Bạch đàn là cây có vai trò kinh tế rất lớn, nhưng diện tích trồng bạch đàn bị giới hạn bởi điều kiện nhiệt độ thấp. Bạch đàn là cây có lá thường xanh và không có ngủ đông nên là đối tượng tốt để nghiên cứu đáp ứng với lạnh. Trong công trình này chúng tôi đã làm sáng tỏ được ba cơ chế đáp ứng với nhiệt độ thấp của bạch đàn ở mức phân tử. Đồng thời chúng tôi đã xác định và phân tích được toàn bộ 17 gen DREB1CBF, tác nhân điều hòa phiên mã giữ vai trò trung tâm trong đáp ứng với nhiệt độ thấp, trong hệ gen của cây bạch đàn. Bằng cách tiếp cận chuyển gen, chúng tôi đã chứng minh được các DREB1CBF có vai trò nâng cao tính chịu lạnh của cây bạch đàn thông qua việc điều hòa các gen tham gia trong các cơ chế chịu lạnh và trong sự biến đổi hình thái của lá.
1 ðÁP ỨNG VỚI NHIỆT ðỘ THẤP VÀ VAI TRÒ CỦA TÁC NHÂN ðIỀU HÒA PHIÊN Mà DREB1/CBF CỦA CÂY BẠCH ðÀN Cao Phi Bằng Trường ðại học Hùng Vương, Tỉnh Phú Thọ 1. Mở ñầu Bạch ñàn là cây hạt kín hai lá mầm thuộc họ Myrtaceae. Giống bạch ñàn gồm khoảng hơn 700 loài, phân bố ở tất cả các vùng khí hậu ở Australia, ngoại trừ rừng nhiệt ñới ẩm. Cây bạch ñàn có lá thường xanh, có thể ở dạng cây bụi hay cây gỗ lớn tùy thuộc vào loài. Lá bạch ñàn rất giàu tinh dầu tích tụ trong các cấu trúc ñặc biệt ở trên lá gọi là các thể dầu (Fahn, 1979). Nguồn tinh dầu của bạch ñàn rất quý giá và ngày càng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và mĩ phẩm. Bạch ñàn ñã trở thành loài cây trồng rừng phổ biến nhất trên thế giới nhờ rất nhiều ñặc tính của nó như sinh trưởng nhanh, sản lượng cao và thời gian khai thác ngắn, chất lượng gỗ tốt và ñáp ứng ñược nhiều ñiều kiện về ñất ñai cũng như khí hậu (Kirch et al., 2011). Gỗ bạch ñàn có giá trị kinh tế cao, phù hợp cho nhiều mục ñích khác nhau, trong ñó có công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học (Kole, 2007). Nên diện tích trồng rừng bạch ñàn ngày càng tăng với tốc ñộ cao (Gonçalves et al., 2013). Tuy nhiên, việc trồng bạch ñàn ở những vùng có nhiệt ñộ trung bình thấp cũng gặp một số trở ngại (Booth, 2013). Ở các vùng lạnh, sự tồn tại của bạch ñàn phụ thuộc nhiều vào băng giá vì các cơ quan khí sinh của nó bị phơi lạnh liên tục do là loài cây có lá thường xanh và không có ngủ ñông (Booth, 2013). Trong ñiều kiện stress nhiệt ñộ thấp, có khả năng loài cây này sử dụng các chiến lược thích nghi ñặc biệt khi so sánh với ở cây thân cỏ hàng năm hay cây lâu năm lá rụng. Các nghiên cứu về tính chống chịu của cây bạch ñàn ở ñiều kiện nhiệt ñộ thấp có thể xác ñịnh ñược các cơ chế thích nghi mới ở loài cây này. Hơn nữa, có thể giúp mở rộng vùng trồng bạch ñàn trên một diện tích rộng lớn ở những nơi có khí hậu thấp, giúp tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên ñất, giảm cạnh tranh ñất nông nghiệp. Như vậy, việc xác ñịnh ñược cơ chế ñáp ứng với nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn là một ñòi hỏi vô cùng cấp thiết. Trong khi ñó, các gen DREB1/CBF (C-repeat Binding Factor) ñược biết ñến với vai trò chìa khóa trong sự ñiều hòa các trả lời thích nghi với lạnh của nhiều loài thực vật thông qua nhiều nghiên cứu về biểu hiện gen cũng như chuyển gen. Tuy nhiên, những hiểu biết về chức năng của các gen DREB1/CBF ở các cây thân gỗ còn cực kì hạn chế. Việc trả lời câu hỏi liên quan tới vai trò của gen DREB1/CBF ở cây bạch ñàn là yêu cầu ñặc biệt của công tác chọn tạo giống cây trồng. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn thực hiện ñề tài nghiên cứu «ðáp ứng với nhiệt ñộ thấp và vai trò của tác nhân ñiều hòa phiên mã DREB1/CBF của cây bạch ñàn». Với cách tiếp cận ở mức ñộ phân tử, kết quả thu ñược của ñề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn, góp phần làm sáng tỏ cơ chế thích nghi với nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn ở mức ñộ phân tử. ðồng thời, làm sáng tỏ vai trò của tác nhân ñiều hòa phiên mã DREB1/CBF ở cây bạch ñàn. Từ ñó có thể tạo ra ñược các giống cây bạch ñàn có khả năng thích nghi với các vùng có nhiệt ñộ thấp, góp phần mở rộng diện tích trồng bạch ñàn, giải quyết ñược nhu cầu cho các ngành công nghiệp liên quan. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu (nguồn gốc và các ñiều kiện trồng cấy) Lá của các cây bạch ñàn non trồng trong các ñiều kiện có kiểm soát của hai loài Eucalyptus grandis và E. gunnii ñược thu ñể nghiên cứu sự biểu hiện gen. Song song với việc ñó là các cây 2 non ex vitro của bạch ñàn lai E. urophylla x E. grandis ñã ñược sử dụng ñể ñánh giá kiểu hình và nghiên cứu sự biểu hiện gen. Trong nghiên cứu này, cây bạch ñàn Eucalyptus gunnii ñược ñặt trong ñiều kiện trồng trong phòng lạnh nhân tạo theo một chương trình ñược thiết kế trong nhóm nghiên cứu (Keller et al., 2013) trong khi cây E. grandis ñược ñặt trong ñiều kiện sốc nhiệt 8 giờ ở 4°C. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sản xuất các vật liệu nghiên cứu ex vitro Nhằm thu ñược các cây chuyển gen ex vitro, một protocol bao gồm ba giai ñoạn ñã ñược thiết lập sau rất nhiều các thử nghiệm bằng cách biến ñổi môi trường MS tương ứng với những thay ñổi về pH và của thành phần các loại vitamin và/hoặc ñường saccarose và/hoặc các tác nhân ñiều hòa sinh trưởng (phytohormone). 2.2.2. ðánh giá kiểu hình của các cây chuyển gen Ước lượng khả năng chịu dựng các stress nhiệt ñộ thấp bằng phương pháp ño dòng các ion (Dexter et al., 1930; Travert et al., 1997) và ño huỳnh quang diệp lục của các lá Phân tích giải phẫu nhờ kính hiển vi ñiện tử quét (Hitachi, Ibraki, Japon). Xác ñịnh nồng ñộ các diệp lục theo Lichtenthaler (Lichtenthaler, 1987) và ước lượng tốc ñộ tách chiết diệp lục theo phương pháp của Lolle (Lolle et al., 1997). 2.2.3. Phân tích biểu hiện gen ARN tổng số ñược tách chiết từ 100 mg lá tươi ñã nghiền trong nitơ lỏng bằng cách sử dụng bộ kit ‘SV Total RNA Isolation System’ của hãng Promega có biến ñổi (Jones et al., 1985). Sau ñó phân tích biểu hiện gen nhờ PCR theo thời gian thực (RT-qPCR) ñược thực hiện với máy ABI Prism 7900HT (Foster City, CA, USA). 2.2.4. Phân tích thống kê Test Tukey HSD ñã ñược sử dụng ñể so sánh nhiều giá trị trung bình ñược tính từ các mẫu nhắc lại sinh học hay kĩ thuật của các dòng cây nghiên cứu khác nhau. 2.2.5. Phân tích in silico Các trình tự hệ gen, phiên mã hay protein suy diễn của hệ gen bạch ñàn E. grandis có ở trang web Phytozome. Các gen DREB1/CBF ñược xác ñịnh nhờ phương pháp in silico. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. ðáp ứng với nhiệt ñộ thấp ở mức phân tử của cây bạch ñàn Hình 1. Các dạng biểu hiện của các gen ñược ñiều hòa bởi nhiệt ñộ thấp trong quá trình luyện lạnh. 20 nhóm bao gồm 1670 EST ñược ñiều hòa bởi lạnh ñã ñược phân chia nhờ sử dụng ứng dụng HCE3 (Hierarchical Clustering Explorer 3) thành 6 tập hợp nhóm, 3 nhóm lớn dựa trên dạng biểu hiện gen của chúng. Các thanh thẳng ñứng thể hiện mức ñộ cảm ứng của các EST ñược ñiều hòa bởi nhiệt ñộ thấp, chiều cao tương ứng giữa các tỉ lệ cao nhất và thấp nhất. 3 11 nhóm biểu hiện thu ñược từ trong số 20, có chứa 1596 dòng trên 1670 dòng ñiều hòa bởi lạnh ñược xếp nhóm bằng tay vào sáu tập hợp nhóm các gen cùng ñiều hòa trong quá trình luyện lạnh (Hình 1). Các tập hợp nhóm I và II (chiếm 19,7% tổng số các EST) ñược ñặc trưng bởi sự cảm ứng sớm (« Early induction ») và ñiều ñộ với cực ñại ở 12°C (PI) hay ở 4°C (PII). Các tập hợp nhóm III, IV và V (chiếm 37,3% tổng số các EST) có ñiểm chung là ñược cảm ứng muộn ở 12°C (« Late-12-induction »). Cuối