đặt thi ết bị phân tích trong ph òng thí nghiệm t ại ch ỗ riêng bi ệt, ít bị ảnh h ưởng của các ho ạt động khác. Định kỳ rửa sạch v à chuẩn hóa lại các pipet. Bảo quản đầu pipet trong hộp đậy kín. Không được cầm đầu piped b ằng tay trần, phải mang g ăng tay b ằng cao su không xoa b ột talc hoặc có ch ất l ượng tương đương. H ạn chế số lần mở và đóng bình đựng mẫu thử v ì bụi có thể làm gia t ăng k ết qu ả về h àm l ượng các chất glycin, serin v à alanin. C ần bảo d ưỡng tốt thiết bị phân tích acid amin để có kết quả chấp nhận được. Nếu thiết bị được d ùng thường ng ày thì hàng ngày phải kiểm tra độ r ò rỉ dung môi của thiết bị, độ ổn định của đèn và detector, độ phân giải của cột. Định kỳ l àm s ạch hoặc thay thế các kính lọc của thiết bị và các linh ph ụ kiện cần bảo d ưỡng khác. Các ch ất đối chiếu Trên thị trường có sẵn các acid amin chuẩn để dùng trong phân tích acid amin; chúng thường là hỗn hợp các acid amin chu ẩn trong n ước. Khi cần xác định th ành phần acid amin trong một mẫu thử, các protein ho ặc pepti d chu ẩn phải được phân tích song song v ới mẫu thử để kiểm tra sự to àn v ẹn của thử nghiệm. Trong trường hợp n ày, chu ẩn protein được sử dụng l à albumin huy ết thanh bò tinh khiết cao. Chu ẩn hóa thiết bị Vi ệc chuẩn hóa thiết bị phân tích acid amin được thực hiện bằng cách phân tích một chuẩn acid amin, g ồm hỗn hợp các acid amin chuẩn đã bi ết tr ước h àm l ượng của từng chất, để xác định hệ số đáp ứng v à kho ảng tuyến tính ứng với mỗi một acid amin chuẩn đã th ử . 2 Pha loãng m ẫu chuẩn acid amin thành nhiều dung d ịch có nồng độ khác nhau, nằm trong kho ảng tuyến tính d ự đoán trước của các acid amin có trong mẫu chuẩn. Tiến h ành phân tích nhiều lần với mỗi nồng độ. Biểu thị kết quả thu được tr ên bi ểu đồ thể hiện tương quan gi ữa diện tích pic thu được ứng với mỗi n ồng độ của acid amin đã th ử. Nhờ biểu đồ này, có th ể xác định được khoảng tuyến tính của mỗi acid amin, t ại đó, các di ện tích pic thu được có tương quan x ấp xỉ tuyến tính với các nồng độ của các acid amin đã thử. Khi phân tích acid amin, để có kết quả đúng và lặp lại, điều quan trọng là phải pha và thử nghi ệm trên các mẫu thử có nồ ng độ nằm trong khoảng tuyến tính tương ứng với kỹ thuật phân tích đang áp d ụng. Để xác định hệ số đáp ứng cho mỗi a cid amin, ta phân tích 4 - 6 n ồng độ của acid amin chuẩn tương ứng. Hệ số đáp ứng tính được l à giá trị t rung bình c ủa diện tích pic (hoặc của chiều cao pic) ứng với n ồng độ 1 nanomol c ủa dung dịch acid amin chu ẩn. Thiết lập một dãy chuẩn hóa bao gồm hệ số đáp ứng tương ứng của các acid amin và sử dụng dãy này để tính nồng độ (nanomol) của mỗi acid amin có trong m ẫu thử bằng cách chia diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được của acid amin đó cho h ệ số đáp ứng tương ứng có trong dãy chuẩn hóa. Trong vi ệc phân tích th ường ng ày, khi dùng dãy chuẩn hóa, ta chỉ cần xác định một diện tích pic là đủ. Tuy nhiên, dãy chu ẩn hóa này phải th ường xuy ên được thử lại bằng các phân tích kiểm tra v à được cập nh ật để bảo đảm tính to àn v ẹn của nó. Độ lặp lại Mu ốn có các kết quả phân tích acid amin có chất l ượng ổn định tại một ph òng thí nghiệm phân tích, cần quan tâm đến độ lặp lại của phép định lượng. C ần có một hệ thống thiết bị phân tích các acid amin có kh ả n ăng cung c ấp các giá tr ị lặp lại của thời gian l ưu c ủa pic ( để định tính) v à các giá tr ị lặp lại của diện tích pic (để định lượng). Cách xác định tiêu biểu độ lặp lại bao gồm việc pha chế một dung dịch chu ẩn các acid amin, rồi tiến hành đo m ẫu đó nhi ều lần (6 lần hoặc nhiều h ơn). Sau đó, tính độ lệch chu ẩn của các giá trị thời gian l ưu và độ lệch chuẩn các giá trị diện tích pic đã được tích phân, ứng với m ỗi acid amin đã được phân tích. Việc xác định độ lặp lại c òn được mở rộng bằng cách nhiều người phân tích khác nhau cùng ti ến h ành xác định độ lặp lại đó trong nhi ều ng ày. Ng ười ta c òn th ực hiện việc định lượng nhiều dung dịch có nồng độ khác nhau của chuẩn gốc để xác định sự biến thi ên do việc pha ch ế mẫu thử . Thường người ta phân tích th ành phần acid amin của một protein chuẩn (Ví dụ albumin huy ết thanh bò) để đánh giá độ lặp lại. Nhờ việc xác định độ lệch chuẩn, ta có thể thiết lập các giới hạn phân tích để đạt kết qu ả tốt, với độ lệch chuẩn thấp nhất. Để giảm bớt sai số trong phân tích, nhiều yếu t ố cần được quan tâm và xem xét đầy đủ như: cách chu ẩn bị mẫu thử, nhiễu đường nền do chất lượng c ủa các thuốc thử, việc thực hành thí nghiệm, tính n ăng và vi ệc bảo d ưỡng máy móc thi ết bị, các dữ liệu phân tích và cách bi ện giải và cuối cùng việc thực thi thành thạo của ng ười l àm phân tích. Chu ẩn bị mẫu thử Mu ốn có kết quả phân tích acid amin đúng, ph ải dù ng các m ẫu thử protein và peptid đã tinh ch ế. Các t ạp chất nh ư các mu ố i, ure, ch ất tẩy rửa có th ể gây nhiễu, nên cần phải loại khỏi mẫu thử tr ước khi ti ến hành phân tích. Ph ương pháp đi ều chế dẫn chất sau cột sắc ký không bị nhiễm bởi các tạp chất ở m ức độ lớn như khi đi ều chế dẫn chất tr ước cột sắc ký. N ên gi ảm số thao t ác trên m ẫu thử để giảm nhi ễu đường nền, tăng k ết quả t ìm thấy và giảm công lao động. Các cách thông thường để loại tạp chất trong m ẫu thử protein bao gồm: - Tách bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, thu protein bằng một