MỤC LỤCI.Đặt vấn đềII.Giới thiệu lịch sử của phương pháp MicroarrayIII.Khái niệm về MicroarrayIV.Cấu tạo và phân loại MicroarrayV.Nguyên lýVI.Qúa trình thực hiện DNA MicroarrayVII.Cách tiến hànhVIII.Ứng dụng IX.Kết luậnX.Câu hỏi trắc nghiệmXI.Tài liệu tham khảoI.Đặt vấn đềTrừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sự biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả..Trong quá khứ, các nhà khoa học chỉ có thể tiến hành các phân tích di truyền của một vài gen cùng một lúc. Với sự phát triển của kỹ thuật microarrays các nhà khoa học giờ đây có thể kiểm tra hàng ngàn gen hoạt động như thế nào, ở bất kỳ thời điểm nào.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người.II.Giới thiệu lịch sử của phương pháp MicroarrayCòn quá sớm để nói về lịch sử của DNA microarray vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân
Kỹ thuật miccroarray TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG Báo cáo seminar: MICROARAYS Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Dung Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Phùng Văn Dũng 61303045 2.Nguyễn Võ Kỳ Duyên 61303052 3. Cao Chí Thủy Tiên 61303328 1 Kỹ thuật miccroarray MỤC LỤC I. Đặt vấn đề II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray III. Khái niệm về Microarray IV. Cấu tạo và phân loại Microarray V. Nguyên lý VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray VII. Cách tiến hành VIII. Ứng dụng IX. Kết luận X. Câu hỏi trắc nghiệm XI. Tài liệu tham khảo I. Đặt vấn đề 2 Kỹ thuật miccroarray Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sự biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả Trong quá khứ, các nhà khoa học chỉ có thể tiến hành các phân tích di truyền của một vài gen cùng một lúc. Với sự phát triển của kỹ thuật microarrays các nhà khoa học giờ đây có thể kiểm tra hàng ngàn gen hoạt động như thế nào, ở bất kỳ thời điểm nào. Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA microarray vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. 3 Kỹ thuật miccroarray Điều này gợi ra cách phân tích mối liên hệ trình tự của axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng. Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH. Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu. Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể. Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu. 4 Kỹ thuật miccroarray Hình 1: Quá trình phát triển của kĩ thuật di truyên Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay. III. Khái niệm về Microarray Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm đơn giản và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A. Fodor phát minh. Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở Mỹ và thế giới. Protein microarray mới chỉ bắt đầu được để ý trong khoảng vài năm trở lại đây và chưa phổ biến như DNA microarray. 5 Kỹ thuật miccroarray Mỗi điểm trên một microarray chứa nhiều sợi giống hệt nhau của DNA.Trình tự DNA trên mỗi điểm là duy nhất.Hàng ngàn điểm được dàn trận trong hàng và cột trật tự trên một bề mặt rắn (thường là thủy tinh). Vị trí chính xác và trình tự của từng vị trí được ghi lại trong một cơ sở dữ liệu máy tín. Mỗi vị trí đại diện cho một gen. IV. Cấu tạo và phân loại Microarray 1. Cấu tạo DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicone. Trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Bằng kĩ thuật tự động tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự. Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng, có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50- 120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) các chấm trên microarray thường có đường kính 200 μm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner). Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 μm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 μm. 6 Kỹ thuật miccroarray Hình 2: kích thước cDNA 2. Phân loại a. Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao,vừa) b. Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array…. V. Nguyên lý Dựa trên cơ sở kĩ thuật lai axit nucleic. Trong đó một mảnh DNA đã biết được sử dụng làm mẫu dò để tìm kiếm trình tụ bổ sung của nó. Mẫu dò được cố định trên một giá thể rắn (thủy tinh, nylon, silicone). Một hỗn hợp lỏng chứa các DNA và RNA cần dò tìm được cho chạy qua giá thể rắn. Ở điều kiện lý tưởng các axit nucleic có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp chính xác với nhau. Trước đó mẫu DNA hay RNA đã được đánh dấu bằng : đồng vị phóng xạ , chất phát huỳnh quang . . .Khi quan sát dưới máy dò tìm đặc hiệu dễ dàng nhận diện cặp mẫu dò nào đã gắn với mẫu DNA hay RNA nào. 7 Kỹ thuật miccroarray VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray Hình 3: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray Qúa trình thực hiện DNA microarray gồm hai bước chính : 1. Chế tạo mảng Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao . Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon 8 Kỹ thuật miccroarray , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò . Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100- 3000 bp) . Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: cố định (cDNA) Hình 4: Mẫu dò cDNA 9 Kỹ thuật miccroarray tổng hợp in situ (oligonucleotide). Hinh 5: Mãu dò tổng hợp insitu Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (μCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (μFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (μWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ. • In kim (Contact-tip deposition printing):Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất ,Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc . 10 . thuật miccroarray TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG Báo cáo seminar: MICROARAYS Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Dung Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Phùng Văn Dũng 61303045 2.Nguyễn