LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................ 1 TÓM TẮT.............................................................................................................. 1 MỤC LỤC............................................................................................................. 3 DANH SÁCH BẢNG............................................................................................ 4 DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. 6 MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... 7 PHẦN I GIỚI THIỆU............................................................................................ 8 1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 8 1.2 Mục tiêu....................................................................................................... 8 1.3 Nội dung ...................................................................................................... 8 PHẦN II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 9 2.1 Sinh học của tôm càng xanh........................................................................ 9 2.1.1 Phân loại và hình thái ........................................................................... 9 2.1.2 Phân bố ............................................................................................... 10 2.1.3 Vòng đời tôm càng xanh .................................................................... 10 2.2 Tình hình sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới và Việt Nam......... 11 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới .... 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam..... 11 2.3 Một số bệnh hoại tử trên tôm càng xanh ................................................... 12 2.3.1 Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle NecrosisIMN) ............... 12 2.3.2 Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle DiseaseMCD)......... 12 2.3.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn.................................................................... 13 2.3.4 Bệnh phát sáng ................................................................................... 13 2.3.5 Bệnh lột xác dính vỏ........................................................................... 13 2.3.6 Bệnh do Protozoa ............................................................................... 13 2.3.7 Bệnh virus........................................................................................... 14 2.3.8 Bệnh trắng đuôi .................................................................................. 14 2.3.9 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm ............................................................ 16 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................ 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................... 18 3.1.1 Thời gian và địa điểm......................................................................... 18 3.1.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .......................................................... 18 3.1.3 Vật thí nghiệm .................................................................................... 18 3.1.4 Hóa chất.............................................................................................. 18 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 194 3.2.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu .................................................................. 19 3.2.2 Thực hiện thí nghiệm.......................................................................... 19 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 25 4.1 Kết quả soi tƣơi ......................................................................................... 25 4.2 Kết quả kính phết...................................................................................... 25 4.2.1 Kính phết nhuộm Gram...................................................................... 25 4.2.2 Kính phết nhuộm Giemsa................................................................... 28 4.3 Kết quả chạy RTPCR .......................................................................... 28 4.4 Kết quả Mô học ......................................................................................... 29 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................ 31 5.1 Kết luận...................................................................................................... 31 5.2 Đề xuất....................................................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 32 PHỤ LỤC ............................................................Error Bookmark not defined.
1 ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐINH CÔNG CHÍNH TÌM HIỂU SỰ XUẤT HIỆN MẦM BỆNH TRÊN TÔM CÀNG XANH GIỐNG (Macrobrachium rosenbergii) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 1 ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐINH CÔNG CHÍNH TÌM HIỂU SỰ XUẤT HIỆN MẦM BỆNH TRÊN TÔM CÀNG XANH GIỐNG (Macrobrachium rosenbergii) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs.TS ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012 1 LỜI CẢM TẠ Để thực hiện đề tài này tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy Cô trong khoa thủy sản trƣờng đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện và cung cấp kiến thức kinh nghiệm cho tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã hƣớng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi thực hiện đề tài này. Cô Trần Việt Tiên, Nguyễn Trọng Nghĩa, chị Trần Kim Trong, chị Lê Hoài Nhƣ Ngọc đã giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K35 đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận văn này. Và xin cảm ơn đến gia đình và ngƣời than đã tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình học tập Xin chân thành cảm ơn! 2 TÓM TẮT Đề tài đƣợc thực hiện nhằm tìm hiểu về sự xuất hiện mầm bệnh trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Phƣơng pháp kính phết đƣợc sử dụng để quan sát vi khuẩn và ký sinh trùng. Phƣơng pháp soi tƣơi đƣợc sử dụng để quan sát ngoại ký sinh. Phƣơng pháp mô bệnh học đƣợc sử dụng để phát hiện mầm bệnh ở mức tế bào và phƣơng pháp RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện hai loại vi-rút gây bệnh đục cơ là MrNV và XSV. Tổng cộng có 46 mẫu tôm giống đƣợc các trại giống từ các tỉnh khác nhau gửi xét nghiệm vào thời điểm từ tháng 5 và tháng 6 năm 2012. Kết quả soi tƣơi cho không phát hiện ký sinh trùng trên cơ thể tôm, có 19/46 mẫu bị nhiễm vi khuẩn khi quan sát kính phết nhuộm gram. Quan sát các tiêu bản nhuộm giemsa không phát hiện mẫu bị nhiễm. Kết quả xét nghiệm RT-PCR ghi nhận cả 46 mẫu đều âm tính với 2 loại virus gây bệnh đục cơ, tuy nhiên có 2 mẫu có dấu hiệu gan tụy bất thƣờng khi quan sát tiêu bản mô bệnh học. 3 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ 1 TÓM TẮT 1 MỤC LỤC 3 DANH SÁCH BẢNG 4 DANH SÁCH HÌNH 6 MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 7 PHẦN I GIỚI THIỆU 8 1.1 Đặt vấn đề 8 1.2 Mục tiêu 8 1.3 Nội dung 8 PHẦN II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 9 2.1 Sinh học của tôm càng xanh 9 2.1.1 Phân loại và hình thái 9 2.1.2 Phân bố 10 2.1.3 Vòng đời tôm càng xanh 10 2.2 Tình hình sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới và Việt Nam 11 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam. 11 2.3 Một số bệnh hoại tử trên tôm càng xanh 12 2.3.1 Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN) 12 2.3.2 Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle Disease-MCD) 12 2.3.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn 13 2.3.4 Bệnh phát sáng 13 2.3.5 Bệnh lột xác dính vỏ 13 2.3.6 Bệnh do Protozoa 13 2.3.7 Bệnh virus 14 2.3.8 Bệnh trắng đuôi 14 2.3.9 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm 16 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Thời gian và địa điểm 18 3.1.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 18 3.1.3 Vật thí nghiệm 18 3.1.4 Hóa chất 18 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 4 3.2.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu 19 3.2.2 Thực hiện thí nghiệm 19 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết quả soi tƣơi 25 4.2 Kết quả kính phết 25 4.2.1 Kính phết nhuộm Gram 25 4.2.2 Kính phết nhuộm Giemsa 28 4.3 Kết quả chạy RT-PCR 28 4.4 Kết quả Mô học 29 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined. 5 DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Quy trình nhuộm Gram 15 Bảng 3.2: Quy trình nhuộm Giemsa 15 Bảng 3.3: Hóa chất sử dụng trong quy trình sử lý mẫu 15 Bảng 3.4: Các hóa chất sử dụng trong quá trình nhuộm Haematoxyline và Eosin (H&E) 16 Bảng 3.5: Thành phần các chất phản ứng RT-PCR một bƣớc phát hiện đồng thời MrNV/XSV gồm: 18 6 DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Biểu đồ thể hiện số lƣợng trại giống và sản lƣợng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ năm 1999 – 2003 6 Hình 4.1: Mẫu kính phết LA 59 (100X) bị nhiễm vi khuẩn 19 Hình 4.2: Mẫu kính phết CT 78 (100X) bị nhiễm vi khuẩn 20 Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR phát hiện MrNV/XSV. M thang chuẩn; 1: đối chứng dƣơng; 2: đối chứng âm; 3,4, 5 đều âm tính 21 Hình 4.4 mẫu gan tụy CM 112 mẫu khỏe 22 Hình 4.5 Cơ quan gan tụy mẫu tôm ĐN 68 (10X) các ống gan tụy bị teo và không ghi nhận đƣợc không bào 22 Hình 4.6 Cơ quan gan tụy mẫu tôm CM 114 , các ống gan tụy bị teo và tế bào rơi vào lòng ống; A: cơ quan gan tụy ở 10X; B cơ quan gan tụy ở 40X 22 7 MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome DNA Deoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO Food and Agriculture Organization MrNV Macrobrachium rosenbergii nodavirus PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT – PCR Reverse Transcription Polymerase Reaction SDS - PAGE Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophores TCX Tôm Càng Xanh XSV Extra small virus 8 PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Năm 2011, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn xác định thủy sản vẫn là lĩnh vực mũi nhọn tập trung đầu tƣ và có thể tạo bƣớc đột phá trong giai đoạn 2011 – 2015. Theo đó ngành phấn đấu tổng sản lƣợng đạt từ 6,5 đến 7 triệu tấn, trong đó nuôi trồng thủy sản chiếm từ 65 – 70%, các đối tƣợng nuôi là cá tra, tôm và nhuyễn thể (tổng cục thủy sản 24/11/2011). Đồng Bằng Sông Cửu Long với diện tích gần 4 triệu ha, là vùng có tiềm năng lớn nhất Việt Nam về nuôi trồng thủy sản cả về nuôi nƣớc lợ ven biển và nuôi nƣớc ngọt (Lê Xuân Sinh, 2008). Tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản nƣớc ngọt ƣớc tính là 121.465 ha, trong đó TCX là một trong hai đối tƣợng nuôi chủ lực của vùng nƣớc ngọt. Theo viện kinh tế và quy hoạch thủy sản thuộc bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, năm 2011 sản lƣợng TCX cả nƣớc đạt 13000 tấn với diện tích nuôi 8.500 ha. Ở ĐBSCL thì tôm càng xanh phổ biến ở các tỉnh nhƣ An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bến Tre.Vĩnh Long và Trà Vinh. Do nƣớc ta có nguồn nƣớc thiên nhiên khá dồi dào, đa dạng nên tôm càng xanh không chỉ giới hạn ở vùng nƣớc ngọt mà nó đang tiến dần ra các vùng nuôi khác. Việc tăng diện tích nuôi tăng mật độ nhƣ thời gian qua dẫn đến con giống ngày càng tăng cả về sản lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng. Tuy nhiên cùng với sự mở rộng nghề nuôi tôm càng xanh thì vấn đề về dịch bệnh cũng xảy ra thƣờng xuyên hơn và đang là trở ngại chính của nghề nuôi tôm. Tỉ lệ và tần suất xuất hiện bệnh trong mỗi vụ nuôi ngày càng nhiều do mức độ thâm canh hóa ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng nƣớc cùng với việc quản lý ao nuôi không đúng cách đã tạo điều kiện cho sự lan truyền bùng phát của bệnh, với sự xuất hiện mầm bệnh khác nhau nên tôi thực hiện đề tài “Tìm hiểu sự xuất hiện mầm bệnh trên tôm càng xanh giống (Macrobrachium rosenbergii)” để xác định và tìm hiểu thêm về các bệnh trên tôm càng xanh. 1.2 Mục tiêu Tìm hiểu sự xuất hiện của một số mầm bệnh trên tôm càng xanh giống 1.3 Nội dung Soi tƣơi quan sát ngoại ký sinh. Kính phết gan tụy nhuộm Gram và Giemsa quan sát vi khuẩn và ký sinh trùng. Mô bệnh học quan sát các tổn thƣơng và dấu hiệu bất thƣờng ở gan tụy. RT – PCR phát hiện virus gây bệnh đục cơ MrNV và XSV [...]... của tôm chuyển hoá thành hai đôi càng, đôi càng thứ hai to dùng để bắt mồi và tự vệ Đặc điểm về kích cỡ, màu sắc, hình dạng và các gai trên đôi càng sẽ thay đổi theo từng giai đoạn thành thục của tôm, nhất là ở tôm đực Quá trình thay đổi đƣợc thể hiện qua các giai đoạn nhƣ: tôm nhỏ, tôm càng lửa nhạt, tôm càng lửa đậm, tôm càng lửa đậm chuyển tiếp càng xanh, tôm càng xanh nhạt, tôm càng xanh đậm và tôm. .. khuẩn này chƣa đƣợc xác định rõ Không phát hiện ký sinh trùng và vi khuẩn qua kính phết nhuộm giemsa Kết quả phân tích cho thấy cả 46 mẫu đều âm tính với MrNV/XSV Có 2 mẫu trên 46 mẫu tôm có biểu hiện bất thƣờng trong gan tụy qua phƣơng pháp mô bệnh học 5.2 Đề xuất − Tiếp tục nghiên cứu về sự xuất hiện mầm bệnh trên tôm càng xanh giống và nhanh chóng tìm ra mầm bệnh để đề phòng kịp thời − Cần nghiên cứu... sinh trên cơ thể tôm ấu trùng hoặc trên phần phụ của tôm lớn − Cường độ nhiễm nặng (+++): >100 tế bào của động vật đơn bào ký sinh trên cơ thể tôm ấu trùng hay trên một phần phụ của tôm lớn Có hiện tƣợng dạt bờ và chết rải rác ở đàn tôm − Cường độ nhiễm rất nặng (++++): Các tế bào của động vật đơn bào phủ kín bề mặt cơ thể tôm, mang tôm Có hiện tƣợng chết hang loạt ở ấu trùng tôm và chết rải rác ở tôm. .. gây bệnh trong động vật XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite – nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và Bonami, 2004) 2.3.9 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm Sự gia tăng diện tích nuôi, đa dạng hóa đối tƣợng nuôi và việc thâm canh hóa của nghề nuôi tôm sử dụng giống sinh sản nhân tạo ở mật độ cao, thức ăn công nghiệp, sự di nhập tôm giống và tôm bố mẹ,… đã dẫn đến sự xuất hiện và lây lan của nhiều bệnh. .. bệnh này ảnh hƣởng đến ấu trùng tôm càng xanh (giai đoạn IV – V) ở Tahiti dẫn đến tử vong 100% trong 48 giờ 2.3.4 Bệnh phát sáng Ấu trùng ở giai đoạn nhỏ mẫn cảm đối với bệnh do Vibrio harveyi gây ra Bệnh này phổ biến trong các trại giống đối với tôm càng xanh nƣớc ngọt và tôm biển Biểu hiện của bệnh này là sự phát sáng có thể quan sát dễ dàng vào ban đêm Ấu trùng nhiễm bệnh bị đóng rong, đục cơ và bơi... rạch, ao, hồ,… ở đó chúng sinh sống và lớn lên Tôm có thể di cƣ rất xa khoảng 200km tử bờ biển vào nội địa Khi trƣởng thành chúng lại di cƣ ra vùng nƣớc lợ để sinh sản và vòng đời lại tiếp tục (Nguyễn Thanh Phƣơng và ctv., 2003) 10 2.2 Tình hình sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới và Việt Nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới TCX là loài có giá trị kinh tế cao... tử cơ 2.3.8 Bệnh trắng đuôi Bệnh trắng đuôi (White tail disease) gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đàn ấu trùng Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi trồng thủy sản nhiều và nhiều bệnh mới sẽ xuất hiện Những báo cáo về bệnh trắng đuôi xuất hiện trong những bể ƣơng nuôi tôm càng xanh và những... (1879) (trích dẫn bởi Trần Thanh Phục, 2001) Hiện nay trên thế giới có 3 quy trình sản xuất giống tôm càng xanh đã đƣợc phổ biến là quy trình nƣớc trong hở (clear open water system), quy trình nƣớc trong kín (clear closed water system), và quy trình nƣớc xanh (green water system) (Nguyễn Việt Thắng, 1993) 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam TCX cũng đƣợc nghiên... 1982, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II) đã cho tôm càng xanh sinh sản nhân tạo thành công (Phạm Văn Tình, 2000) Từ 1987 – 1992, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu đã sản xuất tổng cộng 2,1 triệu postlarvae (Trần Thanh Phục, 2001) Nguyễn Việt Thắng (1993), đã khảo nghiệm một số quy trình sản xuất giống tôm càng xanh và đạt kết quả khả quan: quy... nuôi ấu trùng tôm theo mô hình nƣớc xanh cải tiến và đã triển khai ứng dụng tại một số tỉnh nhƣ Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, An Giang (Trần Ngọc Hải, 2000) 2.3 Một số bệnh hoại tử trên tôm càng xanh 2.3.1 Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN) Bệnh hoại tử cơ đó là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt tôm ấu trùng trong trại giống Nash và cộng sự (1987) đã báo cáo rằng bệnh hoại tử cơ . điều kiện cho sự lan truyền bùng phát của bệnh, với sự xuất hiện mầm bệnh khác nhau nên tôi thực hiện đề tài Tìm hiểu sự xuất hiện mầm bệnh trên tôm càng xanh giống (Macrobrachium rosenbergii) . (Macrobrachium rosenbergii) để xác định và tìm hiểu thêm về các bệnh trên tôm càng xanh. 1.2 Mục tiêu Tìm hiểu sự xuất hiện của một số mầm bệnh trên tôm càng xanh giống 1.3 Nội dung Soi tƣơi quan. nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam. 11 2.3 Một số bệnh hoại tử trên tôm càng xanh 12 2.3.1 Bệnh hoại tử