TRUONG DAI HQC SU PHAM HA NỌI 2
KHOA HOA HOC He i oe He ee Đo Cg 2s He ae ei ee
NGUYEN THI THU TRANG
NGHIEN CUU THANH PHAN LIGNAN
CUA CAY LA MONG TAY
(LAWSONIA INERMIS L.) KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Chuyén nganh: Hoa Hitu Co
HA NOI - 2010
Trang 2
TRUONG DAI HQC SU PHAM HA NOI 2
KHOA HOA HOC He Hoe Hee geo Cag He He ae ie
NGUYEN THI THU TRANG
NGHIEN CUU THANH PHAN LIGNAN
CUA CAY LA MONG TAY (LAWSONIA INERMIS L.)
KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC
Chuyén nganh: Hoa Hitu Co
Người hướng dẫn khoa học ThS NGUYEN XUAN CUONG HA NOI - 2010
Trang 3
LỜI CÁM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp của em được hoàn thành tại Viện Hoá học các
hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Em xin bày tô sự cảm ơn chân thành tới Thạc Sĩ Nguyễn Xuân Cường, người đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận này
Em xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng Hoá Hữu Cơ - Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu tại Viện
Em cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn TS Nguyễn Văn Bằng và các giảng viên trong khoa Hoá học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Trang 5MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
DANH MUC CAC HINH VE VA BANG BIEU
Trang
MỞ ĐẦUU 252: 22222 2222111 2222111 1.21111220111111 re 1
CHUONG 1: TÓNG QUAN 55c eEkeEEerkerkesrkerkeree 3 1.1 Tổng quan về cây Lá móng tay 2- 2 ©z++z++e+cxeccxecrx 3 1.1.1 Đặc điỂm thực vật -c- c- sskkeEkeEkeEekerkerkerkerkerxeee 3 1.1.2 Phân bó, sinh thái -ccccccccrrrrrrrrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrree 4 1.1.3 Bộ phận dùng 5 «Sàn re, 4 1.1.4 Thành phần hoá học . 2- 2 s¿©++£+++£x++zvesrrsrrreee 5 1.1.5 Tính vỊ, công năng - + +5 xxx kEsekseseerreerse 8 I9 ng 8 1.1.7 Một số bài thuốc từ cây Lá móng tay -+- 9 1.2 Vài nét về hợp chất Lignan -s+©e+©cxe+ccxevcrsesrsecee 9
1.2.1 Đại cương và phân lOạI - - c++xsxscsxeseereeeerree 9 1.2.2 Các dẫn xuất quan trọng của Lignan . - 12
1.2.3 Tổng hợp Lignan 2- 2 +++2EE+£EEeEEEvEEErrrkrrrerrrree 14
1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật -. cc+c5c+¿ 18 1.3.1 Chọn dung môi chiẾt 2-22 s2e£EE+EEEvEEerrrerrrree 18
1.3.2 Quá trình ChiẾt -cccccctttEEkkiirrrirtrirrrrriiirre 21
Trang 6
1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 22 1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 22 1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí - c2 c5z+cszcce+ 23 1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí -¿-csc- 23 1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất 00s 25
1.5.1 Phố hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IÑ) 26 1.5.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, ẢS) 26 1.5.3 Phố cộng hưởng từ hạt nhan (Nuclear Magnetic Resonance
SpD€CfTOSCOJDY, ÌNÌMIẮ) 5 s5 vn nh nh HH Hư kg 27
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 30 2.1 Mẫu thực vật 30 2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 30 2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TC) .-¿-©2¿©25£++£+E£+£xevrxevrxerreee 30 2.2.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế 2- 52s +Ee+se+rxe+xeee 30 2.2.3 Sắc kí cột (CC) -c-ck tt E1 E11111211111 1111111 Excrxee 30
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chắt 31
2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) -2- 55c cScccccterterrkerreerreee 31 2.3.2 Phố khối lượng (ESI-MS) -2¿©:cc©c+ecccxevcrecee 31
2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) -. +- 31
2.3.4 Độ quay CỰC [Ì]bp - + xe, 31
Trang 8[œ]p BC NMR 'H NMR 'H-'H COSY 2D-NMR CC DEPT EI-MS FAB-MS HMBC HSQC HR-FAB-MS IR MS NOESY TLC
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
D6 quay cuc Specific Optical Rotation Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phố cộng hưởng từ hạt nhan proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 'H-'H Chemical Shift Correlation Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR
Sắc ký cột Columm Chromatography
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Connectivity Heteronuclear Single Quantum Coherence
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bomb ardment Mass Spectrometry
Phé héng ngoai Infrared Spectroscopy
Nhóm metyl
Phố khối lượng Mass Spectroscopy Nucler Overhauser Effect Spectroscopy
Sắc ký lớp mong Thin Layer Chromatography
Trang 9
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIÊU
Trang Hình 1.1: Cây Lá móng tay (Lawsonia inermis L.)
