Phuong phap phan tich Aflatoxin
LOI NOI DAU
Gần đây tinh trang mat an toàn thực phẩm được đề cập đến như một mối nguy hiểm đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của cộng đồng Các thông tin về nạn ngộ độc hàng loạt xảy ra ở nhiều nơi Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc đó là do Aflatocxin
Bên cạnh Ochratoxin thì Aflatoxin cũng là một
mycotoxin được tiết ra từ nắm Aspergillus và A.parasiyicus Trong thực tế, ở điều kiện thời tiết nóng và âm của Việt Nam thì các chủng nắm này sẽ phát triển mạnh ở các loại thực
phẩm nông sản như ngô, lạc, đậu , thức ăn gia súc, gia cầm !
fw TẢA nỞi -1-
Trang 2MUC LUC 1.Téng quan IiRe)i ai 3 1.2.Nguồn gốc .4 1.3.Đặc điểm a) 1.4.Tác hại trong thực phẩm
1.5.Tác hại đối với cơ thể
1.6.Liều lượng cho phép ¿- 22+ 22++++2E+++EEEEEESEEErreErkrrrrrrrrrrrkr 2.Phân tích 2.1.Loại trừ aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh hoc 2.2.Nguyên lý phương pháp 2.3.Dụng cụ 2.4.Hóa chất, thuốc thử 2.5.Chuẩn bị 2.6.Định lượng 2.6.1.Chuẩn bị mẫu 2.6.2.Chiết suất 2.6.3.Làm sạch mẫu bằng cột sắc kí 2.6.4.Lớp sắc kí mỏng một chiều 2.6.5.Thử nghiệm sự khẳng định sự có mặt của aflatoxin .14 2.6.6.Đánh giá kết quả 2.7.Định lượng 2.7.1.Bằng mắt
Trang 4Phuong phap phan tich Aflatoxin
1.2.Nguén gốc 9
Trong số 200.000 loại nắm mốc khác nhau, khoảng 50 loài là có hại cho người
và động vật Các loại này có thể chia thành hai nhóm: Nhóm gây bệnh dịch và nhóm
gây ngộ độc
Đã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà
khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả các
nước tiên tiễn có đời sống cao Tuy nhiên trong những năm 1920-1930 ở Anh và Liên
Xô đã thấy xuất hiện nhiều trường hợp ngộ
độc Alcaloit ở người, và gà mà chất này có
trong lúa mạch, lúa mì Năm 1924 Shofield
và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nắm mốc gây dịch bệnh cho gia súc Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra
bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu
(Aleusemic) & một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc Đến năm 1960 nhân một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần
đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành
nghiên cứu và phát hiện ra độc tố Anatoxin, một độc tố được tiết ra từ nắm
Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus Năm 1961, ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm ante trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan
Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có Aflatoxin Đồng thời nhóm tác giả
này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình)
cũng thấy có 30-50% số mẫu có độc tô Aflatoxin
Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố về vấn đề này
Theo kết quả của Viện VSDT đã nghiên cứu trên 29.381 mẫu lương thực thực phẩm
thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao nhất (5,2 - 80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau Trong số đó có II
chủng có khả năng sinh độc tố Năm 1984, theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc gia đã nghiên cứu trên 200 mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nắm Aspergillus
Flavus, một loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin Bảng : Các sản phẩm có thể nhiễm Aflatoxin
Các hạt ngũ cốc Ngô, thóc gạo, lúa mì, bo bo
Hạt có dầu Lạc, bong, dừa, đậu tương, hướng dương Củ San, khoai tây
Sữa Sita tuoi, pho mat
Thuy san Cá, tôm
Sản phẩm lên men Bia, nước giải khát, rượu vang
gw t^ sởi A
Trang 51.3.Đặc diém :
Điều đầu tiên chúng ta can biét aflatoxin 1A tinh thé trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200C, phải đun 30 phút mới mắt tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nắm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp bao gồm 6 loại
(BI, B2, GI, G2, MI và M3) Aflatoxin BI là loại cực độc Một lượng 0,03 ppm
aflatoxin BI từ khô lạc gây ra u gan
Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nắm Aspergillus va A.parasiyicus,
cdc ching nam nay phat trién mạnh ở các loại thực phâm nông sản, thức ăn gia súc,
gia câm như ngô, lạc, đậu trong các điêu kiện thuận lợi nóng và âm, nhât là điêu
