Vi khuẩn cố định đạm

Theo nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh và cộng sự 2008, thời gian nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng và khả năng cố định nitrogen của chủng vi khuẩn chủng BK – 6 thuộc chi Azotobacter phân lập

MỞ ĐẦU

Rừng ngập mặn là kiểu rừng phát triển trên vùng đất lầy, ngập nước mặn vùng cửa sông, ven biển, dọc theo các sông ngòi, kênh rạch có nước lợ do thủy triều lên xuống hàng ngày Nó đóng vai trò rất quan trọng đối với con người, động vật và hệ sinh thái xung quanh Rừng ngập mặn có giá trị lớn về kinh tế – xã hội như cung cấp thực phẩm (các loại hải sản, đường, mật ong…), dược phẩm, năng lượng (than các cây đước, vẹt ít khói, năng lượng cao), lâm sản (gỗ các loại cây như đước, vẹt, cóc…)… Một vai trò vô cùng to lớn mà chúng ta phải nhắc đến ở đây là rừng ngập mặn có vai trò chống biến đổi khí hậu và điều hòa khí hậu Rừng ngập mặn được ví như lá chắn xanh bảo vệ vùng cửa sông, cửa biển để chống xói lở, hạn chế tác hại của gió bão và sóng thần, mở rộng đất liền Rừng ngập mặn không chỉ hấp thụ một lượng

CO2 do hoạt động công nghiệp và sinh hoạt thải ra mà còn sản sinh ra một lượng O2rất lớn làm cho bầu không khí trong lành [35]

Tuy nhiên, diện tích rừng ngập mặn đang ngày càng suy giảm do hậu quả của chiến tranh, bom đạn và chất diệt cỏ với liều lượng cao; do sự tàn phá của con người; hay thảm họa của thiên nhiên Ở Thừa Thiên Huế, hiện tại, rừng ngập mặn chỉ còn chưa đầy 8 ha, chủ yếu ở Rú Chá (Hương Phong, Hương Trà), Tân Mỹ (Phú Vang),

Cù Du (Cảnh Dương, Phú Lộc), Đầm Lập An (Lăng Cô, Phú Lộc) Diện tích rừng ở địa bàn đang ngày càng thu hẹp chủ yếu do người dân khai thác cây ngập mặn đốn củi, lấy đất làm ao nuôi tôm, xây dựng các khu đô thị, khu nghĩ dưỡng [32]

Vi khuẩn cố định nitrogen có khả năng cố định N2 trong khí quyển thành NH3dùng làm nguồn N để tổng hợp chất hữu cơ cho cây Chính vì vậy, việc bổ sung vi khuẩn cố định nitrogen vào hệ sinh thái rừng ngập mặn có ý nghĩa quan trọng trong việc sinh trưởng, phát triển của cây trồng đặc biệt là đối với cây con trong vườn ươm; duy trì độ phì của đất và mở rộng diện tích rừng ngập mặn

Vi khuẩn cố định nitrogen làm phân bón cho cây con trong vườn ươm là những giống bản địa, được phân lập và tuyển chọn tại đất rừng ngập mặn trên địa bàn Nên

nó thích nghi trong đất rừng ngập mặn tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt

Không những thế, sử dụng phân vi khuẩn cố định nitrogen là giải pháp tối ưu Hạn chế được những nhược điểm của phân bón hóa học, tránh ô nhiễm môi trường, bảo vệ hệ sinh thái rừng ngập mặn

Để góp một phần nhỏ trong hướng nghiên cứu vi khuẩn cố định nitrogen làm cơ

sở cho việc sử dụng chúng trong ươm nhân, gây trồng rừng ngập mặn ở Thừa Thiên

Huế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu vi khuẩn cố định nitrogen phân lập từ đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế."

Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, do điều kiện thời gian có hạn nên không tránh khỏi những thiếu sót trong bài khóa luận, chúng tôi rất mong được sự góp ý chân thành của tất cả thầy cô giáo và các bạn

Phần 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITROGEN

1 Các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen

Vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình cố định nitrogen là những vi sinh vật

có khả năng chuyển hóa nitrogen phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitrogen và làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitrogen trong đất [8]

Những vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen thường gặp như:

 Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây thuộc bộ Đậu

 Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc chi Azotobacter và Beiferinckia

 Vi khuẩn kị khí sống tự do thuộc chi Clostridium

 Tảo lam sống tự do và tảo lam sống cộng sinh ở bèo hoa dâu

 Các nhóm vi sinh vật khác như:

 Họ Pseudomonadaceae: Azotomonas insolita, A fluorescens, Pseudomonas

azotocolligans, P azotogensis, P methanitrificens, P non-liquefaciens, P herbicola,

nhiều loài Pseudomonas sp

 Họ Spirillaceae: Spirillum lipoferum, S azotocolligens, S magnum, S

speciosum, S nana, Vibrio frequens, V hydrosulfureus, V non hydrosulfurus, Desulfovibrio desulfuricans, Desulfovibrio sp

 Họ Azotobacteriaceae: Derxia gummosa, D indica

 Họ Rhizobiaceae: Agrobacterium radiobacter

 Họ Achromobacteraceae: Achromobacter parbutus, A hartlebii

 Họ Enterbacteriaceae: Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Klebsiella

rubiacearum

 Họ Corynebacteriaceae: loài Arthrobacter sp

 Họ Bacillaceae: Bacillus polymixa, B megaterium, Thermobacillus

azotofigens, B trufauti, Methannobacterium omeliansskii

 Họ Thiorhodaceae: nhiều loài thuộc chi Chromatium

 Họ Athiorhodaceae: Thodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas

capsulatus, R gelatinosa, R spherodes, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum sp

 Họ Chlorobacteriaceae: Chloropseudomonas ethylicum, Chlorobium limicola,

C thiosulfatophilum

 Họ Hyphomicrobiaceae: Rhodomicrobium vannielii

 Họ Mycobacteriaceae: Mycobacterium roseo-album, M invisible, M

azot-absorptum

 Họ Actinomucetaceae: Nocardia calcaren, N cellulans, Streptomyces

elephanatis primigeni, S denitrificans, S griseo-viridis, S putrificus, S azotophilus,

S griseus, S cylundrospora, S aureofaciens, S ruber, S albidoflavus, S fumosus, S candidus, S miaveolus, S globisporus, S coelicolor, S griseoruber

 Họ Treponemataceae: Treponema hyponeustonicum

 Một số đại diện của nấm men và nấm mốc: Saccharomyces apiculatus, S

ellipsoideus champagne, S ellipsoideus, S cerevisiae, Torula wiesneri, Oidium lactis

[8]

2 Sơ lược về vi khuẩn cố định nitrogen

Năm 1983, Vinogratski đã phân lập được vi khuẩn kỵ khí cố định nitrogen là

Clostridium pasteurianum Năm 1901, M W Beijerinck phân lập được hai loài vi

khuẩn hiếu khí cố định nitrogen là Azotobacter chroococcum và Azotobacter agilis

Về sau người ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi này (như Azotobacter beijerinckii,

Azotobacter vinelendii…) [6] Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả

năng cố định nitrogen phân tử, khả năng kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng thông qua sự tạo thành các chất trao đổi trung gian của nhóm vi khuẩn này Vi khuẩn

cố định nitrogen có thể là vi khuẩn hiếu khí (Azotobacter, Klebsiella, Bacillus), kỵ khí bắt buộc (Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum…) [6]

 Azotobacter: là loài vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc hay vi hiếu khí, sống tự do

trong tự nhiên, là vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, di động nhờ tiên mao mọc

quanh khắp cơ thể hoặc bất động Vi khuẩn thuộc chi Azotobacter có tế bào hình trứng

với đường kính 1,5 – 2,0 µm hoặc lớn hơn, có khả năng thay đổi hình dạng, từ hình que đến hình tròn Phần lớn tế bào tồn tại riêng rẽ hoặc từng đôi hay có thể liên kết thành chuỗi với độ dài khác nhau Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt đơn giản

Trên các môi trường chứa nitrogen, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi

khi nhăn nheo Khi nuôi cấy lâu trên môi trường đặc, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen (tùy thuộc theo loài)

Khi về già hoặc khi xử lý một số hóa chất như n - butanol… tế bào Azotobacter

chuyển sang dạng nang Thể nang giúp tế bào tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như nhiệt độ cao, thiếu nước… [7]