cùng, tập hợp nhóm VI (687 EST, chiếm 43% tổng số), ñặc trưng hóa bởi sự cảm ứng tăng cường trong hai pha của quá trình luyện, tương ứng với các gen ñược ñiều hòa bởi lạnh sâu. Sự tích lũy các bản sao phiên mã song song với sự tăng khả năng chịu băng giá ño ñược trong quá trình luyện lạnh của cây. Các dữ liệu thu ñược từ thực nghiệm macro-array ñã ñược khẳng ñịnh bằng việc ñịnh lượng sự biểu hiện gen (RT- qPCR) của 12 gen thuộc về các tập hợp nhóm ñược ñặc trưng hóa (Hình 2). Tóm lại, phân tích transcriptome nhiệt ñột hấp ở bạch ñàn làm nổi bật sự ưu thế của các cơ chế bảo vệ sinh học chống lại lạnh (LEA) và chống ñộc (metallothionein và các protein chống oxy hóa khác). Cơ chế thứ ba là tích lũy các chất tan bảo vệ áp suất thẩm thấu như các raffinose. Các gen này thuộc về các họ ña gen, trong ñó nhiều thành viên ñược ñiều hòa theo cách thức rất sớm, muộn hay tăng cường. Cuối cùng, một quá trình dường như ñặc hiệu ở bạch ñàn tương ứng với sự tổng hợp các lông (LTP3) và tương ứng với sự tích lũy của chúng trong lớp cuticun ñể bảo vệ các mô. Hình 2. Chứng minh các kết quả thu ñược từ thực nghiệm macro-array bằng RT-qPCR. 12 gen thuộc về các dạng biểu hiện chính ñã ñược lựa chọn dựa trên tính ñồng nhất của chúng, dựa trên dạng biểu hiện và dựa trên ñộ phong phú trong ngân hàng EST. ðối với mỗi gen nghiên cứu, biểu ñồ thể hiện dạng biểu hiện thu ñược từ macro-array và dạng biểu hiện thu ñược từ RT-qPCR. Các kết quả của thực nghiệm RT-qPCR ñược biểu diễn dưới dạng ñộ phong phú tương ñối (khi so với gen ñối chứng là các gen 18S và PP2A3, ñây là các gen luôn biểu hiện với mức ñộ không ñổi ở tất cả các cơ quan của cây bạch ñàn ñặt trong nhiều ñiều kiện thí nghiệm khác nhau). 3.2. Họ gen DREB1/CBF ở cây bạch ñàn 3.2.1. Xác ñịnh và nghiên cứu cây di tryền của họ DREB1/CBF ở cây bạch ñàn Sử dụng các nguồn tài nguyên trình tự hệ gen của cây bạch ñàn và một số thực vật thân gỗ khác, chúng tôi ñi xác ñịnh các DREB1/CBF với có hai vùng tín hiệu nhận biết (PKK/RPAGRxKFxETRHP và DSAWR) bao quanh vùng bảo thủ AP2. Chúng tôi ñã phân lập ñược 17 DREB1/CBF ở Eucalyptus (Hình 3), 6 ở cây ñào, 4 ở cây Việt quất xanh và ba ở cây cam và cây quýt. Họ gen DREB của cây táo ñã ñược miêu tả là có 3 gen DREB1/CBF (Zhuang et al., 2011a). Tuy nhiên kết quả phân tích của chúng tôi cho phép xác ñịnh 6 DREB1/CBF. Các DREB1/CBF tìm thấy trong hệ gen của cây bạch ñàn E. grandis ñược ñem so sánh với các DREB1/CBF của cây E. gunnii ñã ñược phân lập bởi nhóm nghiên cứu của chúng tôi (El 4 Kayal et al., 2006). Kết quả so sánh từng cặp DREB1/CBF giữa hai loài cho thấy các DREB1/CBF của cây bạch ñàn E. grandis khá giống với của bạch ñàn E. gunnii, mức ñộ tương ñồng dao ñộng từ 40 tới 99% tùy từng cặp. Bên cạnh ñó, ñể xác ñịnh mức ñộ tương ñồng giữa các DREB1/CBF của cùng loài E. grandis, 17 trình tự protein tìm thấy ñược ñem so sánh với nhau. Kết quả so sánh cho thấy rằng mức ñộ tương ñồng giữa chúng dao ñộng từ 31 tới 98%. Qua phân tích bước ñầu, số lượng gen DREB1/CBF thay ñổi tùy theo loài cây (Bảng 1). Trong ñó, số DREB1/CBF của bạch ñàn nhiều hơn từ 3 tới 5 lần so với các thực vật than gỗ khác. Bảng 1. So sánh kích thước của họ gen DREB1/CBF ở cây bạch ñàn và các cây thân gỗ khác Nhóm DREB1/CBF ở E. grandis, P. persica và 2 loài trong họ cam ñược xác ñịnh trong nghiên cứu này. Các DREB1/CBF của các loài khác ñã ñược miêu tả bởi (Zhuang et al., 2008b) và (Licausi et al., 2010) nhưng việc chú giải các nhóm gen này ñã ñược kiểm tra và chính xác hóa trong nghiên cứu của chúng tôi. Loài Kiểu lá Số lượng gen CBF Eucalyptus grandis Thường xanh 17 Malus domestica Rụng lá 6 Populus trichocarpa Rụng lá 6 Vitis vinifera Rụng lá 7 Prunus persica Rụng lá 6 Vaccinium