kiện thời tiết ở Việt Nam Tác hại của độc tô vi nam nay doi voi dong vat da được biệt
đến từ lâu, và đã được chứng minh có thê gây ung thư gan trên thực nghiệm
Hình : Nắm Aspergillus
Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, nhiều khuẩn ty phát
triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biệt có vách ngăn ngang có một lỗ nhỏ để cho tế bào chất thông thương qua lại giữa hai tế bào; Khuẩn ty đứt
thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới Có 2
hình thức sinh sản:
©— Sinh sản vơ tính: Khuẩn ty hình thành một cọng mang bào tử (conidiophore) và bào tử đính (conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất
phát từ tế bào chân (foot cell) Tui hay bong (vesicle) 1a tế bào đa nhân và phát
triển bề mặt gắn liền với thể bình (phialide hay sterigmata) Thể bình với bậc 1 hay bậc 2, mỗi thể bình là cấu trúc đa nhân và trên đầu thể bình tạo thành một
Suu UM adi -5-
Trang 6chuỗi bào tử đính, những bào tử non ở trong và càng xa càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng thích vào không khí và nẫy mầm
©_ Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính chỉ được phát hiện ở một vài loài, chúng thành lập những bộ phận sinh dục là túi đực (hùng khí antheridia) và túi noãn (ascogonia)
*_ Noãn phòng: Phát triển từ khuẩn ty ở thể có vách ngăn đồng thời tách ra một bộ phận gọi là cuống túi noãn (archicarp), ống noãn bào (trichogyne)
kéo dài và tạo thành noãn phòng đề kết hợp với giao tử, tất cả tế bào của
cuống túi noãn là đa nhân và cuống lại giống như đồng tiền hay vòng xoắn Y Hing co: Hing co phát triển trong nhánh chung với túi noãn, sau đó nhánh này phát triển thành giao tử (pollinodium), nhành này tiến tới ống noãn bào
và cắt phần ra gọi là hùng cơ, phần còn lại gọi là cuống hay thân (stalk),
hùng cơ cũng là những tế bào đa nhân
*_ Phối hợp tế bào chất (plasmogamy): Đầu của hùng cơ tiếp xúc với ơng
nỗn bào và vách tế bào của hai đầu này tan ra để hai tế bào chất này trộn với nhau
*⁄_ Phát triển bao nang : Khi bắt đầu hợp nhân, nhân đơn bào trong túi nỗn sẽ
nhân đơi, mỗi tế bào nhị bội tạo ra sợi noãn (ascogenous hyphae), hai nhân của mỗi soi noan tiếp tục phân chia và tạo thành sợi noãn đa nhân, có vách ngăn ngang, cuối cùng tế bào cuống lại thành tế bào đơn nhân, như vậy trong mỗi tế bào có vách ngăn của sợi noãn có hai nhân và sẽ phát triển thành tế bào nang sau Hai nhân trong nang sẽ tạo thành nhân tiếp hợp nhị và một gồm một bội; Nhân nhị bội trong nang giảm phân thành 4 nhân đơn bội và mỗi nhân đơn bội sẽ đẳng phân để cho 8 nhân đơn bội, mỗi nhân sẽ hình thành màng bao và phát triển thành một nang bào tử.Như vậy nang và bào tử nang phát triển từ sợi noãn và nhiều sợi noãn phát triển tạo ra một bao nang vách dầy chứa nhiều nang bên trong và nhiều bao nang nằm trong
một túi lớn có vách gồm nhiều lớp tế bào gọi là túi bào tử (peridium), thể
quả của bao nang gọi là Tử nang thé (Cleistothecium) Nang chứa 8 bào tử nang và khi bào tử nang trưởng thành thì vỏ nang vở ra và bào tử nang nằm trong Tử nang thể và khi nào Tử nang thể vở ra thì bào tử phóng thích ra bên ngoài
v Bao tir nang : vỏ bào từ Mỗi bào tử có đường kính khoảng 5_ một đai mỏng bên ngoài và mỗi bào tử nang nây mầm cho một khuẩn ty mới 1.4.Tác hại trong thực phẩm :
Đối với thức ăn chăn nuôi nếu điều kiện chế biến bảo quản không tốt gây ra những thiệt hại cho ngành chăn nuôi, theo FAO có khoảng 25% lượng ngũ cốc cung
gw TẢAA nỞi -6-
Trang 7cấp thé giới có chứa độc tố từ nắm, ở châu Á, tỷ lệ này còn cao hơn do các yếu tô về
khí hậu và phương thức thu hoạch, chế biến, bảo quản kém
Thông thường trong những điều kiện phù hợp Aspergillus sẽ sinh ra Aflatoxin song không đủ lượng để gây ngộ độc nặng, nó làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng , vật nuôi tăng trưởng chậm, còi cọc, làm tăng tiêu tốn thức ăn, khả năng miễn
dịch giảm, vật nuôi để mắc bệnh Độc tố gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm
tăng tỷ lệ chết ở thú non, suy giảm năng suất, sản lượng trứng
Và nếu con người ăn thịt có chứa Aflatoxin thì có thể bị ung thư gan
Độc tính trên động vật thí nghiệm : Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các