Azotobacter phân bố rộng rãi trong đất, nước và bùn Theo các tác giả Zinovieva

K G., Mitsuxtin E N và Silnicova V K (1968) cho biết, ngoài khả năng cố định

nitrogen, Azotobacter còn có khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật như auxin, gibberellin và tích lũy trong môi trường nuôi cấy nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như vitamin B1, B2, B6, B12, acid nicotinic, acid pantothenic, lycine… [6]

 Azospirillum: Năm 1922, Beijerinck phân lập được vi khuẩn này từ đất nghèo nitrogen ở Hà Lan và đặt tên là Azotobacter lipoferum Vào năm 1962 – 1963,

Becking lại phân lập từ nhiều vùng đất khác nhau và khẳng định khả năng cố định nitrogen của chúng bằng phương pháp sử dụng N15 Sau đó (1976), Doeberiner và cộng sự đã miêu tả sự phân bố rộng rãi của vi khuẩn này trong vùng rễ nhiều cây thuộc họ Hòa thảo nhiệt đới (đặc biệt ở Brazil) cũng như ảnh hưởng của chúng đến sinh trưởng của cây Dựa vào các đặc điểm sinh lý và thành phần base của nhân, vi

khuẩn này được xếp vào một chi riêng có tên là Azospirillum

Tế bào của Azospirillum hình que uốn cong nhẹ, kích thước khoảng 2,0 – 4,6

µm Khi môi trường trở nên kiềm hóa hoặc dư thừa O2 trong dịch nuôi cấy xuất hiện

những dạng tế bào dị thường Ở môi trường dịch thể, Azospirillum vận động nhờ tiên

mao đơn cực Khả năng sử dụng glucose hay saccharose cũng là một thông số quan

trọng để phân biệt các loài thuộc chi Azospirillum Chúng phân bố nhiều trong đất

ngập nước, cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí, đặc biệt ở vùng rễ nhiều cây

họ Hòa thảo Vi khuẩn này phân bố nhiều trong đất trồng lúa và rễ lúa Số lượng

Azospirillum trong đất canh tác thường lớn hơn so với đất hoang (Charyulu và Rao,

1980) [9] Nhiều nghiên cứu còn xác định, khi nhiễm Azospirillum, ngoài sự gia tăng

sinh trưởng của cây, chúng còn ảnh hưởng đến sự thay đổi các chỉ số về lá Khi lây

nhiễm Azospirillum còn kích thích sự nảy mầm của hạt và chiều dài của rễ Tuy nhiên,

nồng độ cho phép nhiễm vi khuẩn vào hạt giống và cây mạ của nhiều loại rau, lúa (từ

3 – 4 tuần tuổi) chỉ khoảng 105 – 106 tế bào/ml Thông thường nồng độ Azospirillum

cao khoảng 108 – 1010 tế bào/ml thường làm ức chế sự phát triển của rễ, chiều cao, trọng lượng của cây mạ [3], [11]

 Beijerinckia: Tế bào của Beijerinckia thường tồn tại riêng rẽ, tế bào có hình dạng

thay đổi (hình cầu đến hình que), khi về già có thể tạo nên những hình dạng rất khác

thường Khi phát triển trên môi trường vô đạm chứa glucose, Beijerinckia thường tạo thành những khuẩn lạc lồi và rất nhầy, khi già mới tạo sắc tố Beijerinckia có thể phát

triển trong phạm vi nhiệt độ 16 – 37oC Một số nghiên cứu cho biết, thời kỳ tiềm phát (lag phase) là ngắn nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30 – 35oC và pH là 4,5 – 5,3 (Strydom

B W.,1966) Beijerinckia thuộc loại Gram âm, không sinh bào tử, kích thước khoảng 0,5 – 1,15 × 1,17 – 4,5 µm [7] Beijerinckia phân bố rộng rãi trong các đất vùng nhiệt đới và chống chịu oxygen kém hơn so với Azotobacter Ngoài khả năng cố định nitrogen phân tử, Beijerinckia còn có khả năng tổng hợp một số chất hoạt động sinh

học có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây trồng [6]

 Xanthobacter: Năm 1977, Wiegel và cộng sự đã xếp Xanthobacter thành một chi

riêng thuộc họ Azotobacteriaceae Chúng có hình que, kích thước 0,4 – 1,0 × 0,8 – 6,0

µm Chúng thuộc loại vi khuẩn Gram dương nhưng siêu cấu trúc thành tế bào lại biểu hiện đặc điểm của vi khuẩn Gram âm, có chu mao, sinh trưởng hiếu khí bắt buộc, phát triển tốt ở 25 – 30oC, pH thích hợp là 5,8 – 9,0 Khuẩn lạc mờ đục, nhầy, có màu vàng

do tạo thành sắc tố carotenoid không hòa tan trong nước Sinh trưởng tự dưỡng hóa năng trong môi trường khoáng với sinh quyển chứa H2, O2, CO2 theo tỷ lệ 7 : 2 : 1 về thể tích, cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí, phân bố trong đất ẩm và nước [10]

 Azotomonas: Tế bào của Azotomonas có hình que tương tự như Azotobacter,

kích thước nhỏ hơn, tồn tại riêng rẽ hoặc tạo thành từng đám Chúng có khả năng sinh chất nhầy ngoại bào rất dai hoặc có chứa các thể lipoid hình cầu, sinh sắc tố huỳnh

quang màu trắng tan trong nước Azotomonas là vi khuẩn dị dưỡng carbon, sử dụng

nhiều loại đường, rượu, acid hữu cơ Thuộc chi này có nhiều loài khác nhau (như

Azotomonas agilis, Azotomonas macrocytogenes…) [6]

 Herbaspirillum: Vi khuẩn này được Doeberiner và cộng sự phát hiện năm 1987 Chúng có những đặc điểm giống Azospirillum nhưng kích thước lại nhỏ hơn, có thể có

tới 2 – 3 tiên mao ở một hoặc hai cực, phân bố nhiều ở vùng rễ cây Hòa thảo [10]

 Aquaspirillum: Chi này chỉ có hai loài có khả năng cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí là Aquaspirillum peregrinum và Aquaspirillum fasciculus, phân bố

trong nước, vận động nhờ tiên mao ở hai cực

 Clostridium: Là giống vi khuẩn kị khí sống tự do có khả năng cố định nitrogen

Tế bào có kích thước 2,5 – 7,5 × 0,7 – 1,3 µm, đứng riêng rẽ hoặc từng chuỗi ngắn Khi còn non tế bào chất đồng đều, có khả năng di động, khi về già tế bào chất có cấu

tạo hạt, tế bào mất khả năng di động Loài Clostridium pasteurianum thường có hoạt tính cố định nitrogen cao hơn các loài khác trong chi Clostridium Khi đồng hóa hết 1

g đường, chúng thường tích lũy khoảng 5 – 10 mg nitrogen Khả năng cố định nitrogen trong phạm vi pH 4,7 – 8,5 Các nghiên cứu ở Việt Nam, với các vùng đất

chua không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt

trong 5 giờ và 1 giờ ở 80oC, phân bố nhiều trong đất và bùn Đã có nhiều thí nghiệm

sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch nuôi cấy hoặc dịch nuôi trộn với

đất đã khử trùng) để bón cho cây, trong một số trường hợp đã thu được hiệu quả khá

cao (nhất là khi phối hợp sử dụng với azotobacterin) [6]

 Vi khuẩn quang năng cố định nitrogen: Đặc điểm chung cho nhóm vi khuẩn này

là sự tồn tại của chlorophyll hoặc các hợp chất carotene Ngoại trừ Cyanobacteria, nhóm vi khuẩn quang năng thực hiện quang hợp trong điều kiện kỵ khí, không giải phóng O2, cố định N2 trong điều kiện vi hiếu khí Các chủng đại diện có khả năng cố

định nitrogen thường gặp ở các họ Rhodospirillaceae và Chlorobiaceae [6], [7]

 Các nhóm vi khuẩn khác: Ngoài các đối tượng đã nêu trên, khả năng cố định nitrogen còn gặp ở một số loài thuộc họ Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Corynebacteriaceae, Methanomonadaceae, Thiobacteriaceae Tuy nhiên, khả năng cố