corymbosum Rụng lá 4 Citrus clementina Thường xanh 3 Citrus sinensis Thường xanh 3 Trong số 17 gen, 14 gen nằm trên cùng một ñoạn của nhiễm sắc thể số 1 và hai gen khác nằm trên nhiễm sắc thể thứ 5. Hiện tượng lặp gen này cũng ñược quan sát ở nhiều loài cây khác ñối với các gen thuộc họ DREB1/CBF (Nakano et al., 2006; Zhuang et al., 2008a; Zhuang et al., 2011b; Zhao et al., 2012). ðối với mỗi loài nghiên cứu, phân tích cây di truyền (Hình 3) các gen thuộc họ DREB1/CBF chỉ ra nhiều sự kiện nhân ñôi của gen DREB1/CBF, trước hoặc sau sự phân hóa loài. Hình 3. Cây di truyền ñược xây dựng từ các DREB1/CBF của các loài Citrus clementina, C. sinensis, Eucalyptus grandis, E. gunnii, Malus domestica, Populus trichocarpa, Prunus persica, Vitis vinifera, Vaccinium corymbosum et Arabidopsis thaliana Cây di truyền ñược xây dựng từ các trình tự protein hoàn chỉnh ñã ñược sắp dãy nhờ sử dụng phần mềm Mega 5, phương pháp Maximum likelihood và kiểm tra Bootstrap với 1000 lần lặp lại. AtAP2 (At5G557390.1), protein thuộc phân họ AP2 ñược sử dụng ñể tạo rễ của cây di truyền. Các giá trị Bootstrap nhỏ hơn 50 ñã ñược loại bỏ. 3.2.2. Nghiên cứu sự ñiều hòa các gen DREB1/CBF bởi nhiệt ñộ thấp 5 Phân tích in silico các promoter của các gen cho phép dự ñoán sự có mặt của các motif liên kết và cho phép ñặt giả thiết về sự ñiều hòa của các gen. Kết quả phân tích promoter của các gen DREB1/CBF chỉ ra rằng cấu trúc promoter thay ñổi tùy theo gen DREB1/CBF khác nhau, ñiều này gợi ý rằng mỗi gen DREB1/CBF có thể có một kiểu ñiều hòa riêng biệt trong phản ứng với lạnh. Motif MYC, vị trí gắn của các tác nhân ñiều hòa ICE, có mặt nhiều nhất trong các promoter của các gen CBF, phù hợp với thực nghiệm chứng minh DREB1/CBF ñược cảm ứng bởi lạnh thông qua các tác nhân ñiều hòa ICE. Yếu tố CM2 chỉ tồn tại trong promoter của 5 trên tổng số 17 gen. Yếu tố DRE/CRT có mặt trong promoter của 8 gen CBF, gợi ý rằng các gen này có cơ chế tự ñiều hòa. Phương pháp ñịnh lượng các bản phiên mã ARN thông tin sinh ra từ các gen này nhờ RT- qPCR ñược sử dụng ñể xác ñịnh sự biểu hiện của các CBF khi các cây nghiên cứu bị ñặt vào phòng nuôi cấy có nhiệt ñộ 4°C. Kết quả thu ñược (Hình 4) chỉ ra rằng tất cả các gen nghiên cứu ñều biểu hiện ít nhất ở một ñiều kiện. Hình 4. Sự biểu hiện gen tương ñối của các DREB1/CBF (C) trong ñiều kiện nhiệt ñộ thấp (các cây ñược ñặt 8 giờ trong ñiều kiện lạnh 4°C) Các biểu ñồ thể hiện giá trị biểuh iện gen tương ñối của các DREB1/CBF ñược phân tích bằng phương pháp RT-qPCR (giá trị trung bình, n=3). Các số liệu cơ sở tương ứng với các giá trị biểu hiện gen của các lá ñược ñặt trong ñiều kiện thường (23°C). Hình chèn vào thể hiện ở một thang khác. Gen ñối chứng ñược dùng là PP2A1 và PP2A3. Sự biểu hiện của một số DREB1/CBF trong ñiều kiện tiêu chuẩn là tương ñối yếu. Tuy nhiên, khi ñặt các cây nghiên cứu vào trong ñiều kiện nhiệt ñộ thấp, các gen DREB1/CBF lập tức biểu hiện với cường ñộ cao, trong ñó nổi bật nhất là các gen CBF1, CBF8 và CBF16. 3.3.Vai trò của các DREB1/CBF ñối với tính chịu nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn 3.3.1. Cây chuyển gen DREB1/CBF: sản xuất và xác ñịnh mức ñộ gen ñược chuyển Ở bạch ñàn, ñể nghiên cứu chức năng của DREB1/CBF, nhóm nghiên cứu ñã tạo ra các dòng bạch ñàn chuyển gen biểu hiện trên ñối với hai gen ñược lựa chọn dựa trên phản ứng mạnh với các ñiều kiện sốc lạnh (DREB1a/CBF1a) hay quá trình luyện luyện (DREB1b/CBF1b) (El Kayal et al., 2006). Việc sản xuất vật liệu nghiên cứu ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu các khoa học về thực vật (LRSV, Toulouse, France). Mức ñộ các gen ñược chuyển vào các dòng cây biểu hiện trên gen DREB1/CBF1a hay DREB1/CBF1b ñược ñịnh lượng bằng phương pháp RT-qPCR ñối với các mô lá, cơ quan ñầu tiên chịu tác ñộng của các ñiều kiện nhiệt ñộ bất lợi của môi trường. Theo ñó, mức ñộ của các gen ñược chuyển lần lượt là 18125 (A25, dòng chuyển gen DREB1/CBF1a) và 284007 (B9, dòng chuyển gen DREB1/CBF1b). 