Hình 1.2: Quả và Hoa của cây Lá móng tay 4
Hình 3.1: Qui trình chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất từ cây Lá móng tay 33 Hình 4.1.1: Phố 'H-NMR của 1 36 Hình 4.1.2: Phố 'H-NMR dãn rộng của 1 37 Hình 4.1.3: Phố 'C-NMR của 1 37 Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học của 1 38 Hình 4.1.5: Phố ''C-NMR và các phố DEPT của 1 40 Hình 4.1.6: Phổ HSQC của 1 41 Hình 4.1.7: Phố HMBC của 1 42 Hình 4.1.8: Các tương tác HMBC chính của 1 42 Hình 4.1.9: Phố khối lượng ESI-MS của 1 43 Hình 4.2.1: Phố 'H-NMR của 2 44 Hình 4.2.2: Phố 'H-NMR dãn rộng của 2 44 Hình 4.2.3: Phố 'C-NMR của 2 45
Hình 4.2.4: Phố 'C-NMR và các phô DEPT của 2 45
Hình 4.2.5: Cấu trúc hóa học của 2 47
Trang 10[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]
Nguyễn Thị Thu Trang 10 K32C-Khoa Hóa Học
TAI LIEU THAM KHAO
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn
Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập và
Trần Toàn Cây (huốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà
xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tập II, trang 130-133
(2004)
Bhardwaj D K., Murari R., Seshadri T R., Singh R.,
Lacoumarin from Lawsonia inermis Phytochemistry, 15(11), 1789 (1976)
Bhardwaj D K., Seshadri T R., Singh R., Xanthones from
Lawsonia inermis Phytochemistry, 16, 1616-1617 (1977)
Bhardwaj D K., Jain R K., Jain B C., Mehta C K., 1-Hydroxy- 3,7-dimethoxy-6-acetoxyxanthone, a new xanthone from
Lawsonia inermis Phytochemistry, 17 1440-1441 (1978)
Chakrabartty T., Poddar G., Pyrek J S., Isolation of
dihydroxylupene and dihydroxylupane from the bark of
Lawsonia inermis Phytochemistry, 21(7), 1814-1816 (1982)
Takeda Y., New phenolic glucoside from Lawsonia inermis
Journal of Natural Products, 51(4), 725-729 (1988)
Gupta S., AliM., Sarwar A.M., NiwaM., Sakai T., 240x-
ethylcholest-4-en-3ox-ol from the roots of Lawsonia inermis
Phytochemistry, 31(7), 2558-2560 (1992)
Gupta S Ali M., Alam M A., A napthoquinone from Lawsonia
Trang 11[9] Siddiqui B S., Kardar M N., Triterpenoids from Lawsonia alba Phytochemistry, 58, 1195-1198 (2001)
[10] Siddiqui B S., Kardar M N., Ali S T., Khan S., Two new and a
known compound from Lawsonia inermis., Helvetica Chimica Acta, 86, 2164-2169 (2003)
[II] Deyama T The constituents of Eucommia ulmoides Oliv I
Isolation of (+)-medioresinol di-O-£-D-glucopyranoside
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 31, 2993-2997 (1983)
[12] Vermes B., Seligmann O., Wagner H Synthesis of biologically active tetrahydro-furofuranlignan-(syringin, pinoresinol)- mono- and bis-glucosides Phytochemistry, 30(9), 3087-3089 (1991) [l3] Peter J Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from
Desfontainia spinosa, Phytochemistry, Vol.25(8), pp 1939-1944 (1986)
[14] D.A Whiting, Nat Prod Rep., Vol.2, pp 191-212 (1985)
[15] O.R Gottlieb, Fotshr, Chem Org Naturst, Vol 35, pp 1-72 (1978)
[16] K Miki and Sasaya, Mokuzai Gakkaishi, Vol 25 (1979)
[17] Lida T., Ichino K., and Itok , Phytochemistry, Vol.21, pp 1939-
1941 (1982)
[18] Kim Y.K., Ryu S.Y, Plata Medica, Vol 65, pp 291-292 (1999)
[19] K.V.Sarkanen and A.F.A Wallis, J Chem, Soc Perkin Trans I,
pp 1869-1878 (1973)
[20] Goad J.L and Akihisa T., Aanalysis of sterols, Blackie Academic and Professional Pub., First edition, pp 378 (1997)
[21] Markham K.R., Ternai B., Stanley R., Geige H and Mabery T.J,
Tetra hadron, Vol 34, pp 1389-1392 (1978)
Trang 12
[22] R.S.Ward, Nat Prod Rep., Vol 10, pp 1-28 (1993)
[23] Sim J J and Pettus J.A., Phytochemistry, Vol 105, pp 1076- 1077 (1976)
[24] T Deyama, T Ikawa, S Kitagawa and S Nishi Be, Chem
Pharm Bull., Vol 35, pp 1785-1789 (1987)
Trang 13
MO ĐẦU
Do là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng âm, độ
âm trên 80%, lượng mưa hàng năm lớn nên Việt Nam có nguồn thực vật vô
cùng phong phú, với khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong
đó có tới trên 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [1] Đây là một
nguồn tài nguyên được liệu vô cùng quý giá, là mục tiêu nghiên cứu của các
nhà khoa học trong và ngoải nước, tạo tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học
các hợp chất thiên nhiên ở nước ta
Ngày nay, nền y học đang phát triển rất mạnh mẽ, đạt được những thành tựu khoa học đáng kể Trong đó có sự đóng góp rất lớn của ngành hoá
