Tên để tài: GIÁM SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC KHÁNG | SINH CỦA VI KHUẨN LẬU TẠI HÀ NỘI TỪ NĂM 2001 ĐẾN NĂM 2003
Chủ nhiệm để tài: PGS.TS LÊ HỒNG HINH |
| Co quan chủ trì : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Cấp quảnlý : Bộ Y tế |
Thời gian thực hiện: Từ tháng 1 năm 2001
đến tháng 12 năm 2003 |
Tổng kinh phí thực hiện dé tai: 150 triệu đồng
Trong đó: kinh phí SNKH : 150 triệu đồng
| Nguồn khác: Không
HÀ NỘI 2004
Trang 21 Tên để tài: Giám sát tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn lậu tại Hà Nội từ năm 2001 đến năm 2003
2 Chủ nhiệm để tài: PGS.TS Lê Hồng Hinh 3 Cơ quan chủ trì để tài: Trường Đại học Y Hà Nội 4 Cơ quan quản lý để tài: Bộ Y tế
5 Thư ký để tài: TS Lê Thị Phương
6 Danh sách những người thực hiện chính:
- PGS.TS Lê Hồng Hinh, Trường ĐHY Hà Nội
- PGS.TS Phạm Văn Hiển, Trường ĐHY Hà Nội - TS Lé Thi Phuong, Viện Da liễu Trung Ương - ThS Lê văn Hưng, Trường ĐHY Hà Nội - BS Nguyễn Thị Loan, Trung tâm Da liễu Hà Nội
Trang 3LTQĐTD Lây truyền qua đường tình dục BBL GASP LOS LPS Mol.wt OMA PPNG TRNG WHO Md
Baltimore Bacteriological Laboratory
Chương trình giám sát kháng sinh của vi khuẩn lậu (Gonococcal Antimicrobial surveillance Programe) Lipooligosarcharide
Lipopolysacharide
Trọng lượng phân tử (Molecular weight)
Kháng nguyên mang ngoai (Outer membrrane antigen ) Vi khuẩn lậu Sinh 8-lactamase
(Penicillinnase Producing Neisseria gonorrhoeae )
Vi khuan lau khang tetracycline 6 néng dé cao High level (Tetracycline Resistant Neisseria gonorrhoeae)
Trang 4Nội dung Trang Phần A Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài 1
1 Kết quả nối bật của để tài 1
2 Áp dụng vào thực tiễn điều trị 2
3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với
để cương nghiên cứu đã được phê duyệt 3 4 Các ý kiến đề xuất 3 Phần B Nội dung báo cáo chỉ tiết kết quả nghiên cứu 1 Đặt vấn để 5 2 Tổng quan tài liệu 7 2.1 Vị khuẩn lậu 7 2.1.1 Lịch sử về bệnh lậu , 7 2.1.2 Đặc điểm sinh học vủa vi khuẩn lậu § 2.1.3 Khả năng gây bệnh 12
2.1.4 Chẩn đoán vi khuẩn lậu trong phòng xét nghiệm 15 2.2 Bệnh lậu và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
trên Thế giới 17
2.3 Bệnh lậu và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
ở Việt Nam 19
3 Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22
3.1 Đối tượng nghiên cứu 22
G2
Trang 54 Kết quả nghiên cứu 36
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 36
4.2 Kết quả vi khuẩn lậu đề kháng với các kháng sinh 41 4.3 So sánh ty lệ kháng kháng sinh qua từng năm 47 4.4 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu để kháng với 2 kháng sinh 49
4.5 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu để kháng với 3 kháng sinh 51
4.6 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu để kháng với 4 kháng sinh 52 4.7 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu dé kháng với 5 kháng sinh 52 4.8 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu đề kháng với đa kháng sinh
qua các năm 53
4.9 Kết quả vi khuẩn lậu có Ð - Lactamase 34 4.10 MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu 55
Š Bàn luận 36
5.1 Kết quả phân lập vi khuẩn - 56 5⁄2 Kết quả các chủng vi khuẩn lậu để kháng
với các kháng sinh 62
5.3 Tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu đa đề kháng kháng sinh 66
5.4 Tý lệ các chủng vi khuẩn lậu có B - Lactamase 67