dung môi bay hơi có chứa một lượng thích h ợp thành ph ần hữu c ơ r ồi làm khô bằng ly tâm chân không, - Th ẩm tách loại b ỏ t ạp chất, - Ly tâm siêu l ọc, - K ết tủa protein bằng một dung môi hữu c ơ (ví d ụ aceton), - L ọc qua gel. Ch ất chuẩn nội C ần dùng một chất chuẩn nội để kiểm soát những mất mát v à bi ến đổi lý hóa học xảy ra trong quá tr ình phân tích acid amin. Do đó, trước khi tiến h ành thủy phân phải thêm một l ượng chính xác chuẩn nội vào 3 dung d ịch protein cần phân tích. L ượng chuẩn nội t ìm thấy được sẽ l à một thông số chung cho l ượng tìm th ấy được c ủa các acid amin có trong protein. Tuy nhiên các acid amin tự do và các acid amin liên k ết trong c ấu trúc protein không giống nhau về tốc độ thủy phân hoặc phân hủy. V ì v ậy việc dùng chuẩn n ội để chỉnh lý sự mất mát trong quá tr ình th ủy phân có thể cho k ết quả không đáng tin c ậy. Cần chú ý đi ều này khi biện giải kết quả phân tích. Ta còn có thể thêm chuẩn nội vào hỗn hợp các acid amin sau khi đã được thủy phân để chỉnh lý những sai lệch về kết quả phân tích gây ra do các sai lệch khi tiêm m ẫu, do thay đổi độ ổn định của thuốc thử cũng như t ốc độ d òng của dung môi. Ch ất chuẩn nội lý t ưởng là m ột acid amin bậc nhất nhân tạo, có sẵn tr ên thị tr ường với giá rẻ. Chất n ày ph ả i b ền vững trong quá trình th ủy phân, có hệ số đáp ứng tuyến tính với nồng độ v à ph ải được rửa giải cho một pic có thời gian lưu độc nhất v à được phân giải tốt với các pic tương ứng với các acid amin khác. Các chuẩn nội th ường được d ùng bao gồm norleucin, nitrotyrosin và acid α -aminobutyric. Th ủy phân protein C ần thiết phải tiến hành thủy p hân các m ẫu thử protein và peptid trước khi phân tích các acid amin tạo thành. Để tránh sai kết quả, các đồ thủy tinh d ùng trong thủy phân phải hết sức sạch. Dấu vân tay trên ống thủy phân hoặc bột tách ra từ bao tay cũng có thể l àm nhiễm bẩn mẫu thử. Để rửa sạch các ống thủy tinh dùng trong th ủy phân (ống thủy phân), ta đun sôi chúng 1 gi ờ trong acid hydrocloric 1 M ho ặc ngâm chúng trong acid nitric đậm đặc hoặc trong hỗn hợp đồng thể tích acid hydrocloric v à nitric đậm đặc. Sau đó tráng s ạch bằng n ước cất tinh khi ết cao, tiếp đến bằng methanol d ùng trong sắc ký lỏng cao áp. Cu ối cùng sấy qua đêm trong t ủ sấy rồi bảo quản kín cho đến khi d ùng. Cũng có thể nung đồ thủy tinh dùng để thủy phân ở nhiệt độ 500 °C trong 4 gi ờ để tránh nhiễm bẩn. Cũng có thể sử dụng lo ại d ụng cụ thích hợp, chỉ d ùng một lần rồi bỏ. Thủy phân bằng acid là phương pháp thông dụng nhất để thủy phân một mẫu thử protein trước khi tiến hành phân tách các acid amin t ạo ra mẫu thử đó. Th ủy phân bằng acid có thể cho kết quả phân tích thay đổi vì m ột số acid amin bị phân hủy một phần hay hoàn toàn. Cụ thể là: Tryptophan b ị phân hủy, serin và threonin b ị phân hủy một phần , methionin có th ể bị oxy hóa còn cystein thì chuyển đổi th ành cystin (tuy nhiên lượng cystin t ìm th ấy được thường thấp hơn thực tế v ì m ột phần bị phân hủy hoặc bị khử trở l ại thành cystein). Có thể giảm thiểu sự phân hủy do bị oxy hóa bằng cách tiến hành thủy phân trong môi trường chân không thích hợp (áp suất thấp hơn 200 µm th ủy ngân hoặc 26,7 Pa) hoặc bằng cách n ạp một khí t rơ (argon) vào kho ảng trống phía trên của bình phản ứng. Các đường nối peptid gi ữa isoleucin - isoleucin, valin - valin, isoleucin - valin và valin - isoleucin ch ỉ có một phần được cắt đứt để gi ải phóng acid amin thôi. Aspar agin và glutamin đều bị khử amid để th ành acid aspartic và acid glutamic tương ứng. Vì tryptophan, asparagin và glutamin b ị mất mát trong khi thủy phân bằng acid nên ta ch ỉ còn định lượng được 17 acid amin. Một số kỹ thuật thủy phân mô tả sau đây s ẽ đề cập cách khắc ph ục các trở ngại nêu trên. Tuy nhiên m ột số kỹ thuật (từ số 4 đến số 11) lại có thể biến đổi một số acid amin khác. Vì v ậy cần cân nhắc lợi hại khi chọn kỹ thuật thủy phân protein/pepti d và ph ải thực nghiệm thích h ợp tr ước khi chọn một kỹ thuật thủy phân khác kỹ thuật thủy phân b ằng acid. Thư ờng hay dùng ph ương pháp phân tích acid amin theo chương trình th ời gian thủy phân (tức là phân tích acid amin ở các thời đi ểm thủy phân là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ) để xác định nồng độ ban đầu của các acid amin d ễ bị phân hu ỷ ho ặc chậm b ị phân tách khi thủy phân: Vẽ đồ thị biểu thị sự li ên quan gi ữa nồng độ thu được của acid amin dễ bị phân hủy (thí dụ serin, threonin) với thời gian thủy phân rồi ngo ại suy tới đi ểm gốc thời gian, ta sẽ được nồng độ ban đầu (nồng độ ở gốc thời gian ) của acid amin dễ bị phân hủy đó. Áp dụng phương pháp chương trình thời gian thủy phân này cho các acid amin chậm được phân tách (ví dụ isoleucin v à valin), trên đồ thị sẽ có một đo ạn bằng ( đo ạn thẳng nằm ngang) ứng v ới nồng độ của acid amin cần phân tích đó. N ế u th ời gian thủy phân quá d ài, nồng độ của các acid amin c ần phân tích sẽ bắt đầu giảm, chứng tỏ acid amin đó đã b ị phân hủy do đi ều kiện thủy phân. M ột cách khác của phân tích acid amin theo ch ương trình th ời gian thủy phân được chấp thuận l à cho m ột chuẩ n acid amin tr ải qua cùng các đi ều kiện nh ư khi th ủy phân mẫu thử protein/pepti d. Acid amin chu ẩn, ở thể tự do, có thể sẽ không có kết quả hoàn toàn tiêu biểu cho tốc độ phân hủy của các acid amin d ễ bị phân