triệu chứng cấp tính và mạn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của
các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy
máu ở gan và viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém
ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến
1.5.Tác hại đối với cơ thể :
_ Bệnh gây ra do độc tố nam trên người hay gặp ở các đối tượng có đời sống thâp, thức ăn cơ bản là ngũ côc và các thức ăn thực vật giàu chất béo không được xử lý bảo quản tôt Mặt khác điều kiện khí hậu nóng âm, tình trạng vệ sinh kém cũng là yêu tô thuận lợi cho nâm mồc phát triên sinh độc tô và gây bệnh
Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thu gan ở người (cũng như các động vật nhạy cảm) và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai Điều cần ghi nhận là tác động bệnh lý của Aflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác như : HBV, hoặc những độc tô di truyền
Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thé hiện một nhiễm độc cấp tính
Thường là do Aflatoxin BI, B2, GI, G2 trong đó độc tô có độc tính mạnh nhât là BI,
sau đó đến GI, rồi đến B2, và sau cùng là G2 Bên cạnh gan, các cơ quan khác như:
phôi, thận, mạc treo, túi mật cũng bị tôn thương ít nhiêu
Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn
e_ Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng
hợp AND và ARN ©_ Ngừng tổng hợp ADN
e _ Giảm tông hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin
s_ Biến đổi hình thái nhân tế bào
¢ Giam téng hợp protein
Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan
Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật
và con người Độc tính nguy hiêm nhât là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên
S#ƯU TẢAA nỞi -7-
Trang 8phát Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nam mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát
Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin Trẻ đã ăn mỗi ngày 70- 100g bột lạc bị nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-Ippm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rồi loạn chức năng gan Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ
Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nắm Anatoxin gây ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch Sau này, các công trình nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nắm fusarium Về lâm sàng bệnh thường
tiến triển theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng, họng sau đó lan xuống dạ dày, ruột Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau bụng, nôn mửa
- Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết va co quan tao mau, kéo dài 15-30 ngày Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu máu rõ
rét
- Giai doan 3: Bach cau giam nhiều, bệnh nhân có sốt nhẹ, xuất huyết dưới da, niêm mạc Sau đó là viêm loét da cùng với những tai biến nhiễm khuẩn khác Tỉ lệ tử vong cao tới 60-80%
1.6.Chỉ tiêu cho pháp :
Ở Pháp quy định mức nhiễm Aflatoxin B1 trong sữa nước dùng cho trẻ em dưới 3 tuổi là ( 0.03ng/kg (ppb)); sữa nước thông dụng < 0.05ng/kg
Vào năm 1997, Uỷ ban các chuyên gia về phụ gia thực phẩm của FAO/WHO (JECFA) da đánh giá là việc giảm mức Aflatoxin trong tiêu chuẩn từ 20 ppb (phan ty)
xuống 10 ppb sẽ giảm được 2 người chết do ung thư trong một năm trên một tỷ người Năm 1997, EC đề nghị hài hoà mức Aflatoxin tối đa có thể chấp nhận được trong thực phẩm Tiêu chuẩn mới này thay đổi trong khoảng từ 4 ppb cho ngũ cốc, các hạt và quả
khô ăn ngay, đến 10 ppb cho các hạt cần chế biến tiếp Đề nghị của EC làm các nhà
xuất khẩu lo ngại về việc tiêu chuẩn mới có thể gây hạn chế thương mại Một số nước
xuất khẩu thực sự lo sợ bị tổn thất trong xuất khẩu của họ do tiêu chuẩn mới quá khắt
khe Các nước như Bôlivia, Peru, Ấn Độ, Acgentina, Canada, Urugoay, Uc va Pakistan đã yêu cầu EC đưa ra các đánh giá mối nguy hại cụ thé đối với tiêu chuẩn
mới này Kết quả của việc tham vấn với các đối tác thương mại về các quan ngại này
#ƯU UM nỞi -8-
Trang 9la EC đã nới lỏng tiêu chuẩn dự kiến về Aflatoxin trong ngũ cốc, quả sấy khô và hat các loại
Tiêu chuẩn về Aflatoxin trong lạc đề chế biến tiếp được quy định ở mức 15 ppb