6 3.3.2. Tính chống chịu nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn ñược chuyển gen DREB1/CBF Khả năng chịu băng giá ñược ước lượng ở các dòng cây biểu hiện trên gen DREB1/CBF cao hơn so với ở cây ñối chứng trong kết quả của cả hai thực nghiệm khác nhau (Hình 5 và Hình 6), trong ñó dòng B9 có khả năng chịu ñựng lạnh cao nhất. Hình 5. Khả nãng chịu bãng giá của các dòng cây chuyển gen A25, B9 và cây ðối chứng PK7 (14 tuần tuổi) ðýợc ýớc lýợng bằng phép ðo suất ðiện ðộng các ðĩa lá bị phõi trong bãng giá tãng cýờng (tốc ðộ -2.5°C/h). Các giá trị về ðộ toàn vẹn của màng là các giá trị trung bình thu ðýợc từ ba cây ở mỗi dòng. Các kết quả ðýợc xử lí thống kê với mức sai khác có ý nghĩa ở p = 0,05 với test Tukey HSD. Hình 6. Khả nãng chịu bãng giá của các dòng cây chuyển gen A25, B9 và cây ðối chứng PK7 (14 tuần tuổi) ðýợc ýớc lýợng bằng phép ðo huỳnh quang diệp lục các lá bị phõi trong bãng giá tãng cýờng (tốc ðộ -2.5°C/h). Các giá trị về ðộ toàn vẹn của hệ thống quang hợp là các giá trị trung bình thu ðýợc từ ba cây ở mỗi dòng. Các kết quả ðýợc xử lí thống kê với mức sai khác có ý nghĩa ở p = 0,05 với test Tukey HSD. 3.3.3. Biến ñổi về hình thái và thành phần lá Ở mức ñộ hình thái lá, chúng tôi quan sát thấy lá của cây các dòng biểu hiện trên gen DREB1/CBF có kích thước lá trung bình luôn nhỏ hơn so với cây ñối chứng. Thực vậy, kích thước lá của cây ñối chứng là 7,08/2,88 cm (chiều dài/chiều rộng). (Hình 7). Hình 7. Kích thước của lá ở các dòng cây chuyển gen và ñối chứng ở 14 tuần tuổi. (a) chiều dài lá; (b) chiều rộng lá; Các số liệu ñược xử lí thống kê với test Tukey HSD ñể so sánh các giá trị trung bình ở mức ñộ p = 0,05. Các giá trị khác nhau có ý nghĩa mang các kí tự khác nhau. Hình 8. Các bề mặt lá ñược quan sát bằng kính hiển vi ñiện tử quét. Mặt trên (ở ñộ phóng ñại 600x) và mặt dưới (ở ñộ phóng ñại 900x) của các dòng cây A25, B9 và Pk7 ; S = khí khổng, G = túi dầu, N = mạch, thước tỉ lệ có chiều dài 100 µm. Nhờ vào các ảnh thu ñược từ kính hiển vi ñiện tử (Hình 4-8) chúng tôi chứng minh ñược kích thước tế bào ở cây ñối chứng lớn hơn so với ở cây biểu hiện trên gen DREB1/CBF một cách có ý nghĩa, nhưng mật ñộ khí khổng và túi dầu lại thấp hơn (Bảng 2). Bảng 2. Diện tích trung bình và mật ñộ các tế bào biểu bì của các dòng A25, B9 và ñối chứng Pk7 ñược ño bằng cách phân tích hình ảnh thu ñược từ kính hiển vi ñiện tử quét (mặt trên của lá). Các giá trị trung bình ± SD ñược tính toán với ít nhất 1700 tế bào. Các số liệu ñược xử lí thống kê với test Tukey HSD ñể so sánh các giá trị trung bình ở mức ñộ p = 0,05. Các giá trị khác nhau có ý nghĩa mang các kí tự khác nhau. 7 Diện tích trung bình của các tế bào (µm 2 ) Mật ñộ tế bào (tế bào/1000 µm 2 ) Pk7 480,05 a ± 175 2,08 c ± 0,11 A25 389,54 b ± 132,93 2,62 d ± 0,17 B9 374,31 b ± 91,79 2,70 d ± 0,12 Hình 9 thể hiện nồng ñộ diệp lục luôn cao hơn ở cây B9 so với ñối chứng trong khi giữa A25 và ñối chứng khác nhau không có ý nghĩa ở mức 5%. Hình 9. Nồng ñộ các loại diệp lục (a, b và a+b) của lá các dòng cây nghiên cứu Các giá trị trung bình thu ñược từ ba lá của mỗi dòng (1 lá/1 cây). Các số liệu ñược xử lí thống kê với test Tukey HSD ñể so sánh các giá trị trung bình ở mức ñộ p = 0,05. Các giá trị khác nhau có ý nghĩa mang các kí tự khác nhau Giả thiết về sự tích lũy quan trọng lớp lông trên bề mặt lá cây các dòng biểu hiện trên gen DREB1/CBF, ñặt ra khi quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử ñược khẳng ñịnh nhờ tốc ñộ tách diệp lục của lá ở cây B9 luôn chậm hơn so với ở cây A25 và cây ñối chứng. 