hủy có trong m ẫu thử protein/peptid . Đi ều n ày đặc biệt đúng đối v ới các li ên kết peptid ch ậm bị phân tách (nh ư liên k ết isoleucin - valin). Tuy nhiên cách phân tích này s ẽ cho phép giải thích m ột vài tr ường hợp phân hủy acid amin trong mẫu thử. 4 Cách th ủy phân bằng acid trong lò vi sóng cũng đã được sử d ụng, cho kết quả nhanh chóng nh ưng đòi h ỏi thiết bị đặc biệt v à cần thận trọng đặc biệt. Phải xác định được các đi ều kiện thủy phân trong lò vi sóng t ối ưu cho m ỗi mẫu thử protein/peptit ri êng biệt. Thủy phân trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ít phút, nhưng n ếu chỉ th êm hoặc bớt một phút so với yêu cầu thôi cũng sẽ có thể có kết quả sai lệch (ho ặc do các acid amin d ễ bị phân hủy sẽ bị phân hủy hoặc do mẫu thử ch ưa được thủy phân ho àn toàn). Cách thủy phân hoàn toàn bằng một hỗn hợp các men protease cũng được áp dụng nhưng phức tạp, đòi h ỏi phải được kiểm soát chặt chẽ v à th ường được áp dụng nhiều để phân tích các peptid hơn là các protein. Khi ti ến h ành phân tích lần đầu một mẫu thử protein mới, cần phải l àm th ực nghiệm để xác định các đi ều kiện tối ưu v ề th ời gian và nhiệ độ thủy phân. K ỹ thuật thủy phân 1 Th ủy phân bằng acid hydrocloric có chứa một l ượng phenol là k ỹ thuật thông dụng nhất để thủy phân m ẫu thử protein/pepti d trước khi tiến h ành phân tích acid amin. Thêm phenol vào môi tr ường thủy phân c ốt để ngăn ng ừa hiện t ượng halogen hóa tyrosin. Dung d ịch thủy phân: Acid hydrocloric 6 M ch ứa từ 0,1% đến 1% phenol. Th ủy phân pha lỏng: Cho vào ống thủy phân mẫu thử protein/pepti d r ồi l àm khô ( để loại nước, tránh pha loãng dung d ịch thủy phân). Cứ 500 µg m ẫu thử đông khô, ta thêm 200 µl dung d ịch thủy phân. Làm l ạnh ống thử trong aceton đông băng khan. Hàn ống thủy phân ở chân không. Thủy phân mẫu thử trong 24 gi ờ ở 110 °C và trong chân không hoặc khí tr ơ để tránh oxy hóa. Nếu lo ngại mẫu thử chưa được thủy phân hoàn toàn, c ần nghiên cứu kéo dài thêm thời gian thủy phân (thí dụ trong 48 giờ và 72 gi ờ). Thủy phân pha hơi: Đây là một trong các kỹ thuật thủy phân thông dụng nhất được ưa dùng để làm vi phân tích, khi ch ỉ có một l ượng nhỏ mẫu thử. Kỹ thuật n ày c ũng cho phép giảm thiểu việc mẫu thử bị nhi ễm bẩn bởi dung dịch thủy phân. Đặt ống thủy phân chứa mẫu thử đã làm khô trong m ột ống thử to hơn, ống này chứa một l ượng thích hợp dung dịch thủy phân v à nh ư v ậy ng ăn không cho m ẫu thử tiếp xúc tr ực tiếp với du ng d ịch thủy phân. Hút chân không (áp suất thấp h ơn 200 µm th ủy ngân hoặc 26,7 Pa), ho ặc b ơm m ột khí tr ơ vào ph ần trên của ống thử. Hàn ống lớn và thủy phân ở 110 ºC trong 24 giờ. Hơi acid s ẽ thủy phân mẫu thử và l ượng acid ngưng t ụ trong ống thủy phân chứ a m ẫu thử là tối thiểu. Sau khi th ủy phân xong, sấy khô mẫu thử trong chân không để loại bỏ acid dư th ừa. K ỹ thuật thủy phân 2 Gi ảm hiện t ượng oxy hóa tryptophan trong khi thủy phân bằng cách d ùng acid mercaptoethansulfonic (MESA) làm acid kh ử. Dung d ịch t h ủy phân: Dung d ịch MESA 2,5 M Th ủy phân pha h ơi: Làm khô 1 - 100 µg m ẫu thử protein/pepti d trong ống thủy phân. Đặt ống thủy phân trong m ột ống lớn h ơn, ch ứa khoảng 200 µl dung dịch thủy phân. H àn ống lớn trong chân không (áp su ất khoảng 50 µm thủy ngân h o ặc 6,7 Pa). Thủy phân ở 170 - 185 °C trong kho ảng 12,5 phút. Sau khi th ủy phân xong làm khô ố ng th ủy phân ở chân không trong 15 phút để loại acid dư th ừa . K ỹ thuật thủy phân 3 Ngăn ng ừa hiện t ượng oxy hóa tryptophan bằng dùng acid thioglycolic (TGA) làm acid kh ử. Dung d ịch thủy phân: Dung d ịch acid hydrocloric 7 M chứa 1% , 10% acid trifluoroacetic và 20% acid thioglycolic. Thủy phân pha hơi: Làm khô từ 10 đến 50 µg mẫu thử protein/peptid trong một ống thủy phân. Đặt ống th ủy phân trong một ống lớn h ơn, ch ứa khoảng 200 µl dung dịch thủy phân. Hàn ống lớn trong chân không (áp su ất khoảng 50 µm thủy ngân hoặc 6,7 Pa). Thủy phân mẫu thử ở 166 ºC trong khoảng 15 - 30 phút. Sau khi th ủy phân xong, l àm khô ống thủy phân trong chân không trong 5 phút để loại acid dư th ừa. Lượng tryptophan t ìm thấy có thể phụ thuộc vào l ượng mẫu lấy thử. K ỹ thuật th ủy phân 4 Oxy hóa cystein/cystin và methionin b ằng acid performic tr ước khi thủy phân mẫu thử. 5 Dung dịch oxy hóa: Dùng acid performic m ới pha bằng cách trộn đều 1 thể tích hydrogen peroxyd 30% (TT) v ới 9 thể tích acid formic khan (TT), r ồi để ở nhiệt độ ph òng trong 1 giờ. Ti ến h ành: Hòa tan m ẫu thử protein/pepti d trong 20 µl acid formic khan (TT) và để ở 50 ºC trong 5 phút. Sau đó thêm 100 µl dung d ịch oxy hóa. Để phản ứng x ảy ra trong 10 - 30 phút. Cystein s ẽ chuyển thành acid cysteic, còn methionin thành methionin sulfon. Ly tâm chân không để loại thuốc thử thừa, rồi thủy phân mẫu thử đã được oxy hóa theo kỹ thuật 1 hoặc 2 nói trên. Kỹ thuật 4 này có thể làm biến đổi tyrosin khi môi trường có muối halid. K ỹ thuật thủy phân 5 Oxy hóa cystein/cystin trong quá trình th ủy phân pha lỏng bằng natri azid. Dung d ịch thủy phân: Thêm vào dung d ịch acid hydroclor ic 6 M có ch ứa 0,2% phenol m ột l ượng natri azid (TT) để có nồng độ 0,2%. Phenol có trong dung d ịch thủy phân ng ăn ng ừa sự halogen hóa của tyrosin. Th ủy phân pha lỏng: Th ủy phân mẫu thử protein/pepti d ở 110 ºC trong 24 gi ờ. Trong quá trình thủy phân, cystein/cystin