(8 ppb cho B1), trong các loại hạt khác và quả khô đề chế biến tiếp là 10 ppb (5 ppb
cho BỊ) Đối với ngũ cốc, quả khô và các loại hạt dùng để ăn ngay cho người, tiêu chuẩn nghiêm ngặt hơn và quy định ở mức 4 ppb (2 ppb cho BI) Trong khi đó, các tiêu chuẩn về Aflatoxin của Codex được cho là thấp hơn nhiều so với các tiêu chuẩn của EC Khi Codex đưa ra tiêu chuẩn riêng cho nhóm BI của Aflatoxin thì người ta cho rằng Aflatoxin B1 chiếm đến 50-70% hoặc vào khoảng 7,5-10,5 ppb của tổng mức Aflatoxin 15 ppb Tiêu chuẩn chung của Codex, do vậy, là vào khoảng 9 ppb
Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ qui định hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn gia súc như sau:
e_ Bò giống, heo giống, gà trưởng thành không quá 100ppb (phần tỷ)
© - Heo thịt giai đoạn vỗ béo: 200ppb e Bo thit: 300ppb
e BO sira va gia stic non: 20ppb
2.PHAN TICH :
Điều kiện tiến hành phân tích : ở phòng mát, tránh ánh nắng
Có nhiều phương pháp phát hiện aflatoxin, các phương pháp lý hoá học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang của bước sóng tử ngoại của aflatoxin Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc kí trên giấy với các hệ dung môi butanol-nước-acetic (20:1:19) hay chloroform — methanol (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung môi
chloroform — methanol (99:1 hay 93: 7)] hoac chloroform —aceton (90;10 hay 85:15)
cũng có thé định lương alatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với các dung dịch rửa là clorofom và hỗn hợp 5% methanol-cloroform Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện và định lượng aflatoxin với độ nhay cao là sử dụng HPLC với dung môi tách là acetonitril Bên cạnh đó, các phương pháp sinh học cũng có khả năng phát hiện aflatoxin
2.1 Loại trừ Aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh học (ở đậu phông)
Sử dụng dòng Aspetggillus flavus không gây độc để làm mắt tác dụng các dòng
sản ra độc tô trong môi trường bằng cách “loại trừ mang tính cạnh tranh”
Cho đến nay các công trình nghiên cứu đã xác định được các đặc trưng của những dòng không gây độc và đã đạt được những thành công nhất định ở Mỹ và Australia Tuy nhiên còn phải tiếp tục thử nghiệm và đánh giá hiện trường ở Australia, khảo sát việc áp dụng qui mô thương mại, thảo qui trình phổ biến và qui mô ứng dụng Phải tiến hành chứng minh qui mô độ tin cậy, tính hiệu quả trước và sau thu
Suu 14M sỞi -9-
Trang 10hoạch, tính an toàn của phương pháp này và tiếp tục nghiên cứu về sự sống sót của
dòng đối thủ cạnh tranh trong đất và tính ổn định quá trình không sản sinh ra độc tó Ưu điểm của biện pháp phòng chống sinh học là làm giảm thiểu nhiều loạn hệ
sinh thái, sự ủng hộ của người tiêu dùng, không dùng công nghệ gen hoặc vi phạm an toàn thực phẩm và có khả năng sẵn sàng chuyển giao công nghệ cho các nước khác
Nhược điểm của phương pháp này là cần những hệ thống thí nghiệm aflatoxin rộng rãi và quản lý sản xuất nông nghiệp và chỉ có thê giảm thiểu aflatoxin chứ khơng
loại trừ hồn toàn Các van dé nguy cơ thất bại và tính hiệu quả đối với nhiễm sau thu
hoạch cũng được đặt ra
2.2.Nguyên lý phương pháp sử dụng dụng cụ:
Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc Dịch chiết được lọc và
một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen Làm bay hơi dung dịch rửa giải và
hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen — axetonitril Sau đó chấm một phần xác
định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu
phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang
Đối tượng áp dụng là aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dau
2.3.Dung cu: e_ Máy xay nghiền mẫu e_ Máy lắc hoặc máy khuấy từ e Can phan tích e Máy cất quay chân không e_ Bếp cách thuỷ ¢ Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm e Quang phổ kế UV-VIS © Máy đo mật độ huỳnh quang e_ Các trang bị của sắc ký lớp mỏng
Trang 11Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác e Acetone e Clorofoc e n-Hexan e Ete etylic (dang khan) © Metanol e Axetonitril e Toluen
e Natri sunfat (dang khan) © Celite 545, dat diatomit
e Acid sunfuric 50% (v/v) e Acid trifluoraxectic e Khinito