3.3.4. Cơ sở phân tử của tính chống chịu nhiệt ñộ thấp và các biến ñổi hình thái lá Hình 10. Mức ñộ biểu hiện trên (RT-qPCR) của các gen liên quan tới việc trả lời với các stress nhiệt ñộ. DHN (Dehydrin, bảo vệ tế bào), HSP70 (Protein shock nhiệt 70, chaperon), GolS và RS (Galactinol synthase và Raffinose synthase, các enzym tổng hợp ñường raffinose), Elip (Protein ñược cảm ứng bởi ánh sáng, bảo vệ hệ thống quang hợp). So sánh các dòng A25 và B9 với ñối chứng (Pk7, 23°C). Biểu hiện trên là sự biểu hiện tương ñối so với dòng ñối chứng. Các gen tham chiếu ñược sử dụng là 18S và PP2A3. Ở ít nhất một dòng biểu hiện trên gen DREB1/CBF, các gen ñược biểu hiện trên với tỉ lệ cao hơn 2 lần so với cây ñối chứng (Hình 10). Nhìn chung, mức ñộ biểu hiện trên của các gen khá cao. Các gen mã hóa Dehydrine (DHN) là những gen biểu hiện mạnh nhất, cạnh ñó là các enzyme galactinol synthase (GolS), chúng biểu hiện trên rất mạnh ở cả hai dòng chuyển gen A25 và B9. Các gen cùng biểu hiện trên ở cả hai dòng cây chuyển gen này có thể thuộc về regulon chung giữa hai gen DREB1/CBF1a và DREB1/CBF1b. Vài gen chỉ biểu hiện trên ở một dòng (Elip ở dòng A25 và RS-4 ở dòng B9), gợi ý về sự tồn tại sự ñiều hòa ñặc hiệu của mỗi gen DREB1/CBF trong vài trường hợp. Một cách chung nhất, sự biểu hiện rất mạnh này của các gen ñích của các gen DREB1/CBF cho phép lí giải khả năng lạnh thu ñược ở các dòng biểu hiện trên DREB1/CBF ở cây bạch ñàn. Sự biểu hiện rất mạnh của các gen DHN là phù hợp với sự có mặt rất nhiều các EST tương ứng trong transcriptome của lá cây trong quá trình luyện lạnh (dữ liệu không ñược giới thiệu ở ñây (Keller et al., 2013). 8 Kết quả này khẳng ñịnh một số kiểu hình ñã ñược quan sát ở các chồi cây in vitro (Navarro et al., 2011) và phù hợp với ở nhiều loài cây khác (Kang et al., 2011; Wisniewski et al., 2011; Yang et al., 2011; Tillett et al., 2012; Oakenfull et al., 2013). Hình 11. Mức ñộ biểu hiện trên (RT- qPCR) của các gen liên quan tới biến ñổi hình thái và thành phần của lá. SHN (SHINE, tích lũy các lông sáp), KNOX (KNOX, kích thích sự tổng hợp cytokinin và ức chế tổng hợp gibberrelin), AP2 (AP2, sinh tổng hợp sáp), NAC (NAC, ñiều tiết kích thước tế bào). So sánh các dòng A25 và B9 với ñối chứng (Pk7, 23°C). Biểu hiện trên là sự biểu hiện tương ñối so với dòng ñối chứng. Các gen tham chiếu ñược sử dụng là 18S và PP2A3. Trong số các gen ñược lựa chọn ñể nghiên cứu (thuộc bốn họ gen tham gia vào sự phát triển), sáu gen mã hóa hoặc các protein thực hiện tham gia trực tiếp hay gián tiếp vào quá trình biến ñổi hình thái và thành phần của lá cây bạch ñàn có mức ñộ biểu hiện cao hơn ở cây chuyển gen so với ñối chứng (Hình 11). Kết quả này gợi ý các gen ñược biểu hiện trên ở các dòng cây chuyển gen thuộc về regulon chung của hai gen DREB1/CBF (a và b), nhưng với sự hoạt hóa của gen DREB1/CBF1b dường như mạnh hơn và rộng hơn DREB1/CBF1a. Cơ chế thu nhỏ kích thước tế bào ở các cây chuyển gen DREB1/CBF của bạch ñàn giống với nhiều loài thực vật, ngược lại, sự tăng số lượng túi dầu và lớp lông trên bề mặt lá ñặc hiệu ở bạch ñàn. Trong ñó cơ chế cuối ñược làm sáng tỏ ở mức phân tử với sự biểu hiện trên ñặc biệt cao của gen SHN1A. 4. Kết luận Công trình nghiên cứu này ñã chứng minh ñược bạch ñàn là ñối tượng lí tưởng trong nghiên cứu ñáp ứng ñối với nhiệt ñộ thấp của môi trường. Cây bạch ñàn sử dụng ba cơ chế chính ñể ñối phó với nhiệt ñộ thấp là bảo vệ màng và các phân tử sinh học, bảo vệ áp suất thẩm thấu và chống ñộc. Trong ñó, sự chịu ñựng nhiệt ñộ thấp của bạch ñàn gắn liền với các họ ña gen có liên quan