học các hợp chất thiên nhiên Theo tài liệu [13] công bố, hiện nay có khoảng
60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao, các nhà
nghiên cứu khoa học đã tiến hành nghiên cứu, tách chiết, tìm ra những chất có
hoạt tính sinh học từ các mẫu thực vật, tổng hợp nên các loại thuốc có khả năng trị bệnh rất cao
Cây Lá móng tay (Lawsonia inermis L.) thuộc họ tử vị ((Lythraceae), là
một loại cây đã được sử dụng từ lâu trong dân gian để làm thuốc nhuộm và
chữa một số bệnh như: tôn thương, chảy máu, phong thấp, nhức mỏi, tê bại, các bệnh ngoài da ; Ở Campuchia, Lá móng tay dùng làm thuốc chữa ho và phiêm phế quản; Ở Angieri, Lá móng tay được dùng trong y học dân gian để trị loét và rối loạn chức năng gan Đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc
điều trị bệnh mới
Trang 14
Chính vì những ý nghĩa thực tiễn trên mà tôi chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:
Nghiên cứu thành phần Lignan của cây Lá móng tay - Lawsonia inermis L.”
Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần Lignan của cây Lá móng tay, bao gồm những nội dung chính:
Trang 15CHUONG 1: TONG QUAN
1.1 Tổng quan về cây Lá móng tay [1]
1.1.1 Đặc điểm thực vật
Tén khoa hoe: Lawsonia inermis L Tên Việt Nam: Lá móng tay
Ngoài ra cây còn có tên: cây móng tay nhuộm, cây thuốc mọi, lựu
mọi, thuốc mọi lá lựu, tán mạt hoa, chỉ giáp hoa, phương tiên hoa, khau
thiên (Tày), khoa thiên (Lào)
Họ: Tử vi (Lythraceae)
Cây nhỏ, cao 2 — 6m Thân nhẫn, phân thành nhiều, (cây mọc hoang có gai ở đầu cành, không nhọn sắc)
Lá mọc đối, cuống ngắn, phiến lá đơn, nhỏ, hình trứng bầu dục nhưng đầu, cuống hơi dẹp, lá đài từ 3 — 7cm, rộng 2 — 4cm
Hình 1.1: Cây Lá móng tay (Lawsonmia inermis L)
Trang 16
Hoa mọc thành chùm phân nhánh ở ngọn Hoa màu trắng, già chuyển màu đỏ rồi vàng sậm khi héo, mùi thơm hăng hắc
Quả hình cầu, to bằng quả hạt tiêu, trong có chứa nhiều hạt nhỏ, có
góc cạnh
Mùa hoa quả: tháng 9 — 10
Hình 1.2: Quả và Hoa của cây Lá móng tay
1.1.2 Phân bố, sinh thái
Cây Lá móng tay có nguồn gốc ở vùng Bắc Mỹ hoặc Tây Nam Á, được trồng rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc Tây Nam Á, Án
Độ, Bắc Phi để làm cảnh, lấy lá làm thuốc nhuộm và thuốc chữa bệnh
Ở Việt Nam, cây Lá móng tay được trồng rải rác quanh bờ rào, nơi có nhiều ánh sáng, đất âm Cây sinh trưởng mạnh vào mùa xuân-hè, rụng lá vào mùa đông Cây ra quả hàng năm và có khả năng tái sinh vô tính mạnh Về mùa đông, người ta thường cắt bớt cành để cây ra nhiều chồi nhánh
1.1.3 Bộ phận dùng
Trang 17
Lá dùng tươi hay phơi khô Thân, rễ và hoa cũng được dùng nhưng ít hơn
1.1.4 Thành phần hoá học
Các nghiên cứu đã công bố cho thấy thành phần hóa học chính của lá móng tay là các hợp chất xanthon, napthoquinon, terpenoit, và phenol glycosit Năm 1976, nhóm nghiên cứu của tác giả Bhardwaj D K công bố sự có mặt của các hợp chất lawson và lacoumarin trong cây Lá móng tay [2] Năm 1977, nhóm nghiên cứu này công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 02 xanthon mới là laxathone I va laxathone II [3] Nam 1978, nhóm nghiên cứu này công bố thêm một hợp chất xanthon mới nữa từ cây Lá móng
Trang 18Đến năm 1982, nhóm nghiên cứu của tác giả Chakrabartty T công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất tritecpen là hennadiol và 20(S)-38.30-dihydroxylupane [Š]
‘eno oul,
Hennadiol 20(S)-3B,30-dihydroxylupane
Trang 19Năm 1992, nhóm nghiên cứu của tác giả Gupta S công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 01 hợp chất sterol mới từ rễ cây Lá móng tay và đặt tén 1a lawsaritol [7] Nam 1993, một hợp chất napthoquinon mới là isoplumbagin tiếp tục được nhóm nghiên cứu này phân lập từ vỏ thân cây Lá móng tay [8]
HƠ
Lawsaritol Isoplumbagin
Gần đây nhất, nhóm nghiên cứu của tác giả Siddiqui B S công bố sự
Trang 20Lawsonin oO oO OCH; OCH3 H3CO o st CH;ạCH;CH;OH ơ HƠ o0 ° CHạOH Lawsonadeem Lawsonicin 1.1.5 Tính vị, công năng
Lá móng tay có vị đắng the, tính âm, có tác dụng hoạt huyết thông kinh, giãn gân xương
1.1.6 Công dụng
Lá của cây Lá móng tay chữa vấp ngã, tổn thương, chảy máu, ứ máu,
điều kinh, viêm họng, tiêu chảy, mụn nhọt, ghẻ lở, hắc lào, sâu bọ độc cắn
Vỏ thân cây dùng chữa viêm gan vàng da, đau lưng, phong thấp, bại liệt, nhức mỏi
Rễ cây được dùng chữa viêm phế quản
Hoa dùng chữa sốt, mất ngủ
Ngoài tác dụng chữa bệnh, do có tính chất nhuộm màu nên cây Lá