định nitrogen của chúng không lớn lắm

3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitrogen

Vai trò quan trọng nhất của vi khuẩn cố định nitrogen là cung cấp nitrogen cho cây trồng Trong thực tế thực vật (cũng như người và các loài động vật) không có khả

năng đồng hóa trực tiếp nitrogen không khí Bởi vì trong không khí, phân tử nitrogen tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử N lại với nhau nhờ liên kết ba rất bền (năng lượng của liên kết ba này là vào khoảng 255 Kcal/M) Vi khuẩn cố định nitrogen là tác nhân chuyển hóa nitrogen không khí thành nitrogen trong các dạng hợp chất mà cây hấp thu và chuyển hóa được

Trong công nghiệp phân hóa học chuyển hóa N2 thành các hợp chất của nitrogen (muối ammonium, urea, nitrate) cần tiêu tốn nhiều năng lượng Năng lượng cần thiết

để tổng hợp ra một tấn NH3 tương đương với năng lượng sinh ra khí đốt cháy 5 tấn than đá Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất phân nitrogen hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử N2 như cần nhiệt độ cao, áp suất cao và nhiều chất xúc tác đắt tiền Trong khi đó các vi sinh vật thực hiện cơ chế cố định nitrogen ngay trong các điều kiện bình thường về nhiệt

độ và áp suất Chính vì vậy mà vi sinh vật cố định nitrogen có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền sản xuất phân hóa học chưa phát triển [8]

Bên cạnh đó, vi khuẩn cố định nitrogen còn được biết đến với nhiều vai trò như:

 Kích thích sinh trưởng, phát triển của thực vật bằng cách tạo ra các enzyme hay các hormone thực vật

 Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, nơi cư trú hay tạo các kháng sinh, enzyme thủy phân chống lại sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ

 Giúp cây hấp thụ hiệu quả các ion sắt, kẽm và các nguyên tố vi lượng khác [24], [25], [26]

Nhiều công trình nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm vi khuẩn Azotobacter (gọi là azotobacterin) Đây là dịch nuôi Azotobacter được hấp thụ vào than bùn nhằm

nâng cao sản lượng cây trồng [6] Ở Liên Xô (cũ) người ta sử dụng khá nhiều

azotobacterin – một loại chế phẩm có chứa vi khuẩn Azotobacter chroococcum

Những tài liệu hướng dẫn hiện có về việc sử dụng azotobacterin đều cho rằng, nên sử dụng rộng rãi azotobacterin để cải thiện sinh trưởng của cây trồng Người ta coi chế phẩm này không chỉ là phân đạm mà còn là nguồn kích thích sinh trưởng của cây

Trong đất trồng rau hoặc trồng lúa, Azotobacter có thể làm tăng sản lượng đến 30%

[18] Trong điều kiện thuận lợi azotobacterin cố định được 10 – 30 mg nitrogen khi sử dụng hết 1 g đường [27] Sử dụng chế phẩm azotobacterin lây nhiễm cho đất trồng lúa, ngoài khả năng cung cấp nitrogen cho lúa và giảm sự tiêu thụ nitrogen của phân bón, chế phẩm này còn làm tăng độ phì nhiêu cho đất [28], [29]

Những tài liệu của Brantxevits (1963) và Sende S T (1965) về ảnh hưởng của

Azotobacter đến một số đặc điểm sinh hóa của cây cho biết, xử lý Azotobacter cho hạt

giống trước khi gieo đã làm tăng hoạt tính của các enzyme ascorbinoxydase, peroxidase, catalase và thể hiện mạnh nhất trong thời kì sinh trưởng đầu tiên của cây Những loại enzyme này là chỉ tiêu quan trọng về cường độ oxy hóa khử của cây, liên quan trực tiếp đến tính chống chịu của cây đối với nhiều loại bệnh Điều này đặt cơ sở

cho giả thiết rằng Azotobacter có tác dụng giảm tính mẫn cảm của cây đối với một số

bệnh do ảnh hưởng của nó đến cường độ các quá trình oxy hóa khử của cây [3], [15]

Một số nghiên cứu còn xác định, chế phẩm Azotobacter có tính diệt nấm và có khả năng kìm hãm sinh trưởng của nhiều nấm như Fusarium, Alternaria,

Penicillium…, những loài nấm này thường ảnh hưởng không tốt đến cây Azotobacter

có thể sản sinh một số chất ức chế một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thực vật Nhờ

đó, cây trồng có thể tăng sức chống chịu dịch bệnh, tăng sinh trưởng, phát triển và năng suất Các nghiên cứu còn cho thấy, những cây mọc từ hạt giống được tẩm vi

khuẩn Azotobacter chín sớm hơn, điều này có ý nghĩa đặc biệt khi trồng rau [7], [27]

II CƠ CHẾ CỐ ĐỊNH NITROGEN CỦA VI SINH VẬT

Trong một thời gian dài cơ chế của quá trình cố định nitrogen vẫn là một bí mật hấp dẫn của tự nhiên Trong khi con người phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao (400 – 500oC, 200 – 1000 atm) để phá vỡ liên kết ba trong phân tử N2 (có năng lượng là 9,4 x 105 J/Mol) thì các vi sinh vật cố định nitrogen lại có thể đồng hóa N2ngay trong các điều kiện rất bình thường về áp suất và nhiệt độ [2]

Quá trình cố định nitrogen của vi sinh vật là quá trình khử N2 thành NH3 với sự tham gia của phức enzyme hydrogenase hoạt hóa hydrogen và enzyme nitrogenase hoạt hóa nitrogen khi có ATP

Sơ đồ trung tâm hoạt động của nitrogenase được trình bày như sau:

Electron của các chất khử (ferredoxin, ditionit) đi vào trung tâm có chứa Fe của thành phần enzyme II (protein – Fe) và tiếp tục chuyển cho thành phần enzyme I

(protein – Fe – Mo) Electron đã được hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến

Mo ở bên trong Mo sẽ bị khử và có khả năng phản ứng nhanh chóng với N2 Phân tử

N2 đi qua một khe có kích thước 4 – 5 A0 tức là tương ứng với chiều dài của phân tử

N2 vào bên trong enzyme và được hoạt hóa ở đó

Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitrogen sẽ làm đứt hai liên kết trong phân tử N2 Năng lượng tiêu phí là 7,8 x 105 J/Mol Liên kết thứ

ba sẽ bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydrogen đã được hoạt hóa nhờ các enzyme dehydrogenase và hệ thống hydrogenase [2]

Cơ chế cố định nitrogen được thể hiện qua phương trình sau:

N2 + 6 H+ + 6 e- + 16ATP 2 NH3 + 16 ADP + 16 Pi

Để tạo 2 phân tử ammonium từ một phân tử N2 tiêu tốn 16 ATP cùng với sự cung cấp điện tử và proton H+ Phản ứng này chỉ xảy ra khi N2 gặp phức hệ nitrogenase Đầu tiên, Fe – protein bị khử do những điện tử được cho bởi ferredoxin Sau đó, Fe – protein này bị hoạt hóa bởi ATP và tiếp tục khử Mo – Fe – protein; từ đây nó sẽ nhường điện tử cho N2 tạo NH = NH Ngoài ra còn có hai chu trình khác thuộc quá trình này làm NH = NH bị khử thành H2N – NH2 và quay lại khử thành hai phân tử NH3 [31]

Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định nitrogen cho thấy quá trình này đòi hỏi:

 Có sự tham gia của enzyme nitrogenase Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này Enzyme này hoạt động trong điều kiện kỵ khí

 Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

 Có năng lượng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ Đậu thường có hiệu quả rất cao

 Tiến hành trong điều kiện kỵ khí

Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp NH3 tạo thành trong quá trình cố định nitrogen được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các keto acid để tổng hợp một cách nhanh chóng các

Nitrogenase

amino acid, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác [36]

III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITROGEN

1 Thời gian

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, mỗi vi khuẩn được đặc trưng bởi đường cong sinh trưởng khác nhau gồm 4 pha và thời gian của mỗi pha là không giống nhau ở các nhóm vi khuẩn khác nhau Vì vậy, tùy theo thời gian nuôi cấy mà ta thu được sinh khối hay mức độ sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn là khác nhau