ñến các cơ chế thích nghi trên, chủ yếu là các họ gen LEA (gồm cả DHN), HSP, raffinose synthase, galactinol synthase và các metallothionein. Chúng tôi cũng ñã phân lập ñược toàn bộ 17 gen DREB1/CBF ở cây bạch ñàn E. grandis và chỉ ra tính phức tạp trong ñiều hòa của họ gen này trong phản ứng với lạnh. Các dòng cây chuyển gen DREB1/CBF ex vitro ñã ñược tạo ra và ở trên các ñối tượng này chúng tôi quan sát ñược sự tăng tính chịu nhiệt ñộ thấp cũng như các biến ñổi hình thái và thành phần của lá. Vai trò của các gen DREB1/CBF ñối với những biến ñổi hình thái, thành phần lá cũng như tăng tính chịu nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn ở mức phân tử cũng ñược chứng minh. Tài liệu tham khảo Booth TH. 2013. Eucalypt plantations and climate change. Forest Ecology and Management 301(0): 28-34. Dexter ST, Tottingham WE, Graber LF. 1930. Preliminary results in measuring the hardiness of plants. Plant physiology 5(2): 215. 9 El Kayal W, Navarro M, Marque G, Keller G, Marque C, Teulieres C. 2006. Expression profile of CBF-like transcriptional factor genes from Eucalyptus in response to cold. Journal of Experimental Botany 57(10): 2455-2469. Fahn A. 1979. Secretory tissues in plants. Gonçalves JLdM, Alvares CA, Higa AR, Silva LD, Alfenas AC, Stahl J, Ferraz SFdB, Lima WdP, Brancalion PHS, Hubner A, Bouillet J-PD, Laclau J-P, Nouvellon Y, Epron D. 2013. Integrating genetic and silvicultural strategies to minimize abiotic and biotic constraints in Brazilian eucalypt plantations. Forest Ecology and Management 301(0): 6-27. Jones JD, Dunsmuir P, Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimaeric genes in regenerated transformed plants. Embo j 4(10): 2411-2418. Kang HG, Kim J, Kim B, Jeong H, Choi SH, Kim EK, Lee HY, Lim PO. 2011. Overexpression of FTL1/DDF1, an AP2 transcription factor, enhances tolerance to cold, drought, and heat stresses in Arabidopsis thaliana. Plant Sci 180(4): 634-641. Keller G, Cao P, San Clemente H, El Kayal W, Marque C, Teulières C. 2013. Transcript profiling combined with functional annotation of 2,662 ESTs provides a molecular picture of Eucalyptus gunnii cold acclimation. Trees 27(6): 1713-1735. Kirch R, Astarita LV, Santarém ER, Pasquali G 2011. Eucalyptus transgenic plants: from genetic transformation protocols to biosafety analysis. BMC Proceedings: BioMed Central Ltd. P179. Kole C. 2007. Forest Trees: Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants: Springer. Licausi F, Giorgi FM, Zenoni S, Osti F, Pezzotti M, Perata P. 2010. Genomic and transcriptomic analysis of the AP2/ERF superfamily in Vitis vinifera. BMC Genomics 11: 719. Lichtenthaler HK 1987. [34] Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. In: Lester Packer RD ed. Methods in Enzymology: Academic Press, 350-382. Lolle SJ, Berlyn GP, Engstrom EM, Krolikowski KA, Reiter WD, Pruitt RE. 1997. Developmental regulation of cell interactions in the Arabidopsis fiddlehead-1 mutant: a role for the epidermal cell wall and cuticle. Dev Biol 189(2): 311-321. Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H. 2006. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant Physiol 140(2): 411-432. Navarro M, Ayax C, Martinez Y, Laur J, El Kayal W, Marque C, Teulieres C. 2011. Two EguCBF1 genes overexpressed in Eucalyptus display a different impact on stress tolerance and plant development. Plant Biotechnology Journal 9(1). Oakenfull RJ, Baxter R, Knight MR. 2013. A C-Repeat Binding Factor Transcriptional Activator (CBF/DREB1) from European Bilberry (Vaccinium myrtillus) Induces Freezing Tolerance When Expressed in Arabidopsis thaliana. Plos One 8(1). Tillett RL, Wheatley MD, Tattersall EA, Schlauch KA, Cramer GR, Cushman JC. 2012. The Vitis vinifera C-repeat binding protein 4 (VvCBF4) transcriptional factor enhances freezing tolerance in wine grape. Plant Biotechnol J 10(1): 105-124. Travert S, Valerio L, Fouraste I, Boudet AM, Teulieres C. 1997. Enrichment in Specific Soluble Sugars of Two Eucalyptus Cell-Suspension Cultures by Various Treatments Enhances Their Frost Tolerance via a Noncolligative Mechanism. Plant Physiol 114(4): 1433-1442. 