trong m ẫu thử chuyển thành acid cysteic bởi tác dụng của natri azid có trong dung d ịch thủy phân. Kỹ thu ật 5 này cho kết quả tìm thấ y c ủa tyrosin tốt h ơn k ỹ thuật 4 nh ưng l ại không định lượng được methionin. Methionin chuyển th ành hỗn hợp của methionin với 2 dẫn chất oxy hóa là methionin sulfoxid và methionin sulfon. Kỹ thuật thủy phân 6 Oxy hóa cystein/cystin b ằng dimethyl sulfoxid (DMSO) (TT) Dung d ịch thủy phân : Thêm vào dung d ịch acid hydrocloric 6 M (TT) , ch ứa 0,1% đến 1% phenol, m ột lượng DMSO để được dung dịch nồng độ DMSO 2% (tt/tt). Th ủy phân pha h ơi: Ti ến h ành th ủy phân mẫu thử protein/pepti d ở khoảng 110 °C trong 24 giờ. Trong quá trình thủy phân, cystein/cystin có trong mẫu thử sẽ bị DMSO có trong dung dịch thủy phân chuyển thành acid cysteic. Để h ạn ch ế s ự bất ổn định của k ết quả thu được và để chỉnh lý nh ững sai lệch do sự th ủy huỷ t ừng phần, ng ười ta khuy ên nên xác định kết quả t ìm thấy acid cysteic sau khi đã th ủy phân oxy hóa các m ẫu protein chuẩn chứa từ 1 đến 8 mol cystein. Các hệ số đáp ứng thu được từ các dung d ịch th ủy phân protein/pepti d thường th ấp h ơn kho ảng 30% so v ới hệ số đáp ứng thu được từ các chuẩn acid cysteic không qua th ủy phân. Vì histidin, methionin, tyrosin và tryptophan đều bị biến đổi n ê n k ỹ thuật 6 này không cho kết quả phân tích đầy đủ th ành phần cấu tạo của protein/pepti d. K ỹ th u ật thủy phân 7 Kh ử oxy v à alkyl hóa cystein/cystin bằng phản ứng pyridylethyl hóa ở pha h ơi. Dung d ịch kh ử: Cho vào m ột bình thích hợp: 83,3 µl pyridin, 16,7 µl 4-vinylpyridin, 16,7 µl tributyl phosphin và 83,3 µl nước cất rồi trộn đều. Ti ến hành: Cho vào ống thủy phân một lượng mẫu thử protein/peptid (trong kho ảng từ 1 - 100 µg). Đặt ống thủy phân v ào m ột ống lớn h ơn đã có s ẵn dung dịch khử. H àn kín ống lớn ở chân không (áp suất kho ảng 50 µm thủy ngân hoặc 6,7 Pa) rồi làm nóng ở 100 °C trong 5 phút . Sau đó l ấy ống thủy phân ra, làm khô trong bình hút ẩm chân không trong 15 phút để loại bỏ thuốc thử dư th ừa. Cuối cùng thủy phân m ẫu thử đã được pyridylethyl hóa, theo một trong các kỹ thuật thủy phân mô tả ở tr ên. Song song, tiến hành pyridylethyl hóa trong cùng đi ều kiện một mẫu chuẩn protein chứa 1 - 8 mol cystein để xác định giá tr ị t ìm thấy của pyridylethyl cystein. Chú ý: Vi ệc kéo dài thời gian phản ứng pyridylethyl hóa sẽ gây biến đổi các nhóm α -amino và ε – amino của lysin có trong mẫu thử protein/peptid. K ỹ thuật thủy phân 8 Kh ử oxy và alkyl hóa cystein/cystin b ằn g ph ản ứng pyridylethyl hóa ở pha lỏng. Các dung d ịch gốc: Pha ch ế v à lọc 3 dung dịch trong n ước sau đây: Dung d ịch gốc A: Dung dịch T ris-hydroclorid 1 M (pH 8,5) ch ứa 4 mM di natri edetat. Dung d ịch gốc B: Dung dịch guanidin hydroclorid 8 M Dung d ịch gốc C: Dung dịch 2 -mercaptoethanol 10% 6 Dung d ịch khử: Pha h ỗn hợp gồm 1 thể tích dung dịch gốc A và 3 thể tích dung dịch gốc B để có dung d ịch đệm guanidin hydroclorid 6 M trong Tris-hydroclorid 0,25 M. Ti ến h ành: Hòa tan kho ảng 10 µg mẫu thử protein/pepti d trong 50 µl dung d ịch khử, rồi th êm 2,5 µl dung d ịch gốc C. Để 2 giờ ở nhiệt độ ph òng, trong khí nit ơ ho ặc argon và ở chỗ tối. Để thực hiện phản ứng pyridylethyl hóa, th êm vào khoảng 2 µl 4 -vinylpyridin và để y ên 2 giờ trong tối, ở nhiệt độ ph òng. Sau đó, loại tạp bằng cách tách bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo. Làm khô mẫu thử protein/peptid sau khi qua s ắc ký bằng ly tâm chân không rồi tiến hành thủy phân bằng acid. K ỹ thuật thủy phân 9 Kh ử oxy v à alkyl hóa cystein/cystin b ằng phản ứng carboxymethyl hóa ở pha lỏng. Các dung d ịch gốc: Pha như ở kỹ thuật thủy phân 8. Dung d ịch carboxymethyl hóa: Dung d ịch iodoacetamid 10% trong ethanol 96%. Dung d ịch đệm: Dùng dung dịch khử của kỹ thuật thủy phân 8. Ti ến h ành: Hòa tan m ẫu thử protein/pepti d trong 50 µl dung d ịch đệm, th êm kho ảng 2,5 µl dung dịch g ốc C. B ảo quản 2 giờ trong khí nit ơ ho ặc argon ở nhiệt độ ph òng và trong tối. Thêm một l ượng dung d ịch carboxymethyl hóa gấp 1,5 lần tổng l ượng các thiol có trong m ẫu thử theo lý thuyết. Nếu không bi ết hàm l ượng các thiol trong mẫu thử th ì c ứ 20 nanomol protein dùng 5 µl dung dịch iodoacetamid 100 mM. Để tiếp 30 phút trong t ối ở nhiệt độ ph òng. Sau đó thêm lượng dư 2-mercaptoethanol để dừng ph ản ứng. Loạ i t ạp v à thu phần protein/peptid b ằng cách phân tách tr ên sắc ký lỏng pha đảo. Làm khô ph ần protein/peptid thu được bằng ly tâm chân không trước khi thủy phân bằng acid. Trong quá trình th ủy phân, chất S -carboxyamidomethylcystein đã được chuyển đổi th ành S- carboxymethylcystein. K ỹ thuật thủy phân 10 Cystein/cystin tác dụng với acid dithiodiglycolic hoặc acid dithiodipropionic để cho một disulfid hỗn t ạp.Tùy theo yêu cầu v ề độ phân giải của kỹ thuật phân tích acid amin được áp dụng m à chọn dùng acid dithiodiglycolic ho ặc acid dithiodipropionic. Dung dịch khử: Dung d ịch acid dithiodi glycolic (ho ặc acid dithiodipropionic) 1% trong dung dịch NaOH 0,2M. Ti ến hành: Cho vào ống thủy phân kh o ảng 20 µg mẫu thử protein/peptid . Thêm 5 µl dung d ịch khử và 10 µl isopropanol. Ly tâm chân không để loại pha lỏng rồi thủy phân mẫu thử theo kỹ thuật thủy phân 1. K ỹ thuật 10 này có lợi là các thành phần acid amin khác trong mẫu thử