Theo nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (1999), trong 24 giờ nuôi

cấy đầu tiên, Azotobacter hầu như không tăng trưởng Sau 36 giờ nuôi cấy, sinh khối

bắt đầu tăng lên Cả hai chủng A27 và A81 đều đạt mức sinh khối cực đại ở giờ nuôi thứ 72, sau đó sinh khối giảm nhanh chóng [14] Bên cạnh đó, Hansen và cộng sự (2007) khi nghiên cứu khả năng cố định nitrogen của hai chủng G115 và G161 thuộc

loài Enterobacter cloaceae đã xác định được sau 3 ngày thì khả năng cố định nitrogen

của chủng nghiên cứu là cực đại [22] Theo nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh và cộng

sự (2008), thời gian nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng và khả năng cố định nitrogen của

chủng vi khuẩn chủng BK – 6 thuộc chi Azotobacter phân lập từ đất tại phường Hòa

Quý, Quận Ngũ Hành Sơn, thành phố Đà Nẵng là 5 ngày [34] Tác giả Đỗ Kim Nhung

và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng cố

định của 12 dòng vi khuẩn Azospirillium sp cho thời gian tối ưu là 4 ngày nuôi cấy

[16]

2 Nhiệt độ

Theo nghiên cứu của Dobereiner J (1976) cho biết, nhiệt độ thích hợp đối với

cho biết, nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của Azospirillum là 26 – 28oC [5];

[9] Nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (1999), Azotobacter có biên độ

nhiệt khá rộng trong khoảng 27 – 33oC, chúng sinh trưởng tương đối chậm ở 25oC và hầu như không phát triển ở cận 20oC và cận 40oC Sinh khối cả 2 chủng A27 và A81 đều đạt cực đại ở 30oC [14] Kết quả nghiên cứu của Phạm Bích Hiên và Phạm văn

Toản (2003) cho thấy, hầu hết các loài Azotobacter chroococcum thử nghiệm đều có

khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 30oC Nhiệt độ thích hợp nhất

cho sự phát triển của Beijerinckia là khoảng 16 – 37oC, chúng có khả năng sống khá lâu ở 0oC hoặc các nhiệt độ thấp hơn nữa [7]

3 pH môi trường

Các điều tra ở Việt Nam cho biết, khi pH đất thấp hơn 5,5, sự phát triển của

Azotobacter bị hạn chế một cách rõ rệt Trong khi đó ở pH trung tính, số lượng Azotobacter luôn có hàng nghìn đến hàng vạn tế bào trên một gam đất khô Những

nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1979), Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự

(1980) đã xác định, pH thích hợp nhất với Beijerinckia là 4,5 – 6,0 Nhiều loài ngay ở

pH = 3 vẫn phát triển được nhưng khi pH = 7 sự phát triển của Beijerinckia bị ức chế

Nhìn chúng, đặc điểm của nhóm vi khuẩn này là khả năng chịu acid lớn, có thể sinh trưởng trên môi trường có pH từ 3,0 – 9,5 hoặc 10 [7]

Nhiều nghiên cứu cho biết, Azotobacter có thể phát triển được trên các môi

trường có pH khoảng 4,5 – 9,0 Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Bích Hiên và

Phạm Văn Toản (2003) thì Azotobacter chroococcum có khả năng sinh trưởng, phát

triển tốt ở pH 5,5 – 8,0 Tuy nhiên, quá trình cố định nitrogen chỉ thực hiện trong

phạm vi pH khá hẹp, từ 5,5 – 7,2, đôi khi đến 7,7 Các loài thuộc chi Azotobacter khác

nhau mẫn cảm một cách khác nhau đối với pH của môi trường Nhìn chung, đối với

vùng đất kiềm nhẹ, pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của Azotobacter là 7,2 – 8,2

Azotobacter thường ít gặp trong đất có pH thấp hơn 5,6 – 5,8 Cũng có thể phân lập từ

đất chua một số loài Azotobacter nhưng thường chúng đã mất khả năng cố định

nitrogen phân tử [6] Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), pH môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn Ở khoảng pH từ 6,5 – 7,0 chủng N145 sinh trưởng phát triển tốt và cực đại ở

pH 6,5 Khi pH lớn hơn 8, sinh khối vi khuẩn giảm mạnh [13]

4 Nguồn carbon và nitrogen

Phần lớn các chủng thuộc chi Azotobacter phân lập được từ thiên nhiên có khả

năng cố định trên 10 mg nitrogen khi tiêu thụ hết 1 g các hợp chất carbon Một số loài khác trong những điều kiện thích hợp có thể đồng hóa được 30 mg N/g đường Nhiều

nghiên cứu còn cho biết, khi phát triển chung với một số vi khuẩn khác, Azotobacter

sẽ có hoạt tính cố định nitrogen cao hơn so với khi nuôi cấy riêng lẽ

Về nguồn carbon, Azotobacter có thể đồng hóa nhiều loại đường (glucose,

saccharose, maltose, rỉ đường…), rượu và các hợp chất thơm (sodiumbenzoate, acid

benzoic…) Khả năng đồng hóa các nguồn carbon nói trên của Azotobacter là không

giống nhau, có chủng không có khả năng đồng hóa lactose, mannite hoặc sodium

benzoate Cũng như Azotobacter, Beijerinckia đồng hóa tốt các loại đường nhưng ít

đồng hóa acid hữu cơ và các hợp chất thơm [6] Tuy nhiên khi nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon lên sinh trưởng của vi khuẩn thì glucose là nguồn carbon thích hợp cho hầu hết các chủng vi khuẩn

Sự có mặt của muối ammonium hay nitrate trong môi trường sẽ làm hạn chế sự

cố định nitrogen của Azotobacter [6] Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1980) cho

biết, ngoài khả năng cố định nitrogen phân tử các chủng vi khuẩn còn có khả năng

đồng hóa muối ammonium, urea, nitrite, nitrate Azotobacter sẽ đem một phần

nitrogen đồng hóa được vào môi trường dưới dạng NH3, amino acid hoặc protein [7], [9]

5 Các khoáng chất

Những chất khoáng có ảnh hưởng không giống nhau đến sự sinh trưởng và phát

triển của đa số loài vi khuẩn cố định nitrogen Chính vì vậy, Azotobacter cũng như các

vi sinh vật khác đều mang những đặc điểm hoạt động khác nhau đối với những đặc điểm môi trường khác nhau

Azotobacter chịu ảnh hưởng rõ rệt của lượng phosphore trong môi trường

Những điều tra tại đất trồng lúa ở nước ta cho thấy, khi lượng P2O5 của đất đại tố

0,06% thì luôn thấy sự có mặt của Azotobacter, ngược lại khi P2O5 là 0,02% thì hầu như không phát hiện thấy chúng ở trong đất Bổ sung thêm lân vào đất có thể làm tăng

cường rõ rệt hoạt động cố định nitrogen của Azotobacter Một số nghiên cứu cho biết, hoạt tính cố định nitrogen của Azotobacter bắt đầu xảy ra ở nồng độ PO43- đạt đến 4 mg/100 ml môi trường Ngược lại, khi nồng độ PO43- đạt tới 800 mg/ml môi trường thì quá trình cố định nitrogen bị ngừng lại [6]

Ca cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của Azotobacter Những điều tra ở Việt

Nam cho thấy, trong đất có chứa lượng CaO cao hơn 0,4% luôn thấy sự có mặt một số

lượng lớn các tế bào Azotobacter Ngược lại, hầu như chúng không phát triển được

khi CaO dưới 0,25% Ý nghĩa sinh lý của Ca đối với Azotobacter thật ra vẫn còn chưa

được nghiên cứu một cách đầy đủ [6]

K cũng là một nguyên tố cần thiết đối với hoạt động của Azotobacter nhưng với

lượng tương đối ít Nếu đưa vào môi trường một lượng thừa K sẽ gây ức chế hoạt động

của Azotobacter

Mg được Azotobacter đòi hỏi cao hơn Fe khoảng 10 lần Một số nguyên tố

phóng xạ (Th, U…) ở nồng độ rất nhỏ có khả năng kích thích sự cố định nitrogen và

sinh trưởng của Azotobacter [6]

Các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với Azotobacter đáng chú ý hơn cả là Mo,

B, Mn,… Các nguyên tố này có tác dụng tăng cường sự phát triển của Azotobacter và

hoạt động cố định nitrogen của chúng Một số nghiên cứu cho biết nhu cầu Mo của

môi trường Mn làm tăng cường phát triển của Azotobacter, sự có mặt của Mn có thể

thay thế một phần sự có mặt của Mg [7] Tuy nhiên, một số nguyên tố vi lượng lại có

ảnh hưởng xấu đến hoạt động của Azotobacter Br ức chế quá trình cố định nitrogen,

Al hạn chế sự phát triển của Azotobacter, Cl có tác dụng độc đối với tế bào [6]

6 Độ thoáng khí

Vi khuẩn cố định nitrogen thuộc loại hiếu khí (Azotobacter, Beijerinckia,

Azospirillum…) nhưng cũng có thể phát triển được trong điều kiện vi hiếu khí Quá

trình cố định nitrogen của vi khuẩn bị giảm xuống khi thế oxy hóa khử của môi trường lên cao quá +200 mV hoặc thấp dưới -200 mV Như vậy, thông khí quá mạnh hay quá yếu cũng là ức chế quá trình cố định nitrogen của vi khuẩn Có thí nghiệm đã cho biết, khi nồng độ oxygen trong không khí là 4% thì quá trình cố định nitrogen vượt quá gấp

ba lần so với khi nồng độ oxygen là 10 – 20% [7]

7 Các yếu tố sinh học

Sinh trưởng, phát triển và cố định nitrogen của vi khuẩn trong đất còn chịu ảnh hưởng mật thiết của khu hệ sinh vật đất Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen (tổng hợp các chất hoạt động sinh học, phân giải các hợp chất hữu cơ bền vững…) còn có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của chúng (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh…) Một số nghiên cứu còn xác nhận vi khuẩn cố định nitrogen hiếu khí sống tự do

(Azotobacter, Beijerinckia…) có khả năng tổng hợp một số chất chống nấm có phổ tác dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicilium…) Khả năng tích lũy các chất chống

nấm này là không giống nhau ở các chủng vi khuẩn cố định nitrogen [6]

IV TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH NITROGEN

1 Đối với nền nông nghiệp

Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, đồng thời có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp sạch, bền vững sinh thái Do vậy, nghiên cứu sử dụng rộng rãi phân bón vi sinh vật trong nông nghiệp đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và phát triển Các loại phân bón sinh học có thể kể đến như phân nitrogen, phân phosphore, phân hữu cơ vi sinh, trong đó phân nitrogen đóng vai trò quan trọng nhằm bù đắp một lượng lớn dự trữ đạm cho đất [28]

Chế phẩm nitragin đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới như Liên Xô (cũ), Pháp, Mỹ, Trung Quốc Ở châu Âu, việc sử dụng chế phẩm này tăng sản lượng từ 7 đến 17 tạ/ha và cung cấp 24 kg nitrogen/ha (ở Tân Tây Lan, 1976) Ở Việt Nam, sử dụng nitragin đã làm tăng sản lượng từ 5 – 13,3 tạ/ha (ở Sơn La, 1977)

Còn phân nitrogen tự do kỵ khí như Clostridium hay hiếu khí (Azotobacter,

Beijerinckia, Azospirillum…) cũng được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi từ những

năm 1940 Cho đến nay, việc sử dụng chế phẩm ở Mỹ, Liên Xô, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản… có thể cung cấp cho đất và cây trồng 30 – 40 kg nitrogen/ha/năm [3]

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn cố định nitrogen Kết quả cho thấy, các chế phẩm không chỉ có tác dụng làm tăng năng suất cây trồng từ

6 – 20% mà còn có khả năng tiết kiệm 1 – 2 kg phân N/sào/vụ [17] Những nghiên

cứu của Nguyễn Ngọc Dũng (1995) sử dụng chế phẩm Azospirillum bón cho lúa thấy,

năng suất lúa tăng từ 5 – 25% [9] Theo Bạch Phương Lan và cộng sự (1997) khi bón chế phẩm azotobacterin cho cải xanh, chiều cao của cải tăng 1,75 cm/ngày, trong khi đối chứng chỉ tăng 1,46 cm/ngày Năng suất của cây Blendi khi sử dụng chế phẩm Azotobacterin đạt 9,9 tạ/ha so với bình thường là 5,6 tạ/ha [29] Khi lây nhiễm loài

Azospirillum lipoferum, năng suất lúa là 4,7 tạ/ha so với bình thường không bổ sung

chế phẩm là 4,0 tạ/ha [23]

2 Đối với rừng ngập mặn

Theo kết quả kiểm kê rừng toàn quốc thì diện tích rừng ngập mặn Việt Nam tính đến ngày 21/12/1999 là 156.608 ha Trong đó diện tích rừng ngập mặn tự nhiên là 59.732 ha, chiếm 38,1% và diện tích rừng ngập mặn trồng là 96.876 ha chiếm

61,95% Trong số diện tích rừng ngập mặn trồng ở Việt Nam, rừng đước (Rhizophora

apiculata) trồng chiếm 80.000 ha (82,6%), còn lại 16.876 ha là rừng trồng trang

(Kandelia obovata), bần chua (Sonneratia caseolaris) và các loại cây trồng ngập mặn

khác (17,4%) [20]

Ở Thừa Thiên Huế, hiện tại, rừng ngập mặn chỉ còn chưa đầy 8 ha, chủ yếu ở Rú Chá (Hương Phong, Hương Trà), Cù Du (Cảnh Dương, Phú Lộc), Tân Mỹ (Phú Vang), Đầm Lập An (Lăng Cô, Phú Lộc) Diện tích rừng ở địa bàn đang ngày càng thu hẹp chủ yếu do người dân khai thác cây ngập mặn đốn củi, lấy đất làm ao nuôi tôm, xây dựng các khu đô thị, khu nghĩ dưỡng [32]

Để chống biến đổi khí hậu, mở rộng diện tích rừng ngập mặn, bảo vệ các tuyến đường giao thông, ngăn mặn, giảm thiệt hại của thiên tai, bão lũ… đồng thời tăng cường giáo dục bảo vệ môi trường cho người dân, tỉnh Thừa Thiên Huế đã tiến hành những dự án để khôi phục rừng ngập mặn và bước đầu đạt những kết quả khả quan Năm 2010, Hội Lâm nghiệp tỉnh đã tiến hành trồng thử nghiệm nhiều loài cây ngập mặn khác nhau Sau hơn hai năm nghiên cứu, trên diện tích trồng thử nghiệm 0,5

ha cây ngập mặn tập trung tại đầm Lập An và trồng 500 cây ngập mặn phân tán tại khu vực Tân Mỹ với các loài như đước vòi, vẹt khang, mắm quăn đã cho kết quả khả quan về việc xác định trồng các loài cây này thích hợp với việc phục hồi thảm thực vật ngập mặn ở đây Riêng đối với diện tích có các ao nuôi thủy sản, việc trồng cây ngập mặn được thực hiện bằng 2 loài cây chủ yếu là đước vòi và vẹt khang để kết hợp mô hình ao nuôi sinh thái Đánh giá kết quả sau hơn 2 năm thực hiện trên diện tích 4.000

m2 cho thấy, tỷ lệ cây sống và cây phát triển đạt 75% Bên cạnh sự phát triển của cây ngập mặn, khu vực này được bồi đắp phù sa nhiều hơn 10 cm so với những khu vực xung quanh không trồng cây ngập mặn [30]

Nhóm chuyên gia trường Đại học Tohoku – Gakuin (Nhật Bản) cũng đã đến Huế, phối hợp với Sở Tài nguyên và Môi trường, Chi cục Biển, Đảo và đầm phá Thừa Thiên Huế tìm hiểu về dự án xây dựng khu bảo tồn rừng ngập mặn kết hợp phát triển

du lịch sinh thái dựa vào cộng đồng khu vực Rú Chá – Cồn Tè, thuộc xã Hương Phong, huyện Hương Trà [33]

Quỹ Quốc tế bảo vệ thiên nhiên (World Wide Fund For Nature – WWF) tại Việt Nam cũng đã tài trợ dự án viện trợ không hoàn lại “Tăng cường rừng ngập mặn góp phần thích ứng với biến đổi khí hậu và bảo tồn đa dạng sinh học vùng đầm phá ven biển Thừa Thiên Huế”, với tổng mức đầu tư hơn 700 triệu đồng, được thực hiện từ năm 2012 đến 7/2014 Mục tiêu của dự án nhằm góp phần thích ứng với biến đổi khí hậu thông qua hoạt động trồng cây ngập mặn và chuyển giao kỹ năng quản lí rừng bền vững cho người dân địa phương Một số hạng mục chính của dự án đã được triển khai như: các hoạt động truyền thông, tập huấn cho nông dân về sản xuất giống cây, trồng, chăm sóc và quản lý rừng ngập mặn; xây dựng sổ tay hướng dẫn kỹ thuật về trồng, chăm sóc, quản lý rừng ngập mặn; xây dựng một vườn ươm cây giống và thiết lập công cụ theo dõi, quản lí theo dõi bằng internet [33]

Một trong những hướng phát triển, mở rộng rừng ngập mặn là thực hiện ươm, nhân, gây trồng Với đặc thù nền đất rừng ngập mặn nghèo dinh dưỡng và vi sinh vật, việc đưa vi khuẩn cố định đạm vào cây con trong vườn ươm giúp cây tăng khả năng chuyển hóa nitrogen thành các dạng cần thiết cho sinh trưởng, phát triển, tăng kích thước thân, cành, lá và bộ rễ, góp phần tăng khả năng chống chịu sâu bệnh Bên cạnh

đó, khi được đưa xuống môi trường nước phú dưỡng, bộ rễ phát triển lại giúp cây tăng khả năng hấp thụ phosphore vì thế kích thích bộ rễ phát triển mạnh hơn; dẫn đến tăng sinh trưởng, phát triển cho cây một cách nhanh chóng, đồng thời tăng khả năng bám chắc vào đất, tạo tính cố kết cho rừng trồng Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn cố định nitrogen mạnh không những có ý nghĩa trong việc kích thích sự nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng và phát triển của cây con trong vườn ươm

mà còn đảm bảo là các chủng nội địa, thích ứng và phát huy tốt trong môi trường đất ngập mặn; góp phần trong công cuộc phục hồi và mở rộng diện tích rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế nói riêng và Việt Nam nói chung

Phần 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen phân lập từ đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế

Phạm vi thu mẫu: Đất rừng ngập mặn ở Cồn Tè, Rú Chá – Hương Phong, Hương Trà; Tân Mỹ – thị trấn Thuận An, Phú Vang

Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2014 đến tháng 5/2014

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phân lập: Cân 1 g mẫu đất hòa tan vào bình tam giác chứa 9 ml nước vô trùng

rồi lắc đều, ta được độ pha loãng 10-1 Tiếp tục hút 1 ml dung dịch này cho vào các ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng lắc đều, ta được độ pha loãng 10-2

Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đạt được độ pha loãng cần thiết (tùy theo mật độ vi sinh vật

có trong mẫu) Dùng pipette 1 ml hút 1 giọt mẫu ở các độ pha loãng rồi nhỏ lên bề mặt thạch đĩa có chứa sẵn môi trường Ashby, dùng que gạt vô trùng gạt đều mẫu trên mặt đĩa Mỗi độ pha loãng phân lập 3 – 5 đĩa petri Sau đó bao gói và nuôi trong tủ ấm

ở nhiệt độ thích hợp (28 – 30oC)

Giữ giống: Sau 4 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyền sang

môi trường thạch nghiêng chứa môi trường có thành phần như môi trường phân lập Sau khi giống mọc tốt đem bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 – 8oC để giữ giống

1.2 Đếm số lượng tế bào vi khuẩn

Để xác định số lượng tế bào trong mẫu, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa

Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi

trường thạch và sau đó đếm khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc

là kết quả của sự phát triển từ một tế bào hay bào tử

Xác định số lượng vi khuẩn trong 1 g mẫu theo công thức:

Trong đó: Nk : CFU/gam đất (khô tuyệt đối)

n : Số khuẩn lạc/đĩa petri

p : Số giọt/ml

q : Độ pha loãng

k : Khối lượng khô tuyệt đối của 1 g mẫu đất

Để tăng độ chính xác, thông thường giá trị n được lấy trung bình từ 3 đĩa petri trở lên

2 Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng [12]

 Quan sát khuẩn lạc: Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby thạch đĩa

ở nhiệt độ 30o

C trong 4 ngày, quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc và sự tạo thành sắc tố…

sang ống thạch nghiêng chứa môi trường có thành phần như môi trường phân lập Sau

4 ngày nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, quan sát và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

 Quan sát hình thái tế bào: Sử dụng phương pháp làm tiêu bản nhuộm đơn

Quan sát tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi quang học ở vật kính ×100

Tiến hành: Cho một giọt nước cất vô trùng lên phiến kính sạch Dùng que cấy vô

trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống giống hòa vào giọt nước trên phiến kính Dàn mỏng vi khuẩn thành vết bôi rồi cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm tiêu

bản bằng thuốc nhuộm Fushin 1 – 2 phút Rửa nhẹ tiêu bản bằng nước cho đến khi không thấy màu thuốc nhuộm chảy ra nữa, làm khô tiêu bản, quan sát ở vật kính ×100

3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen

3.1 Nuôi cấy thạch đĩa

Để xác định khả năng cố định nitrogen của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trực tiếp trên môi trường Ashby thạch đĩa

Tiến hành: Dùng que cấy lấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng cấy chấm vào

những điểm xác định trên đĩa petri trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy ở 30oC Sau 4 ngày, đo kích thước, độ dày khuẩn lạc và đánh giá khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn

3.2 Nuôi cấy lắc

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) vi khuẩn trong môi trường Ashby dịch thể, với lượng tế bào cấy vào mỗi bình thí nghiệm là 5 ml dịch huyền phù/50 ml môi trường Sau 4 ngày nuôi cấy tiến hành lọc bằng máy hút chân không để thu sinh khối

và thu dịch lọc Phần sinh khối tươi cho vào đĩa petri có giấy lọc (đã xác định trọng lượng trước), rồi tiến hành sấy khô tuyệt đối để xác định sinh khối khô Phần dịch lọc được sử lý để hàm lượng N – NH4+ bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler

Phương pháp so màu thuốc thử Nessler [1]:

Lấy 50 ml dịch nuôi cấy cho vào bình định mức 100 ml Thêm 1 ml dung dịch ZnSO4 10% và 0,5 ml dung dịch NaOH 25% vào dịch nuôi cấy Định mức đến 100 ml bằng nước cất (không chứa N), trộn đều hỗn hợp Để yên ít phút, sau đó đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút ở 15oC Loại bỏ phần kết tủa, thu 50 ml dịch trong, cho 2 -3 giọt dung dịch muối Rochelle 50% và 3 ml thuốc thử Nessler, trộn đều hỗn hợp, để yên Sau 30 phút chuyển hỗn hợp qua cuvette thủy tinh và đo trên máy so màu ở bước sóng 425 nm Hàm lượng N - NH4+ được xác định dựa vào đồ thị chuẩn được xây dựng ở bước sóng 425 nm

4 Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển

4.1 Ảnh hưởng của thời gian

Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển và khả năng cố định nitrogen của chủng vi khuẩn, cho 5 ml dịch huyền phù chứa giống vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường Ashby dịch thể tiến hành nuôi cấy lắc Sau các

khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120, 140, 168 giờ thu dịch mẫu, lọc, sấy và cân sinh khối khô, xác định hàm lượng N – NH4+

4.2 Ảnh hưởng của pH

Để xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển và khả năng cố định nitrogen của vi khuẩn, cho 5 ml dịch huyền phù chứa giống vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường Ashby dịch thể với các mức pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 tiến hành nuôi cấy lắc ở thời gian thích hợp pH ban đầu được điều chỉnh bằng dung dịch đệm Sorensen 0,133 M Sau khi nuôi cấy, lọc, sấy và cân sinh khối khô, xác định hàm lượng N – NH4+

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Để xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển và khả năng cố định nitrogen của vi khuẩn, cho 5 ml dịch huyền phù chứa giống vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường Ashby dịch thể có bổ sung NaCl ở các nồng độ 6, 12, 18,

24, 30‰ tiến hành nuôi cấy lắc Nuôi cấy với thời gian, pH thích hợp Sau khi nuôi cấy, lọc, sấy và cân sinh khối khô, xác định hàm lượng N – NH4+

4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Để tìm hiểu ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng, phát triển và khả năng

cố định nitrogen của vi khuẩn, cho 5 ml dịch huyền phù chứa giống vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường Ashby dịch thể nhưng thay thế glucose bằng các nguồn saccharose, maltose, lactose, tinh bột, rỉ đường tiến hành nuôi cấy lắc Nuôi cấy ở thời gian, pH và nồng độ muối thích hợp, lọc, sấy và cân sinh khối khô, xác định hàm lượng N – NH4+

4.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Để tìm hiểu ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng, phát triển và khả năng cố định nitrogen của vi khuẩn, cho 5 ml dịch huyền phù chứa giống vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường Ashby dịch thể có bổ sung thêm các nguồn nitrogen như NaNO3, KNO3, urea, gelatine, peptone, cao thịt tiến hành nuôi cấy lắc với thời gian,

pH, nồng độ muối, nguồn carbon thích hợp Sau khi nuôi cấy, lọc, sấy và cân sinh khối khô, xác định hàm lượng N – NH4+

5 Bố trí thí nghiệm thăm dò hoạt lực của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen

Thí nghiệm được tiến hành tại vườn ươm thuộc Khoa Sinh học – Trường Đại

học Khoa học Huế, trên đối tượng là cây vẹt (Bruguiera gymnorrhiza) được trồng

 Chiều cao cây (cm) được xác định bằng phương pháp đo từ gốc đến ngọn

 Số lá/cây được xác định bằng phương pháp đếm tại thời điểm thu mẫu

III XỬ LÍ SỐ LIỆU

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Số liệu được xử lí bằng phương pháp thống kê sinh học theo chương trình Microsoft Excel 2007

Phần 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

I PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITROGEN

Từ 15 mẫu đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế chúng tôi tiến hành phân lập được 95 chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Số lượng vi khuẩn cố định nitrogen trong các mẫu đất phân lập

STT Kí hiệu

mẫu Địa điểm lấy mẫu Nền đất Thảm

thực vật

pH đất

CFU/g đất khô (106)

4 D4 Tân Mỹ 1 – Phú Vang Khô Giá 4,75 31,5

5 D5 Tân Mỹ 2 – Phú Vang Bán ngập Quau

Ghi chú: CFU (Clolonie Forming Unit)

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, số lượng vi khuẩn cố định nitrogen có sự biến động lớn ở các địa điểm thu mẫu, số lượng vi khuẩn lớn nhất là ở mẫu D4 là vùng đất khô, dưới gốc cây giá tại rừng ngập mặn Tân Mỹ (31,5 × 106

CFU/g đất khô) Số lượng vi khuẩn nhỏ nhất ở mẫu D15 là vùng đất ngập, dưới gốc chá tại rừng ngập mặn Rú Chá

(0,4 × 106 CFU/g đất khô) Tại một vùng thu mẫu, số lượng vi khuẩn cố định nitrogen

ở các mẫu đất khô là lớn nhất Ở đất bán ngập số lượng vi khuẩn thấp hơn so với vùng đất khô nhưng sự chênh lệch là không lớn lắm (từ 0,78 đến 3 lần) Ở đất ngập số lượng vi sinh vật thấp nhất và có sự chênh lệch cao so với đất khô và đất bán ngập Chênh lệch số lượng vi khuẩn giữa đất khô và đất ngập cao nhất là 25,5 lần, thấp nhất

là 4 lần Điều này chứng tỏ được sự ảnh hưởng của độ thoáng khí đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen Ở những nơi có độ thoáng khí lớn (đất khô, bán ngập) thì số lượng vi khuẩn cao, còn ở những nơi có độ thoáng khí thấp (đất ngập) thì số lượng vi khuẩn thấp thậm chí là rất thấp Số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cao nhất ở rừng ngập mặn Tân Mỹ (trung bình 2 đợt thu mẫu là 31,26 × 106 CFU/g đất khô), sau đó đến rừng ngập mặn Rú Chá (trung bình 2 đợt thu mẫu là 25,35 × 106CFU/g đất khô) và thấp nhất là rừng ngập mặn Cồn tè (17,2 × 106

CFU/g đất khô) Điều này chứng tỏ, sự đa dạng của vi khuẩn còn phụ thuộc vào đặc điểm của khu vực rừng ngập mặn thu mẫu Sự khác biệt đó có thể bắt nguồn từ những đặc điểm riêng biệt của đất về thổ nhưỡng (không khí, nước, chất hữu cơ, chất vô cơ…)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về số lượng vi khuẩn cố định ở rừng ngập mặn thấp hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hương Xuân (2005) trên nền đất canh tác bạc màu Theo nghiên cứu của Lê Thị Hương Xuân, số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cao nhất đạt 265,5 × 106 CFU/g đất khô ở đất canh tác bạc màu tại Thủy Biều 1, thấp nhất là 3,3 × 106 CFU/g đất khô ở Quảng Lợi Có thể do đất canh tác tuy bạc màu nhưng tính chất hóa lí đặc biệt là độ thoáng khí tốt hơn ở đất ngập mặn nên sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen mạnh hơn Điều này một lần nữa chứng tỏ được ảnh hưởng to lớn của các điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen

Từ các mẫu đất, chúng tôi phân lập được 95 chủng vi khuẩn cố định nitrogen, kí hiệu là M1, M2, M3… M95 Dựa vào đặc điểm hình thái chúng tôi chia đối tượng thành các nhóm như sau:

 Nhóm thứ nhất: Khuẩn lạc màu trong suốt, bề mặt trơn bóng (hoặc nhầy nhớt), tròn đều (hoặc méo), mép đều (hoặc không đều) Vi khuẩn này tìm thấy ở hầu hết các đất rừng ngập mặn

 Nhóm thứ hai: Khuẩn lạc màu đục sữa, bề mặt trơn bóng (hoặc nhầy nhớt), tròn đều (hoặc méo), mép đều (hoặc không đều) Vi khuẩn này tìm thấy ở hầu hết các đất rừng ngập mặn

 Nhóm thứ ba: Khuẩn lạc màu đục sữa, bề mặt trơn bóng, méo, tương đối dày, mép không đều, bao quanh khuẩn lạc là vùng trong suốt Vi khuẩn này phát hiện chủ yếu ở rừng ngập mặn Cồn Tè – Hương Phong

 Nhóm thứ tư: Khuẩn lạc màu vàng nhạt (hoặc vàng đậm), bề mặt trơn bóng (hoặc nhầy nhớt), tròn đều (hoặc méo), mép đều (hoặc không đều) Vi khuẩn này phát hiện ở rừng ngập mặn Cồn Tè – Hương Phong, Tân Mỹ – Phú Vang

 Nhóm thứ năm: Khuẩn lạc màu hồng (hoặc hồng cam), bề mặt trơn bóng (hoặc nhầy nhớt), tròn đều (hoặc méo), mép đều (hoặc không đều) Vi khuẩn này phát hiện ở rừng ngập mặn Rú Chá – Hương Phong, Tân Mỹ – Phú Vang

II ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITROGEN

1 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen

Để đánh giá tốc độ sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng cố định nitrogen của các chủng vi khuẩn phân lập, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chúng trên môi trường Ashby thạch đĩa Trong điều điện nuôi cấy không chứa nitrogen dưới dạng hợp chất

có thể hấp thu được, các chủng vi khuẩn muốn tồn tại, phát triển phải có khả năng cố định N2 không khí để sử dụng Dựa vào bề dày và kích thước khuẩn lạc, đánh giá khả năng cố định nitrogen của các chủng vi khuẩn Kết quả trình bày ở bảng 3.2 và phụ lục 2, 3

Bảng 3.2 Năng lực sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập

Qua bảng 3.2 ta nhận thấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen trên môi trường là không đều Số chủng vi khuẩn không mọc

và sinh trưởng, phát triển yếu chiếm tới 37,89%, sinh trưởng và phát triển trung bình chiếm số lượng lớn hơn (43,16%) Số chủng vi khuẩn sinh trưởng, phát triển mạnh là 12,63% và rất mạnh chỉ 6,32% Trong số 95 chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen, chúng tôi chọn ra 6 chủng có kích thước và bề dày lớn nhất để tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính mạnh nhất

2 Tuyển chọn bằng nuôi cấy dịch thể

Để tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen mạnh, chúng tôi chọn 6 chủng có kích thước và bề dày lớn nhất để tiếp tục nuôi cấy lắc trong môi trường dịch thể Ashby với lượng giống đưa vào là 5ml dịch huyền phù tế bào vi khuẩn/50 ml môi trường (cùng mật độ quang) Sau 4 ngày, xác định sinh khối khô và hàm lượng N – NH4+ của dịch nuôi cấy Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen

Chủng vi khuẩn Sinh khối khô

(mg/ml)

Hàm lượng N – NH4+

(mg/l)

pH môi trường sau nuôi cấy

độ muối, nguồn carbon, nguồn nitrogen… đến sự sinh trường, phát triển của vi khuẩn

III ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN

1 Chủng M54

Chủng vi khuẩn M54 được nuôi cấy trên môi trường Ashby thạch đĩa, hình thái khuẩn lạc có đặc điểm như sau: khuẩn lạc nhầy, trong suốt, tròn, mép đều, dày, không tiết sắc tố ra môi trường Đường kính khuẩn lạc đạt 11 mm sau 4 ngày nuôi cấy Sau 7 ngày nuôi cấy, môi trường thạch chuyển sang màu vàng

Trong điều kiện nuôi cấy lắc môi trường Ashby dịch thể, chủng M54 phát triển làm dịch nuôi cấy từ dạng lỏng chuyển sang dạng quánh sệt

Quan sát tiêu bản nhuộm đơn chủng M54: tế bào có hình bầu dục, nằm riêng rẽ

Trong điều kiện nuôi cấy lắc môi trường Ashby dịch thể, chủng M85 phát triển làm dịch nuôi cấy từ dạng lỏng chuyển sang dạng quánh sệt

Quan sát tiêu bản nhuộm đơn chủng M85: tế bào vi khuẩn có hình bầu dục, nằm từng đám khoảng 5 – 50 tế bào hay cũng có khi nằm riêng rẽ

1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng vi khuẩn M54 và M85 trong môi trường Ashby dịch thể Lượng giống vi khuẩn là 5ml/ 50 ml dịch nuôi cấy Kế thừa các nghiên cứu trước về vi khuẩn cố định nitrogen: kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hương Xuân (2005), thời gian nuôi cấy tối ưu của chủng N130 và N545 là

72 giờ [21]; kết quả của Nguyễn Viết Trường (2013), thời gian nuôi cấy tối ưu cho chủng N27 là 120 giờ [19] Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn và sau các khoảng thời gian 72, 96, 120, 144, 168 giờ tiến hành xác định sinh khối khô và hàm lượng N – NH4+

tạo thành Kết quả được trình bày ở bảng 3.4, hình 3.3.a và 3.3.b

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và khả năng cố

định nitrogen của vi khuẩn

Chủng

vi khuẩn

Thời gian (giờ)

Sinh khối khô (mg/ml)

Hàm lượng N – NH4+

(mg/l)

pH môi trường sau nuôi cấy

có sự biến thiên hàm lượng N - NH4+ cao hơn chủng M85

Trong quá trình nuôi cấy, sự sinh trưởng, phát triển và hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn cố định nitrogen làm cho pH môi trường có chiều hướng giảm xuống, từ

pH kiềm 7 – 7,5 xuống còn 6,03 – 6,89 Tuy nhiên, pH vẫn nằm ở khoảng gần kiềm nên ít ảnh hưởng đến hoạt động cũng như sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Mặc

dù vậy, trong quá trình nuôi cấy cần theo dõi, kiểm tra pH môi trường và có sự điều chỉnh thích hợp để không làm ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn và thu được các kết quả tốt

Hình 3.3.a Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối của vi khuẩn

Hình 3.3.b Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tích lũy N - NH 4 + trong môi trường

cấy vào là 5 ml dịch tế bào/50 ml môi trường Xác định sinh khối khô và hàm lượng N – NH4+ được tạo thành Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.4.a, 3.4.b

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và khả

năng cố định nitrogen

Chủng vi

khuẩn

pH môi trường

Sinh khối khô (mg/ml)

Hàm lượng N – NH4+

(mg/l)

pH môi trường sau nuôi cấy

M54

5,0 0,68 ± 0,02 0,97 ± 0,01 4,87 5,5 0,70 ± 0,04 1,72 ± 0,14 5,23 6,0 0,74 ± 0,03 1,12 ± 0,04 5,92 6,5 0,82 ± 0,05 0,64 ± 0,08 6,27 7,0 0,89 ± 0,04 0,73 ± 0,09 6,79 7,5 1,13 ± 0,08 1,75 ± 0,04 6,91

8,0 1,16 ± 0,06 2,34 ± 0,15 6,67

M85

5,0 0,63 ± 0,04 2,20 ± 0,11 4.91 5,5 0,69 ± 0,03 2,25 ± 0,21 5,39 6,0 0,74 ± 0,02 2,32 ± 0,08 5,87 6,5 0,84 ± 0,03 1,62 ± 0,03 6,36 7,0 0,93 ± 0,06 1,72 ± 0,12 6.52

7,5 1,09 ± 0,07 1,56 ± 0,23 6,89

8,0 0,98 ± 0,05 1,85 ± 0,19 6,68

Qua bảng 3.5 ta thấy, giá trị pH khác nhau thì sinh trưởng, phát triển và khả năng

cố định nitrogen của các chủng M54 và M85 là khác nhau Sinh khối tích lũy của hai chủng M54 và M85 tăng dần từ pH 5,0 đến 7,5 và thích hợp với khoảng pH rộng từ 5,0 đến 8,0 Sinh khối cực đại tích lũy được của chủng M54 là 1,16 mg/ml tại pH = 8,0 và chủng M85 là 1,09 tại pH = 7,5 Hàm lượng N – NH4+ tạo thành có sự biến động rõ rệt trong khoảng pH từ 5,0 đến 8,0 Hàm lượng N – NH4+ tạo thành cao nhất của chủng M54 là 2,34 mg/l tại pH = 8,0; của chủng M85 là 2,32 mg/l tại pH = 6,0 Điều này chứng tỏ, vi khuẩn cố định nitrogen sinh trưởng và phát triển mạnh ở khoảng pH kiềm (7 đến 8) Nhưng chúng có khả năng đồng hóa nitrogen không khí ngay ở điều kiện pH thấp (5 đến 6,5) pH đo được tại các địa điểm thu mẫu trong khoảng từ 4,5 đến 6,5; là khoảng pH không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển

của chúng Điều này có thể giải thích vì sao trong đất rừng ngập mặn, vi khuẩn cố định nitrogen lại phát triển yếu hơn những loại đất khác

Hình 3.4.a Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tích lũy sinh khối của vi khuẩn

Hình 3.4.b Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tích lũy N – NH 4 + trong môi trường

3 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl bổ sung)

Để xác định ảnh hưởng của nồng độ muối môi trường đến sinh trưởng phát triển

sự tích lũy N – NH4+, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường Ashby dịch thể có bổ sung muối NaCl với các nồng độ là 0, 6, 12, 18, 24, 30‰ sau 96 giờ nuôi cấy ở pH = 7,5 Lượng giống cấy vào là 5 ml dịch tế bào/50 ml môi trường Sau khi nuôi cấy, tiến hành xác định sinh khối khô và hàm lượng N – NH4+

được tạo thành Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.5.a, 3.5.b

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển

và khả năng cố định nitrogen

Chủng vi

khuẩn

Nồng độ muối (‰)

Sinh khối khô (mg/ml)

Hàm lượng N – NH4+

(mg/l)

pH môi trường sau nuôi cấy

Sinh khối tích lũy của 2 chủng tăng dần với các nồng độ muối từ 0 - 12‰ Sinh khối cực đại tích lũy được của chủng M54 là 2,6 mg/ml tại nồng độ muối 18‰ và chủng M85 là 2,2 mg/ml tại nồng độ muối là 12‰ Với nồng độ muối từ 24‰, sinh khối tích lũy có chiều hướng giảm dần