10 Wisniewski M, Norelli J, Bassett C, Artlip T, Macarisin D. 2011. Ectopic expression of a novel peach (Prunus persica) CBF transcription factor in apple (Malus × domestica) results in short-day induced dormancy and increased cold hardiness. Planta 233(5): 971-983. Yang W, Liu XD, Chi XJ, Wu CA, Li YZ, Song LL, Liu XM, Wang YF, Wang FW, Zhang CA, Liu Y, Zong JM, Li HY. 2011. Dwarf apple MbDREB1 enhances plant tolerance to low temperature, drought, and salt stress via both ABA-dependent and ABA-independent pathways. Planta 233(2): 219-229. Zhao T, Liang D, Wang P, Liu J, Ma F. 2012. Genome-wide analysis and expression profiling of the DREB transcription factor gene family in Malus under abiotic stress. Mol Genet Genomics 287(5): 423-436. Zhuang J, Cai B, Peng RH, Zhu B, Jin XF, Xue Y, Gao F, Fu XY, Tian YS, Zhao W. 2008a. Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in populus trichocarpa. Biochem Biophys Res Commun 371(3): 468-474. Zhuang J, Cai B, Peng RH, Zhu B, Jin XF, Xue Y, Gao F, Fu XY, Tian YS, Zhao W, Qiao YS, Zhang Z, Xiong AS, Yao QH. 2008b. Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa. Biochemical And Biophysical Research Communications 371(3): 468-474. Zhuang J, Chen JM, Yao QH, Xiong F, Sun CC, Zhou XR, Zhang J, Xiong AS. 2011a. Discovery and expression profile analysis of AP2/ERF family genes from Triticum aestivum. Mol Biol Rep 38(2): 745-753. Zhuang J, Chen JM, Yao QH, Xiong F, Sun CC, Zhou XR, Zhang J, Xiong AS. 2011b. Discovery and expression profile analysis of AP2/ERF family genes from triticum aestivum. Mol Biol Rep 38(2): 745-753. SUMMARY RESPONSE TO LOW TEMPERATURE AND ROLE OF TRANSCRIPTION FACTOR DREB1/CBF IN EUCALYPTUS Cao Phi Bang Hung Vuong University Eucalyptus has an important economic role but the plantation of this tree is usually limited by cold. Eucalyptus could be a good model tree in cold adaptation reseach due to their biological characteristics, perenial, evergreen and without dormancy. In this work, we have identified three molecular adaptive mechanisms to cold response of this tree. We also identified and analyzed 17 DREB1/CBF genes, the key transcription factor in cold response, in the whole genome of Eucalyptus grandis. By using transformation approach, we approved that the DREB1/CBF transcription factors increase the cold tolerance in Eucalyptus by regulating genes involved in principal molecular mechanisms of cold tolerance as well as modifying leaves adaptive morphology including wax deposition, increase of oil gland and stomata density. Keywords: Eucalyptus, cold tolerance, DREB1/CBF transcription factor, overexpression, leaves morphology. . 1 ðÁP ỨNG VỚI NHIỆT ðỘ THẤP VÀ VAI TRÒ CỦA TÁC NHÂN ðIỀU HÒA PHIÊN Mà DREB1/CBF CỦA CÂY BẠCH ðÀN Cao Phi Bằng Trường ðại học Hùng Vương, Tỉnh Phú Thọ 1. Mở ñầu Bạch ñàn là cây hạt. nghi với nhiệt ñộ thấp của cây bạch ñàn ở mức ñộ phân tử. ðồng thời, làm sáng tỏ vai trò của tác nhân ñiều hòa phiên mã DREB1/CBF ở cây bạch ñàn. Từ ñó có thể tạo ra ñược các giống cây bạch. «ðáp ứng với nhiệt ñộ thấp và vai trò của tác nhân ñiều hòa phiên mã DREB1/CBF của cây bạch ñàn». Với cách tiếp cận ở mức ñộ phân tử, kết quả thu ñược của ñề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn