Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký ppsx

Dẫn xuất tiền cột:  Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde OPA, tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được tra

ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng

phương pháp sắc ký

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ

GVHD : PHẠM TRẦN THÙY HƯƠNG

NHÓM :2.5

A.ĐẶT VẤN ĐỀ

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất

một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid imin)

Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau,

do đó việc phân tích chúng để xác định thành

phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất

cần thiết

B.NỘI DUNG

I.Xử lý mẫu- Tạo dẫn xuất

1 Thủy phân protien,peptide

Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy

vào loại thực phẩm và thành phần của protien

Thứ tự thủy phân :

+Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112oC khoảng 20 -30 phút

trước khi thủy phân

+Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực

phẩm)

+Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có

phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin )

Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien như:

 o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC),

carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl

(AQC) Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước sóng khác nhau

 Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhiều bước

Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại

Cho vào bình định mức

Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô

 Chuẩn bị dung dich dẫn xuất

Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương pháp dẫn xuất

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

 o-phthalaldehyde hoặc

ortho-phthalaldehyde (OPA) là các hợp

chất hóa học với công thức C6 H4

(CHO)2

 Thường được viết tắt OPA, phân tử

này là một dialdehyde bao gồm hai

nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

trong dung dịch nước ở pH <11,5 Nó nhạy cảm với tia cực tím và oxy không khí

 o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin trong với sự có mặt của các hợp chất thiol, hình thành các sản phẩm huỳnh quang Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích của các axit amin bằng sắc ký trao đổi ion

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất tiền cột (Precolumn derivatization) và tạo dẫn xuất sau cột (derivatization postcolumn).

Dẫn xuất tiền cột:

 Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde (OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450 nm

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

Dẫn xuất tiền cột:

 o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin với sự có mặt của hợp chất thiol để hình thành các sản phẩm huỳnh quang N-acetyl-L-cysteine và 2 -mercaptoethanol có thể được sử dụng như là các thiol

 OPA tự nó không phát huỳnh quang và do đó không ảnh hưởng đến kết quả phân tích

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

Dẫn xuất tiền cột:

cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới

amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp tạo dẫn xuất này Phương pháp này không phân tích được các acid amin thứ cấp (ví dụ như proline).

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

Dẫn xuất sau cột

 Nguyên tắc tạo dẫn xuất sau cột là sử dụng cột trao đổi ion để tách các axit amin tự do, tiếp theo là quá trình oxy hóa các acid amid bằng hypochlorite natri rồi thực hiện phản ứng với OPA với sự có mặt của hợp chất thiol như N-acetyl-L-cysteine và 2-mercaptoethanol

 Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp ( proline) để tạo thành các chất huỳnh quang, nhưng quá trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ cấp phản ứng với OPA.

Dẫn xuất sau cột

 Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được

đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò huỳnh quang 348nm.

 Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến tính trong phạm vi của một vài pmol đến vài chục nmol.

 So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin thứ cấp.

a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

b Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F

 Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBD-F

là phản ứng của các acid amin với

7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1.3-diazole

(NBD-F), NBD-F phản ứng với các acid

amin kể cả các acid amin thứ cấp để

tạo thành sản phẩm cao huỳnh quang,

tiếp theo là tách HPLC pha đảo với sử

dụng đầu dò huỳnh quang bước sóng

kích thích là 480 nm và bước sóng phát

xạ là 530 nm. NBD-F

 Các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tạo dẫn xuất là ở nhiệt độ 60 o C và môi trường kiềm trong 5 phút, sau đó dùng acid HCl bổ sung vào hỗn hợp để hạn chế ảnh

hưởng của chất chất nền huỳnh quang.

 Ưu điểm: Độ nhạy của phương pháp này gần với phương pháp tạo dẫn xuất tiền cột OPA nhưng có ưu điểm hơn là phản ứng được với acid amin thứ cấp.