không bị ảnh h ưởng của phản ứng v à không c ần loại tạp tr ước khi thủy phân. K ỹ thuật thủy phân 11 Trong quá trình th ủy phân bằng acid, asparagin và glutamin được chuyển đổi th ành acid aspar tic và acid glutamic tương ứng . Asparagin và acid aspartic được biểu thị bằng một đại lượng chung Asx, c òn glutamin và acid glutamic b ằng Glx. Trái lại, khi thủy ph ân b ằng acid với sự có mặt của thuốc thử bis (1,1-trifluoroacetoxy) iodobenzen (BTI), asparagin và glutamin b ị tác dụng v à chuyển tương ứng th ành acid diamiopropionic và acid diaminobutyric. Nh ờ đó, ta xác định được asparagin v à glutamin trong protein/peptid ngay khi có m ặt c ủa acid aspartic và acid glutamic. Các dung d ịch kh ử : Pha ch ế và lọc 3 dung dịch sau: Dung d ịch A: Dung dịch acid trifluoroacetic 10 mM. Dung d ịch B: Dung dịch chứa guanidin hydroclorid 5 M v à acid trifluoroacetic 10 mM. Dung d ịch C: Du ng d ịch mới pha BTI 3,6% trong dimethylformamid. Tiến hành: Cho vào một ống thủy phân sạch khoảng 200 µg mẫu thử protein/peptid, 2 ml dung dịch A ho ặc dung dịch B và 2 ml dung dịch C. Hàn ống thủy phân trong chân không. Để 4 giờ ở nhiệt độ 60 ºC trong t ối. Sau đó th ẩm tách mẫu thử bằng nước cất để loại bỏ thuốc thử dư th ừa. Chiết mẫu thử đã th ẩm tách 3 l ần bằng 3 th ể tích t ương đương butyl acetat, r ồi l àm đông khô. Cu ối cùng thủy phân mẫu thử đông khô theo các k ỹ thu ật thủy phân đã nói ở trên. Các acid α, -diaminopropionic và α, - diaminobutyric đều không được phân giải r õ ràng v ới lysin có trong m ẫu thử, khi phân tách bằng sắc ký trao đổi ion. V ì v ậy, khi dùng sắc ký trao đổi ion để tách các acid amin, hàm lượng của asparagin v à của glutamin có mặt trong mẫ u th ử được xác định bằng hiệu số 7 gi ữa hàm l ượng của acid aspactic v à của acid glutamic t ương ứng thu được khi thủy phân acid không có BTI và hàm lượng của acid aspartic và c ủa acid glutamic t ương ứng thu được khi thủy phân có BTI. Hàm lượng của threonin, methionin, cystein, tyrosin và histidin có th ể bị sai lệch khi thủy phân bằng acid có BTI. Vì v ậy , mu ốn có giá trị đúng c ủa các hàm lượng n ày, m ẫu thử phải được thủy phân bằng acid, không có thu ốc thử BTI. Tách và phát hi ện các acid amin Có nhi ều kỹ thuật để tách v à phát hi ện các acid amin; lựa chọn kỹ thuật nào phụ thuộc vào yêu cầu về độ nhạy của phép định lượng. Nh ìn chung, kho ảng một nửa các phép phân tích acid amin d ựa tr ên việc tách thành acid amin t ự do bằng sắc lý lỏng trao đổi ion rồi tạo dẫn chất sau c ột phân tách. Kỹ thuật tạo d ẫn chất sau cột có thể áp dụng cho các mẫu thử có một l ượng nhỏ chất đệm (như các mu ối và urê) và thường cần từ 5 µg đến 10 µg mẫu thử protein cho một lần phân tích. Các k ỹ thuật c òn lại, bao gồm việc tạo các dẫn chất tr ước c ột rồi tách chúng bằng sắc ký l ỏng cao áp pha đảo. Các kỹ thuật tạo dẫn chất trước cột rất nhạy v à th ường chỉ cần từ 0,5 µg đến 1,0 µg m ẫu thử protein/peptid cho m ỗi lần phân tích, nh ưng l ại có thể bị ảnh h ưởng bởi các muối đệm có trong mẫu thử. M ặt khác, k ỹ thuật tạo dẫn chất trước cột c òn có thể ch o nhi ều dẫn chất khác nhau của c ùng m ột acid amin, do đó gây tr ở ngại cho việc biện gi ải kết quả phân tích. So với kỹ thu ật tạo dẫn chất tr ước cột, thường kỹ thuật tạo dẫn chất sau cột ít bị ảnh hưởng bởi các bi ến thi ên trong việc thực hiện phép định lượng hơn. Có th ể dùng các kỹ thuật sau đây để phân tích định lượng các acid amin. Thi ết bị và thuốc thử đều có sẵn tr ên thị tr ường. Hơn n ữa, hiện có nhiều cải tiến về các mặt nh ư pha ch ế thu ốc thử, cách tiến h ành ph ản ứng, thiết bị sắc ký d ùng trong các kỹ thuật này, v.v Các thông số đặc trưng có thể thay đổi tùy thuộc vào thiết bị đã dùng và cách tiến hành phân tích. Nhiều phòng thí nghệm còn áp d ụng đồng thời nhiều kỹ thuật chứ không chỉ một, để tận dụng lợi ích c ủa mỗi kỹ thuật đã áp d ụng . Trong các k ỹ thuật sau đây, tín hi ệu t ương t ự được hiển thị tr ên máy ghi và diện tích các pic được tích phân để định lượng. K ỹ thuật 1: Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin S ắc ký trao đổi ion tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin l à một trong các kỹ thuật thông dụng nh ất để phân tích định lượng các acid amin. Theo nguy ên tắc, sắc ký trao đổi cation, d ùng lithi làm đối ion trong pha động được áp dụng để phân tích các mẫu thử sinh học phức tạp; trái lại, sắc ký trao đổi cation, dùng natri làm đối ion trong pha động, nhanh hơn, được d ùng v ới các mẫu thử đơn gi ản h ơn, g ồm hỗn hợp các acid amin đã được thủy phân từ protein/peptid ra (tiêu bi ểu gồm 17 acid amin khác nhau). Vi ệc phân tích acid amin trên cột trao đổi ion được thực hiện thông qua sự phối hợp giữa thay đổi pH và thay đổi lực ion của pha động (chương trình dung môi). Chương trình nhi ệt độ cũng thường được áp d ụng để tăng nhanh s ự phân tách. Các acid amin b ậc nhất tác dụng với ninhydrin cho h ợp chất m àu tí m, h ấp thụ cực đại ở bước sóng 570 nm. Trái l ại, các acid amin bậc 2 (các imino acid) như prolin, tác d ụng với ninhydrin cho hợp chất màu vàng, h ấp thụ cực đại ở 440 nm. V ì vậy ta phát hiện các dẫn chất của acid amin thu được sau cột ở các bước sóng 440 v à 570 nm. Đối với đa s ố các dẫn chất acid amin, giới hạn phát hiện được xác định l à 10 picomol; đối với d ẫn chất c ủa prolin, giới hạn đó là 50 picomol. Kho