© Béng hut nước (được loại béo bằng clorofoc) hoặc bông thuỷ tỉnh e Các hệ dung môi khai triển sắc ký :
- _ Clorofoc : axeton =9:l (v/v)
- Ete étylic : metanol = nude: 94:4, 5:1,5:1 (v/v/v/y)
- Clorofoc : axeton : isopropanol : nude = 88:12:1, 5:1 (v/v/v/v) - Toluen : etyl axetat : axit focmic = 6:3:1 (v/v/v)
2.5.Chuẩn bị :
Silicagel G — 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 , 0,2 mm Hoạt hoá bằng
cách sấy khô ở 105°C trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ Iml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lăc đên khi trộn hoàn toàn đêu, bao quản 15 giờ trong bình kín
Chuẩn bị dung dich aflatoxin chuẩn (điều kiện tiền hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng)
Dung dich aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A):
Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen — axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 mg/ml)
Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dich B):
Cho vào một bình định mức 10ml lần luot 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1;
0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (tir dung dich A 6 trén), dinh mite đến 10ml
bằng hỗn hợp toluen — axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dich 12 0,5 mg/ml déi với
BI, GI, và 0,1 mg/ml đối với B2, G2
Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng
quang phô hâp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kêt quả theo công thức:
$ƯU TẢA sỞi -11-
Trang 121000.m.A e m - Khối lượng phan tir Aflatoxin A — Mật độ quang ở bước sóng hap thụ
e - Độ hấp thụ phân tử của Aflatoxin
Afi Dung môi 1
atoxin | m benzen — axetonitril (v/v) max (nm) © Bl 312 98: 2 350 9800 B2 314 98: 2 350 20900 Gl 28 98: 2 350 7100 G2 30 98: 2 350 8200 2.6.Dinh tinh : 2.6.1.Chuẩn bị mẫu :
Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm
Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiet voi dung môi ete dâu hoả (độ sôi 40 - 60°C) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiên mâu
2.6.2 Chiết suất:
Cân 50g mẫu đã nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml
Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt
Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rôi lọc qua giây lọc gap cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đâu, sau đó lây 50ml dịch lọc tiêp theo (tương đương 10g mâu thử)
Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phéu Bucher có chứa 1 lớp
celite 545 dày 5mm trên giây lọc và lọc hút chân không 2.6.3 Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký:
Chuẩn bị cột sac ky:
Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10g silicagel dùng cho sắc ký cột (3 - 15), vira cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lăng đêu, dùng đũa thuỷ tính khuây nhẹ đê tránh bọt khí Mở
Suu 14M sỞi -12-
Trang 13khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết
clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel
Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên
Trộn 50ml dịch lọc trên (5 - 2) với 150m] n — hexan, đỗ cẩn thận vào cột sắc ký
đã chuẩn bị như trên Loại bỏ dung dịch chảy ra Cho tiép 150ml ete étylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 —
12ml /phút
Dung dịch rưả giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol — clorofoc (3 :
97) Lay toàn bộ dich chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết Lưu lượng dòng chảy như trên Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay | chan khong
ở nhiệt độ thấp hon 50° C cho đến khi cdn khoang 2 — 3 ml Chuyển sang ông nghiệm
10ml], tráng rửa bình cầu bằng clorofoc va lam bay hoi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 50°C, tốt nhất dưới luồng khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm
là mẫu phân tích Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng
2.6.4 Sắc ký lớp mỏng một chiều:
Chuẩn bị:
„ - Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen — axetonitril (98: 2) và lây dịch này đê châm lên bản sắc ký
- Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tâm sắc ký với chiêu rộng 0,5cm Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quan hay micropipet cham cac vét dung dich chuan aflatoxin va dung dich mau thir như sau:
e Lấy 2; 5;10; 20 mI dung dịch chuẩn B ( chuẩn bị ở mục 2.4)
e_ Lấy 10 ml dịch chiết với 10 ml dung dich chuẩn B (chuẩn bị ở mục 2.4) ©- Lấy 10,20 ml dịch chiết
- Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin BI, B2, G1, G2 chuẩn có thể
được chấm chồng lên nhau
Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc — axeton (9: 1) Sau
khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để
bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm
Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây
Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết
aflatoxin chuẩn
Rf cua cdc vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - acetone (9-1) có trị số trung bình như sau:
- Aflatoxin B1 : 0,72
guu AM sỞi -13-
Trang 14- Aflatoxin B2 : 0,67 - Aflatoxin G1 : 0,59 - Aflatoxin G2 : 0,54
2.6.5 Thit nghiém khang dinh sw cé mat cia aflatoxin:
Phun dung dich axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các
vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng đưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm
Rót dung dịch Iod 5 — 10% trong ete lên một tắm thuỷ tỉnh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, dé cho ete bay hoi hết còn lại một lớp iốt mỏng Đặt úp tắm thuỷ tỉnh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 — 30 giây Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin
Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở
giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thử và dung dịch aflatoxin chuẩn như sau:
Phân 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau :
¢ 10 ml dung dich aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4) e 10 ml dịch chiết
¢ 10 ml dịch chiết với10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4) e 10 ml dung dich aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)
Phân 2: Bên phdi,cham 4 vết như sau
¢ 10 ml dung dich aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4) ¢ 10 ml dịch chiết
¢ 10 ml dich chiết với 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)
¢ 10 ml dung dich aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)
Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết Nhỏ lên 4 vết chấm ở ‘phan 1 bên trái, mỗi vết một giot axit trifluoraxetic Che phan 1 (bên trái) bằng một tắm thuỷ tỉnh khác, phun lên phan 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v) Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển
Dung môi khai triển : Nước : metanol : ete etylic = 1 : 3 : 96 (v/v)
Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh
ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm
2.6.6 Đánh giá kết quả:
Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dich aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh
Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và
của vết dịch chiết (nếu có)sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang xanh
chuyển sang màu vàng
Suu UM bỞi “14-
Trang 152.7.Dinh lượng : 2.7.1 Bang mat:
Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh
quang của vêt dịch chiêt với mật độ huỳnh quang của vêt dung dịch chuân
Vết huỳnh quang của vết cham dung dich aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch
chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết và phải trùng nhau Nếu mật độ huỳnh quang của vêt 10m] dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vêt
20ml dung dịch chuân thì phải pha loãng dịch chiêt và tiên hành làm sắc ký lớp mỏng lại Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng mierogam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức: SxYxV — WxX
S —Néng d6 aflatoxin của dung dịch chuẩn (mg/ml) ( Dung dich B )
V ~ Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có (ml) W - Khối lượng của mẫu thử, (tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiền hành làm sạch qua cột) (g)
X - Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuan cham trén ban mong (ml)
Y — Thé tich dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch
chiêt châm trên bản mỏng (ml) 2.7.2 BẰng máy đo mật độ huỳnh quang :
Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm Định lượng - aflatoxin trên các châm của dịch chiêt băng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vêt dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn
Hàm lượng aflatoxin (C), tính bang microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau:
C= AnxSxYxV A:xWxX
Am - mật độ huỳnh quang của vết mẫu
A, - mật độ huỳnh quang của vết chuẩn
X - Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng (m]) Y ~ Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng (m]) S ~ Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn,(ng)
'V~ Thẻ tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, (ml) W - Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thê tích dịch chiết khi tiến hành
làm sạch qua cột,(8)
$ƯU TẢA sỞi -15-
Trang 162.8 Độ nhậy của phương pháp : 5 mg/kg (Š ppm)
Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 + 5%
Sai số trung bình của phương pháp : + 10%
3.ĐÈ XUẤT GIẢI PHÁP :
3.1.Biện pháp phòng chống :
Hiện nay thuốc chữa bệnh đặc hiệu không có, vì vậy biện | phap phong bénh 1a quan trọng Aflatoxin là một độc tố khá bền vững với nhiệt Vì vậy biện pháp đun sôi thông thường không có tác dụng đối với độc tố Để đề phòng ngộ độc, biện pháp áp dụng là vân đề bảo quản tốt các loại lương thực thực phẩm, trong đó chủ yếu là thực
phẩm thực vật
- Với lương thực như gạo, ngô, mì: Yêu cầu bảo quản là giữ khơ, thống mát để
không bị nhiễm mốc
- - Với những thực phẩm thực vật khô như lạc, vừng, cà phê là những thực phâm dê hút âm và dê mộc Muôn bảo quản tôt cân được phơi khô, giữ nguyên vỏ, chứa trong các dụng cụ sạch, kín nếu đề lâu, thỉnh thoảng phải đem phơi khô lại Yêu cầu độ ẩm của hạt là dưới 15%
- Với nước chấm như xì dầu, tương: Những thông báo kết quả đầu tiên ở nước
ta cho thấy độ nhiễm Aflatoxin trong nước chấm là đáng lo ngại Vì vậy việc kiểm tra
vệ sinh các xí nghiệp sản xuất nước chấm và các cửa hàng mua bán là cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên
3.2.Hạn ché sw nhiém aflatoxin :
Biện pháp hạn chế hoặc giảm hàm lượng aflatoxin cho nông sản bảo quản được áp dụng như xử lý nhiệt với mudi amoni, monomethylamin, natri hydroxyt, natri
hypoclorit, HạOs
Nghiên cứu chứng minh rằng sử dụng khí quyền biến đổi có khả năng kiểm soát được hàm lượng aflotoxin: CO; tăng từ 0,5% (không kh) tới 100%, Oxy giảm từ
5% xuống 1% tạo thanh aflttoxin Ở 15°C rõ hơn ở 30°C Việc giảm aw từ 0,99 tới 0,858 cũng làm giảm sự tổng hợp aflatoxin
Các biện pháp kiểm soát sinh học aflatoxin cũng rất hứa hẹn, bao gồm từ việc tạo giống cây trồng, vật nuôi kháng nắm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và khang nam trén đồng ruộng, và các biện pháp công nghệ gen nhằm vô hoạt gen sinh độc tố ở nắm
mốc
mốc cạnh tranh với nấm mốc sinh aflatixin B1 bằng cách loại bổ gen sinh độc tố của
các chủng gốc của chúng trở lại ỗ sinh thái cạnh tranh với các chủng nắm hoang dại
sinh độc tố, tạo vật nuôi, cây trồng với công nghệ tái tổ hợp ADNcó nắm gen kháng
nắm
Aflatoxin BI trong thực phẩm và một số thức ăn gia súc được quy định ở mức 20 ppb Aflatoxin MI trong sữa quy định dưới 0,5 ppb Theo đánh giá mới đây, 77
nước trên thế giới có tiêu chuẩn về mycotoxin, trong đó, hầu hết các quy định này
dành cho aflatoxin
#ƯU UM 5d: -16-
Trang 173.3.Kiểm tra :
Kiểm tra vệ sinh môi trường (chủ yếu là không khƒ) Kiểm tra vệ sinh nước chấm
Ngoài các chỉ tiêu vệ sinh đã được qui định cho một mẫu nước chấm và một
mẫu không khí, còn phải chú ý phát hiện sự có mặt của các chủng nắm sinh độc tố như Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus
Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng dm, ẩm độ trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khơ ráo thống mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thức ăn chăn nuôi
Chăn nuôi khi dự trử thức ăn cho chăn nuôi cần để nơi khơ ráo, thống mát
khơng đẻ trực tiếp trên nền mà kê cao cách mặt nền 10 -20cm , giửa các khối thức ăn có khoảng cách tạo sự lưu thông khí hạn chế độ âm, tránh nắm mốc
gây phát sinh độc tố trong thức ăn
$ƯU TẢA sỞi -17-
Trang 18Tài liệu tham khảo