 Giới hạn phát hiện của phương pháp tạo dẫn xuất này cho mỗi acid amin là khoảng 10 fmol.

c Phương pháp tạo dẫn xuất PITC

là một thuốc thử được sử dụng

trong HPLC pha đảo ngược

PITC, ít nhạy cảm hơn (OPA) và

không thể hoàn toàn tự động

tuy nhiên PITC có thể tạo sản

c Phương pháp tạo dẫn xuất PITC

 Đầu tiên loại hết HCl dư và làm khô Sau khi đã làm khô bổ sung thuốc thử tạo dẫn xuất gồm ethanol:TEA: nước cất: PITC = 7:1:1:1, làm sạch dẫn xuất bằng cách hạ áp suất trong 30-45 phút.

 Lưu trữ mẫu dẫn xuất PITC sau khi sấy khô, tái sử dụng dẫn xuất bằng cách hòa tan lại nó vào dung dịch đệm photphat pH= 7,4 và acetonitrile với tỉ lệ 95:5 chỉ có thể giữ được tối đa một ngày ở nhiệt độ phòng, hay 60-70 giờ khi để trong tủ lạnh.

c Phương pháp tạo dẫn xuất PITC

cực tím ở 254 nm, giới hạn phát hiện tối thiểu được khoảng

1 pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin Tuyến tính thu được trong khoảng 20-500 pmol

thuốc thử dư thừa, qua đó giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của thuốc thử.

cột vì sự chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất yêu cầu thời gian dài.

II Định lượng axit amin bằng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)

pháp ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do

có ái lực khác nhau với pha động( dung môi) và pha tĩnh (các hạt nhồi trong cột) mà chúng ra khỏi cột với thời gian khác nhau,chất nào có ái lực với pha tĩnh lớn hơn sẽ giữ trong cột lâu hơn, còn chất có ái lực nhỏ với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột cùng với pha động sớm hơn

dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn

thước nhỏ trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp

Nguyên tắc của phương

pháp:

II Định lượng axit amin bằng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)

1 Chuẩn bị dung dịch axit amin chuẩn:

chuẩn cho vào ống nghiệm và làm dẫn xuất như đối với

dung dịch mẫu

cùng của PITC

quả ổn định trong vòng 10 giờ.Còn các mẫu chưa pha loãng thì có thể giữ được trong 60 giờ,Vì vậy không nên lưu trữ các mẫu chưa pha loãng.Những mẫu khô có thể để nhiều tuần trong tủ đông.

2 Xử lí mẫu (như đã trình bày ở trên )

3 Dụng cụ hóa chất

 Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl

phenol cho vào 1 ml hcl

II Định lượng axit amin bằng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)

4 Cách tiến hành

 Sau khi chuẩn bị xong mẫu, cho dung môi pha

động vào bình chứa pha động

 Đưa mẫu vào thiết bị kim tiêm mẫu

 Điều chỉnh các thông số cho máy sắc kí: nhiệt độ, vận tốc dòng, bước sóng của đầu dò

 Khởi động máy và tiến hành chạy sắc ký, sau đó

xử lý số liệu và tính toán kết qủa

II Định lượng axit amin bằng phương

 Chiều cao peak trên sắc ký đồ

 Nhận dạng peak và thứ tự các axit amin trên sắc ký đồ

 Nồng độ chuẩn trong dung dịch hỗn hợp chuẩn

 Lập đường chuẩn từ các nồng độ chuẩn

 Công thức tính kết quả: Hàm lượng mỗi axit amin trong mẫu phân tích được tính bằng số mg có

trong 1g mẫu bằng công thức:

M S

CV S

C M

II Định lượng axit amin bằng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)

5 Xử lý kết quả:

II Định lượng axit amin bằng phương

pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)

5 Xử lý kết quả:

 SM – diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của

C Kết luận

 Việc phân tích acid amin rất phổ biển trong mọi lĩnh vực, trong y học, thực phẩm, nghiên cứu…với việc tạo ra các dẫn xuất đã góp phần phân tích acid amin trở nên thuận lợi và có độ chính xác rất cao Cùng với sụ ra đời của các thiết bị sắc kí với nhiều ưu điểm nổi bật về tốc độ phân tích và độ chính xác, phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký đặc biệt là sắc ký lỏng cao

áp đã đem lại hiệu quả rất lớn mà các phương pháp phân tích thông thường không đáp ứng được