ảng tuyến tính l à 20 - 500 picomol, v ới hệ số t ương quan r > 0,999. Để có kết quả tốt, d ùng một l ượng m ẫu thử lớn h ơn 1 µg để thủy phân trước khi phân tích các acid amin trong protein/peptid là thích hợp nhất. K ỹ thuật 2: Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử OPA Thu ốc thử ortho -phthalaldehyd (OPA) tác d ụng với các amin b ậc nhất, khi có mặt một hợp chất thiol , cho các h ợp chất isoindol phát huỳnh quang. OPA không tác dụng với các amin bậc 2 (các imino acid như prolin) để có hợp chất phát huỳnh quang; tuy nhi ên, nếu oxy hóa chúng bằng natri hypoclorid hoặc cloramin T thì ph ản ứng với OPA sẽ xảy ra. Do đó, để phân tích các acid amin trong m ẫu thử protein/peptid b ằng kỹ thuật này, ta phải tách các acid amin tự do b ằng sắc ký trao đổi cation mạnh rồi oxy hóa sau c ột bằng natri hypoclorid hoặc cloramin T v à tiếp đó t ạo dẫn chất phát huỳnh quang bằng 8 thu ốc thử OPA vớ i s ự có mặt của một hợp chất thiol nh ư N-acetyl-L-cystein ho ặc 2 -mercaptoethanol. Các acid amin b ậc nhất không bị ảnh h ưởng bởi sự oxy hóa nói tr ên. Vi ệc tách các acid amin bằng sắc ký lỏng trao đổi ion được thực hiện nhờ sự phối hợp giữa việc thay đổi pH và thay đổi lực ion của pha động (chương trình dung môi). Sau khi được phân tách, các dẫn chất phát hu ỳnh quang sẽ được phát hiện với bước sóng kích thích ở 348 nm v à b ước sóng phát quang ở 450 nm. Gi ới hạn phát hiện được xác định ở mức một v ài chục picomol, đối với đa s ố các dẫn chất OPA của acid amin.Kho ảng tuyến tính l à từ vài picomol đến v ài ch ục nanomol. Để có kết quả phân tích tốt, lấy mẫu th ử pr otein/peptid lớn hơn 500 ng để thủy phân. K ỹ thuật 3: Tạo dẫn chất tr ước cột với thuốc thử PITC Thu ốc thử p henylisothiocyanat (PITC) tác d ụng với các acid amin để th ành dẫn chất phenylthiocarbamyl (PTC) h ấp thụ mạnh bức xạ ở b ước sóng 254 nm. Tách các chất PTC của acid amin, đã được tạo trước cột, b ằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, d ùng c ột octadecylsilyl (ODS) v à phát hi ện ở b ước sóng 254 nm. Vi ệc phân tách các dẫn chất acid amin bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo được thực hiện nhờ việc phối h ợp giữa các thay đổi về nồng độ acetonitril v à về lực ion trong pha động. Đối với đa s ố các dẫn chất PTC -acid amin, gi ới hạ n phát hi ện được xác định l à 1 picomol. Kho ảng tuy ến tính là 20 - 500 picomol v ới hệ s ố t ương quan r > 0,999. Để có kết qu ả phân tích t ốt, lấy l ượng m ẫu thử lớn h ơn 500 ng để thủy phân. Chú ý: Sau khi đã lo ại bỏ trong chân không thuốc thử d ư, các d ẫn chất PTC-acid amin có th ể bảo quản khô và đông băng trong vài tu ần lễ mà không có sự phân hủy nào đáng k ể. Nếu dung dịch để ti êm vào máy s ắc ký được bảo quản lạnh, sau 3 ng ày c ũng ch ưa th ấy suy giảm đáp ứng sắc ký nào đáng k ể xảy ra. K ỹ thuật 4: Tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử AQC Thu ốc thử 6 -aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC) tác d ụng với các acid amin tạo thành các d ẫn chất urê bất đối xứng, ổn định, phát huỳnh quang (các dẫn chất AQC-acid amin) và được phân tách b ằng sắc ký lỏng cao áp ph a đảo. Do đó, ta t ạo dẫn chất AQC trước cột rồi tách chúng bằng s ắc ký lỏng cao áp pha đảo, d ùng cột ODS và phát hiện bằng detector huỳnh quang, ở b ước sóng kích thích 250 nm và bước sóng phát quang ở 395 nm. Việc phân tách được thực hiện nhờ việc phối hợp s ự thay đổi nồng độ acetonitril v à thay đổi lực ion của pha động (chương trình dung môi). Tiêm tr ực tiếp h ỗn hợp mẫu thử v à thuốc thử vào máy sắc ký. Không có nhiễu đáng k ể gây ra bởi 6-aminoquinolin, s ản ph ẩm thứ cấp chủ yếu phát huỳnh quang của thuốc th ử. Thuốc thử dư được thủy phân nhanh chóng (nửa đời < 15 giây) th ành các chất 6 -aminoquinolin, N-hydroxysuccinimid và carbon dioxyd, và sau đó 1 phút, không còn ph ản ứng tạo dẫn chất xảy ra. Di ện tích pic của các dẫn chất AQC -acid amin không thay đổi chủ yếu trong thời gian 1 tuần lễ, ở nhệt độ ph òng. Nh ờ tính ổn định n ày, có th ể tiến hành phân tích qua đêm trên các máy t ự động được. Gi ới hạn phát hiện được xác định ở v ào khoảng từ 40 femtomol đến 320 femtomol, tính cho mỗi acid amin, tr ừ cystein. Giới hạn phát hi ện của cystein xấp xỉ bằng 800 femtomol. Khoảng tuyến tính là từ 2,5 đến 200 micromol, với hệ số tương quan r > 0,999. Có th ể thu được kết quả phân tích tốt với lượng mẫu protein/peptid l ấy thử thấp tới 30 ng. K ỹ thuật 5: Tạo dẫn chất tr ước cột với thu ốc thử OPA Thu ốc thử orthophthalaldehyd (OPA), khi có m ặt một hợp chất thiol (có thể dùng 2 -mercaptoethanol hoặc acid 3-mercaptopropionic), sẽ tác dụng với các amin bậc nhất để cho một hợp chất isoindol phát hu ỳnh quang mạnh. Bản thân thuốc thử OPA khô ng phát hu ỳnh quang, nên không gây trở ngại. Mặt khác, vì OPA d ễ tan v à ổn định trong nước đồng thời cho phản ứng nhanh n ên có th ể tạo dẫn chất và phân tích m ẫu thử một cách tự động, dùng thi ết bị tự nạp mẫu thử để trộn lẫn mẫu thử với thuốc thử. Tuy nhiên, OPA không cho ph ản ứng với các amin bậc 2, nên kỹ thuật 5 này không áp dụng được để phân tích các acid amin có hóa ch ức amin bậc 2 nh ư prolin. Để khắc phục, phải phối hợp kỹ thuật 5 n ày v ới kỹ thuật 7 hoặc 8 mô tả sau đây. 9 Vì d ẫn chất OPA -acid amin không b ền vững nên sau khi t ạo dẫn chất tr ước cột, phải tiến h ành phân