móng tay được dùng rộng rãi trong sản xuất các loại mỹ phẩm như dầu gội đầu, thuốc nhuộm
Trang 21
1.1.7 Một số bài thuốc từ cây Lá móng tay
e Chita sung tay
Lá móng tay 10g, huyết giác, ngải cứu, mỗi vị 12g, tô mộc 10g, nghệ
8g Sắc uống
e Chữa sưng gan
Lá móng tay 10g, dành dành, huyền sâm, ích mẫu, mộc thông, mỗi vị 15 — 20g Sac uống
e_ Chữa hắc lào, ghé lở toàn thân
Lá móng tay tươi một nắm lớn nấu nước tắm 10 — 15 ngày
Lá móng tay tươi rửa sạch, giã nhuyễn, trộn với đẫm thanh, xoa nơi bị ngứa I — 2 lần/ngày
1.2 Vài nét về lớp chất Lignan
1.2.1 Đại cương và phân loại
Lignan là nhóm các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ các dẫn xuất của các cinamic acid, cinamyl alcohol, propenyl benzene va allyl benzene có liên quan đến sự chuyển hoá hoá sinh các phenylalanine Cấu trúc của lignan được chia thành các đơn vị C¿Cs hợp thành mà người ta phân biệt:
Lignan 2 đơn vị CạC: Secquineolignan 3 đơn vị CạCs Dineolignan 4 đơn vị CạCa Sesterneolignan 5 đơn vị CạCa
Lignan do 2 đơn vị CạC; hợp thành Năm 1961, Freudenberg và
Weiges đề nghị cách đánh số như sau: Nhóm CạC; đánh sé tir 1-9
Trang 22
nhóm còn lại đánh số từ 1”-9° Các vị trí 7, 8, 9 có thé thay tương tng a, 8, y
Cũng do do, cac vi tri 7’, 8’, 9’ duge thay tương ứng a’, B’, y’ Trén co so đó Haworth đề xuất nhóm hợp chất có nguồn gốc từ 2 đơn vị CạC; có liên kết B- B’ (y-y’) với nhau gọi là lignan (lignane, lignans)
Trang 237,7` - epoxylignan Tương tự có oxyneolignan
8, 4' - oxyneolignan
Lignan được tìm thấy chủ yếu từ rễ, lõi, cành, lá, quả, nhựa các cây hạt
trần, cây hạt kín Theo các nghiên cứu khoa học, lignan là chất
phytoestrogens có tiềm năng chống ung thư (cancer) buồng trứng, tuyến tiền
liệt, vú, tử cung; lignan chiết từ khoai tây kích thích hệ miễn dịch, tác động to lớn tới bào mòn sỏi túi mật (theo bác sĩ Wilkinson-bệnh viện Sowthompton-Anh), lignan có tác dụng ngăn chặn chu kì APM
Phosphodiesterase, lam nay mầm chất ức chế; đặc biệt dẫn xuất brom của nó
với các chỉ số E CỔso và SI thích hợp có tác dụng chống HIV bằng cách ức chế bản sao ngược của tế bào HIV-I và kết hợp với DNA polymerase va
RANase
Lignan pinoresinol va laricresnol là thành phần quan trọng trong thực
đơn ăn kiêng của bệnh nhân tiêu đường
Đông y Trung Quốc sử dụng lignan để điều trị viêm gan và bảo vệ gan
Trang 24
Dựa trên hoạt tính oxi hoá mạnh, khoa học đã tìm ra nhiều hoá chất
nguồn gốc lignan đa dạng, cộng sinh với nhiều loại virut để tạo hướng phát triển mới trong y được
1.2.2 Các dẫn xuất quan trọng của Lignan
e Dẫn xuất axit cacboxylic [14]
MeO
e Dan xuat lactone [15]
Z7
Hibalactone từ T.baccata
e© Dẫn xuất este [16, 17]
Chống lại tác đụng của tế bào HIV-IRT
Trang 25
e Dẫn xuất xeton
e Dan xuat ancol va phenol [18, 19]
/
Magnolol Honokiol
Trang 28Hạ
Trang 30e Theo Enders OL 7 a: L.aeledritde, THF, -78°C b: LIAIH¿, THF, 60% c: MsCl, pyridine
1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng
chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau
1.3.1 Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên, những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cân thận
Trang 31
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử đụng Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyleitrar và tributylphosphat Những chất này có thê lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa
Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)-
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thir nghiệm sinh học và có thể lam ban dich chiết của cây Chloroform, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quá, hoa
Những tạp chất của chloroform như CH;Cl;, CH;CIBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản
phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC]) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Chloroform có thể gây tôn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cần thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các đung môi này sẽ
Trang 32
thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thê rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyên hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm nới được tạo thành khi đùng
methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyên thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi crythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng
Người ta thường ít sử dụng nước đề thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó
rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dé né Peroxit của dietyl ete đễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết đưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng đề từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn
Trang 33
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-40°C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thé thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn
1.3.2 Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dung bình thuỷ tinh
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa
những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một
vài cách khác nhau
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragendroff va tac nhân Maye
Trang 34
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết
chảy ra mà không có màu sẽ đánh đấu sự rửa hết những chất này trong cặn
chiết
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra
và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá
trình chiết
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thé
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn
dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu
quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết
1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phô biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng
1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bó khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tinh
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cau tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan )
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyên động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh
Trang 35
này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp
phụ Kết quá là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyên động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí
1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tữnh với nồng độ của dung dịch
(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
_ n„.b.C
"= 1+b.C
n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng
n„ : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ
nào đó
b : Hằng số
C_: Nồng độ của chất bị hấp phụ
1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí, pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn
Trang 36Đây là phương pháp sắc kí đơn giản nhất, phổ biến nhất, chat hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường
và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhi vào cột (cột có thể
bằng thuỷ tỉnh hoặc kim loại, phố biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của
chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ
có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thê gây ra hiện
tượng tắc cột (đung môi không chảy được) Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là R;, với mỗi một chất sẽ có một R; khác nhau
Nhờ vào sự khác nhau về R; này mà ta có thé tach từng chất ra khỏi hỗn hợp
Ti lệ chất so với tỉ lệ chat hấp phụ cũng rất quan trọng Tuy theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 — 1/10), tách tỉnh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau R¿ của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 — 1/30
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là
tắm chất vào silicagel rồi làm khơ, tơi hồn tồn, đưa lên cột Nếu tách tỉnh
thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
Trang 37
- Cách 1: Nhôi cột khô
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột dé chất hấp phụ sắp xếp chat trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột đề chạy cột đến khi cột trong suốt
- Cách 2: Nhỏi cột ướt
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng
dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quá tách), cột không được nút, gãy, dò
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc
1.4.3.2 Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột SKLM được tiến hành trên bán mỏng tráng sẵn silicagel trên dé nhôm hay để thuý tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng dé điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silicagel day hon), có thé đưa lượng chất nhiều hơn lên bán và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần
tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng
biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H;SO¿ 10%
1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phô kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta
Trang 38
sử dụng phương pháp phổ cụ thé Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối
hợp các phương pháp phô càng cao Trong một số trường hợp, dé xác định
chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các
phương pháp bố sung khác như chuyền hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh
1.5.1 Phố hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó
dựa vào phố hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng
trong hợp chất, ví dụ như đao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm”, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng
1700 - 1750 cm"
1.5.2 Phé khdi lwong (Mass Spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phố này là đựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất đưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phố MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế
phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay co
rất nhiều loại phổ khối lượng , như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phé EI-MS (Electron Impact lonization Mass Spectroscopy) đựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phố biến là 70eV
- Phé ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là
phô phun mù điện tử Phố này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phố EI-MS Do đó phô thu được chủ yếu là pic ion phan tr và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ
bị phá vỡ
Trang 39
- Phé FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phỗ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp Do đó phô thu được cũng đễ thu được pic ion phân tử
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp
sắc kí với khối phố khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dé bay hơi như tỉnh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất
khác Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích
thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành được)
1.5.3 Phố cộng hướng từ hạt nhân (Wuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
Phố cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kế cá cấu trúc lập thể của phân tử
Nguyên lý chung của các phương pháp phố NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân tit ('H va °C) dudi tac dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân
tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau
(spin coupling)
1.5.3.1 Phố TH-NIMR: Trong phố 'H-NMR, độ dịch chuyển hoá
hoc (5) cua các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác
spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất
Trang 40
1.5.3.2 Phé “C-NMR: Phé nay cho tín hiệu vạch phố cacbon Mỗi
nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phô khác nhau Thang đo của phô 'C-NMR Ia ppm, véi dai thang đo rộng 0- 230ppm
1.5.3.3 Phé DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phỗ này cho ta các tin hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phố DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mắt Tín hiệu của CH và CH; nằm về một phía và cia CH về một phía trên phố DEPT 135 Trên
phé DEPT 90° chi xuất hiện tín hiệu phố của CH
1.5.3.4 Phố 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép
xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử đụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Cac
tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phô này
Trên phố, một trục là phô 'H-NMR, còn trục kia là 'C-NMR Các tương tác
HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ
- Phố 'H-`H COSY (HOMOCOSY) (H-1H Chemical Shiƒ Correlation
Spectroscopy): Phé nay biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phố này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau
- Phé6 HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Day là phé biểu diễn tương tác xa của H va C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cau tric
- Phố NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phé nay biểu diễn các tương tac xa trong không gian của các proton không kể đến các