tích ngay trên s ắc ký lỏng cao áp pha đảo v à phát hiện kết quả bằng detector huỳnh quang ở b ước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát quang 450 nm. Gi ới hạn phát hi ện bằng huỳnh quang th ấp t ới 50 femtomol đã được báo cáo. Tuy nhi ên, gi ới hạn phát hi ện thực tế của phép phân tích là 1 picomol. Kỹ thuật 6: Tạo dẫn chất trước cột bằng thuốc thử DABS-Cl Thu ốc thử dimethylamino -azobenzensulfonyl clorid (DABS-Cl) là m ột thuốc thử cho màu để phát hi ện acid amin. Các d ẫn chất tạo th ành (DABS -acid amin) r ất bền vững v à hấp thụ cực đại ở bước sóng 436 nm. T ạo các dẫn chất n ày tr ước cột rồi tách chúng bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, dùng c ột ODS v à phát hi ện kết quả ở b ước sóng 436 nm. K ỹ thuật này c ó th ể phân tích cả các acid amin bậc nhất và acid amin bậc hai (nh ư prolin) v ới cùng độ nh ạy nh ư nhau. Còn có th ể định lượng đồng thời th ành phần tryptophan có trong m ẫu thử protein/peptid sau khi đã th ủy phân mẫu thử bằng các acid sulfonic nh ư: Acid mercaptoethansulfonic, acid p- toluensulfonic ho ặc acid methansulfonic nh ư đã mô t ả ở kỹ thuật thủy phân 2 ở trên. Các thành phần khác d ễ hỏng vì acid nh ư asparagin và glutamin c ũng được phân tích sau khi đã làm ph ản ứng chuyển đổi th ành acid diaminopropionic và acid diaminobutyric tương ứng bằng phản ứng với thuốc thử BTI đã mô t ả ở kỹ thuật thủy phân 11 ở tr ên. Trong k ỹ thu ật n ày, không dùng norleucin nhân tạo để l àm chu ẩn nội , vì nó được rửa giải ra tại v ùng dày đặc các pic của các acid amin bậc nhất tr ên sắc đồ. Có th ể dùng nitro -tyrosin làm chu ẩn nội vì nó được rửa giải ra tại v ùng có ít pic trên sắc đồ. Gi ới hạn phát hiện các DABS -acid amin ở khoảng 1 picomol. L ượng nhỏ từ 2 - 5 picomol c ủa một DABS-acid amin nào đó c ũng có thể cho kết quả định lượng đáng tin c ậy, v à chỉ cần dùng 10 - 30 ng protein thủy phân đã được dẫn chất hóa cho mỗi lần phân tích. K ỹ thuật 7: Tạo dẫn chất tr ước cột với thuốc thử FMOC-Cl Thu ốc thử 9 -fluorenylmethyl cloroformat (FMOC-Cl) tác d ụng với acid amin bậc nhất và acid amin bậc hai để tạo th ành các dẫn chất FMOC -acid amin phát hu ỳnh quang mạnh. Ph ản ứng xảy ra nhẹ nh àng trong môi tr ường nước, trong 30 giây. Các dẫn chất được tạo th ành đều bền v ững , ch ỉ riêng d ẫn chất của histidin là có biểu hiện phân hủy nào đó. M ặc dù bản thân thuố c th ử và các s ản phẩm phụ của phản ứng đều phát huỳnh quang nhưng ta có th ể loại chúng mà không làm mất mát các d ẫn chất FMOC -acid amin. Sau khi t ạo dẫn chất tr ước cột, tiến h ành tách các FMOC -acid amin b ằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, dùng c ột ODS, với ch ương trình gradient dung môi, bi ến thi ên tuyến tính từ hỗn hợp gồm 10 thể tích acetonitril, 40 th ể tích methanol và 50 thể tích đệm acid acetic đến hỗn hợp gồm 50 thể tích acetonitril, 50 th ể tích đệm acid acetic. Phát hiện kết quả bằng detector huỳnh quang ở b ước sóng kích thích 260 nm và bước sóng phát quang 313 nm. Có thể phân tích được 20 dẫn chất acid amin trong v òng 20 phút. Gi ới hạn phát hiện vào c ỡ femtomol. Đa s ố các acid amin có khoảng tuy ến tính từ 0,1 - 50 micromol. K ỹ thuật 8: Tạo dẫn chất tr ước c ột bằng thuốc thử NBD -F Thu ốc thử 7 -fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) tác d ụng với cả acid amin bậc nhất và acid amin b ậc 2, ở nhiệt độ 60 ºC, trong 5 phút, để cho các dẫn chất NBD-acid amin phát hu ỳnh quang mạnh. Sau khi t ạo dẫn chất tr ước cột, tách chúng bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, d ùng c ột ODS và ch ương trình gradient dung môi g ồm acetonitril v à hỗn hợp đệm trong nước. 17 d ẫn chất acid amin được tách ra trong vòng 35 phút. Có th ể dùng acid -aminocaproic làm chu ẩn nội, vì được rửa giải ở v ùng ít pic trên s ắc đồ. Phát hiện kết quả bằng detector huỳnh quang, ở bước sóng kích thích 480 nm v à b ước sóng phát quang ở 530 nm. K ỹ thuật này có độ nhạy gần tương t ự nh ư độ nhạy của kỹ thuật tạo dẫn chất trước cột với thuốc thử OPA (k ỹ thuật 5) đối v ới các acid amin, trừ prolin không phân tích được bằng kỹ thuật 5 v ì không phản ứng với thuốc thử OPA. Như v ậy, kỹ thuật 8 này ích lợi h ơn k ỹ thuật 5. Gi ới hạn phát hiện mỗi acid amin ở khoảng 10 femtomol v à l ượng mẫu thử protein/peptid th ủy phân cần l ấy để tạo dẫn chất trước cột ở khoảng 1,5 mg. 10 Tính kết quả Khi xác định h àm l ượng các acid amin trong một m ẫu thử protein/peptid , c ần nhớ rằng, trong quá trình th ủy phân bằng acid, tryptophan v à cystein bị phá hủy, serin và threonin bị phá hủy một phần, val in và isoleucin không được tách ho àn toàn, methionin có th ể bị oxy hóa và một vài acid amin nh ư glycin và serin thường bị nhiễu. Tiến h ành phân tích ở môi tr ường chân không thích hợp (áp suất th ấp hơn 200 µm thủy ngân hoặc 26,7 Pa) hoặc ở môi trường có khí trơ (như argon) khi thủy phân pha hơi, có thể gi ảm mức phân hủy do bị oxy hóa. Các kết quả định lượng cystein, tryptophan, threonin, isoleucin, valin, methionin, glycin và serin trong m ột mẫu thử protein/peptid đã th ủy phân có thể thay đổi v à do đó thường c ần tiến h ành xem xét đánh giá b ổ sung. Tính t ỷ lệ phần tr ăm hàm lượng của một loại acid amin có trong m ẫu thử protein/peptid Đó là s ố l ượng nanomol của một loại acid amin có trong 100 nanomol của to àn thể các acid amin có trong m ẫu thử protein/peptid . T ỷ l ệ này có ích trong việc đánh giá các d ữ liệu thu được khi phân tích các acid amin trong m ột protein m à ta ch ưa bi ết khố i lượng phân tử. Nó giúp củng c ố kết quả định tính m ột protein/peptid chưa bi ết bằng cách so sánh tỷ lệ phần tr ăm hàm lượng mỗi loại acid amin trong m ẫu thử chưa bi ết với tỷ lệ phần tr ăm hàm lượng của mỗi loại acid amin tương ứng có trong các protein/peptid đã bi ết. Tính t ỷ lệ phần tr ăm hàm lượng của một acid amin trong protein/peptid theo công th ức sau: t i r r100 V ới r i = đáp ứng (hàm l ượng) tính theo nanomol c ủa acid amin i. r t = đáp ứng (hàm l ượng) tính theo nanomol của tất cả các acid amin thu được tr ên sắc đồ. M ẫu thử protein/peptid chưa bi ết Xác định khối lượng Q i (tính theo microgam) c ủa mỗi loại acid amin có m ặt trong mẫu protein/peptid chưa biết Tính b ằng công th ức sau: 1000 ii i Mm Q   V ới Q i = kh ối lượng (tính theo microgam) của acid amin i có trong mẫu thử. m i = hàm lượng (tính theo nanomol) c ủa tất cả các acid amin i tìm th ấy trên s ắc đồ. M i = phân t ử l ượng trung b ình (tính theo gam) của acid amin i, đã được chỉnh lý về khối lượng H 2 O b ị lo ại khi t ạo th ành liên kết peptit. Ước lượng tổng khối lượng của mẫu thử protein/peptid T ổng khối l ượng Q i c ủa các loại acid amin tìm thấy cho phép ta ước lượng khối lượng của protein/peptid đem th ử sau khi đã ch ỉnh lý về khối l ượng mất mát do có sự phân hủy từng ph ần hoặc toàn phần của một số acid amin dễ bị phân hủy trong quá trình thủy phân. Xác định số lượng của mỗi lo ại acid amin tham gia c ấu tạo mẫu thử protein/peptid chưa bi ết. N ếu xác định được phân tử lượng M p c ủa protein/peptit đem th ử (thí dụ bằng khối ph ổ), ta tính số lượng của mỗi lo ại acid amin i theo công thức sau: p pi p p i Q Mm M Q m 1000 1000   [...]... lượng tính theo nanomol của acid amin i tìm thấy trong mẫu thử Qp = khối lượng, tính theo microgam, của protein đem thử Mp = phân tử l ượng của protein đem thử (tính theo gam) Mẫu thử protein/peptid đã biết phân tử l ượng và thành phần cấu tạo Khi phân tích acid amin, một số acid amin cho kết quả tìm thấy tốt, trái lại, một số cho kết quả tìm thấy không sử dụng được vì hoặc bị phân hủy một phần hay toàn... số acid amin tự do (nh ư bởi glycin và serin) Các acid amin cho kết quả tìm thấy tốt điển hình là aspartat -asparagin, glutamat-glutamin, alanin, leucin, phenylalanin, lysin và arginin Danh sách này có thể thay đổi tùy thuộc vào hệ thống phân tích đã dùng Các acid amin cho kết quả tìm thấy tốt đại diện cho protein, do đó ta lợi dụng chúng để xác định hàm lượng protein và số l ượng của mỗi loại acid amin. .. amin (còn gọi là thành phần của acid amin) có trong mẫu thử Xác định hàm lượng protein trong mẫu thử Chia hàm lượng (tính theo nanomol) của mỗi loại acid amin có giá trị tìm thấy tốt cho số l ượng dự đoán của acid amin đó trong protein để có hàm lượng protein tính theo loại acid amin đó Tính giá trị trung bình của tất cả các hàm l ượng protein tính được theo từng loại acid amin có giá trị tìm thấ y tốt... giá trị còn lại (không bị loại bỏ) của hàm l ượng protein riêng rẽ tính theo từng loại acid amin còn lại Xác định số lượng của từng loại acid amin trong mẫu thử Chia hàm lượng của mỗi loại acid amin cho giá trị trung bình của hàm lượng protein đã tính ở trên, ta được số lượng của loại acid amin đó (tức thành phần acid amin) trong mẫu thử Tính sai số tương đối (theo tỷ lệ phần trăm) về thành phần trong... phần đối với một loại acid amin i: 100mi mis Với m i = hàm lượng, tính theo nanomol, xác định bằng thực nghiệm, của loại acid amin i có trong mẫu thử mis = hàm lượng (tính theo nanomol) đã biết của loại acid amin i có trong mẫu thử Giá trị sai số tương đối trung bình về thành phần của mẫu thử là giá trị trung bình của tất cả các sai số tương đối về thành phần tính theo từng loại acid amin riêng rẽ, trừ... và cystein Giá trị sai số tương đối trung bình về thành phần của một mẫu thử cung cấp thông tin quan trọng về độ ổn định của phép phân tích theo thời gian S ự phù hợp giữa giá trị thành phần acid amin trong mẫu thử, tìm thấy bằng thực nghiệm với giá trị thành phần acid amin đã biết trước của protein đem thử có thể giúp cho việc củng cố kết quả định tính và xác định độ tinh khiết của protein trong mẫu... được theo từng loại acid amin có giá trị tìm thấ y tốt của mẫu thử Các hàm lượng protein tính theo từng loại acid amin riêng rẽ phải được phân bố đồng đều xung quanh giá trị trung bình của hàm l ượng protein mới tính được ở trên Phải loại bỏ các giá trị hàm l ượng protein riêng rẽ của từng acid amin quá sai lệch với giá trị trung bình đã tính được Thường các giá trị sai lệch quá 5% phải loại bỏ Khi đó, . 1 10.11. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN Phương pháp phân tích acid amin là phương pháp xác định th ành ph ần và hàm lượng các acid amin trong các protein và peptid,. nồng độ của acid amin cần phân tích đó. N ế u th ời gian thủy phân quá d ài, nồng độ của các acid amin c ần phân tích sẽ bắt đầu giảm, chứng tỏ acid amin đó đã b ị phân hủy do đi ều kiện thủy phân. M ột. tiến hành phân tách các acid amin t ạo ra mẫu thử đó. Th ủy phân bằng acid có thể cho kết quả phân tích thay đổi vì m ột số acid amin bị phân hủy một phần hay hoàn toàn. Cụ thể là: Tryptophan b ị phân