5.5 MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu 67
6 Kếtluận 70
Trang 6TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
11 Đóng góp mới của để tài:
- Lần đầu tiên có một công trình nghiên cứu cấp bộ với thời gian tương
đối dài (3 năm) với số bệnh nhân khá lớn (8662 bệnh nhân) và số chủng vi khuẩn phân lập được khá cao (880 chủng) Nghiên cứu có tính hệ thống liên tục,
giúp chúng ta thấy được tình hình mắc bệnh lậu và tỷ lệ phân lập được vi khuẩn lậu ở Hà Nội ngày một tăng
- Đánh giá được mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được ở Hà Nội đối với từng kháng sinh đang được sử dụng ở Việt nam
và Thế giới qua 3 năm liên tục La chọn ra được những kháng sinh có tác dụng
tốt nhất trong điều trị bệnh lậu
- Đưa ra được nồng độ ức chế tối thiểu của từng kháng sinh (MIC) đối với vi khuẩn lậu, giúp chúng ta xác định được liều lượng cần thiết của từng kháng sinh để điều trị bệnh lậu có hiệu quả nhất
- Phát hiện được tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu có B-lactamase chiếm tương đối cao, nhưng có xu thế giảm dần qua 3 năm nghiên cứu
1.2 Kết quả cụ thể:
- Đưa ra được 4 bảng số liệu và 3 biểu đồ về kết quả phân lập vi khuẩn lậu, so sánh tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ, giữa các lứa tuổi, giữa các nghề
nghiệp trong 3 năm 2001,2002,2003
Trang 7khuẩn lậu để kháng với các kháng sinh, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu có B- lactamase và nồng độ ức chế tối thiểu của từng kháng sinh (MIC) đối với vi khuẩn lậu
1.3 Hiệu quả về đào tạo:
Với số liệu thu được trong 1 nắm đã giúp 1 học viên cao học viết được luận văn Thạc sỹ, bảo vệ đạt xuất sắc
1.4 Hiệu quả về kinh tế:
Khi xác định được tính nhậy cảm của vi khuẩn lậu với từng kháng sinh, chúng ta có thể loại bỏ được nhứng kháng sinh đã bị lậu cầu kháng lại cao: trên cơ sở đó nhà nước chỉ cần mua những kháng sinh vi khuẩn lậu còn nhậy cảm Chỉ riêng việc này cũng tiết kiệm được hàng tỷ đồng cho một năm
1.5 Hiệu quả về xã hội:
Các kết quả nghiên cứu có thể áp dụng ở các bệnh viện và cộng đồng, lựa chọn được kháng sính tốt nhất, liều lượng thích hợp nhất để điều trị có kết quả cao, hạn chế được tính kháng thuốc của vi khuẩn lậu, góp phần hạn chế bệnh lậu ở Việt Nam
2 ÁP DỤNG VÀO THỰC TIẾN ĐIỀU TRỊ
Trang 8NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
Đối chiếu với để cương nghiên cứu đã được phê duyệt, việc thực hiện để tài của chúng tôi đã đảm bảo:
a Tiến độ:
Thực hiện đúng tiến độ
b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra Thực hiện đầy đủ các mục tiêu để ra
c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương - Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong để cương - Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong để cương
d Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí thực hiện để tài: 150 triệu đồng
Trong đó kinh phí sự nghiệp khoa học: 150 triệu đồng Kinh phí từ nguồn khác: 0 triệu đồng
Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí đề tài : khơng Tồn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán: 150 triệu
4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT:
a Đề xuất về tài chính:
Trang 9nghiên cứu
Việc thanh quyết toán chứng từ vào cuối năm là không hợp lý do kinh phí được cấp chậm, việc mua các sinh phẩm và ký các hợp đồng nghiên cứu gặp khó khăn
Do vậy các cơ quan quản lý nên:
- Cấp phát kinh phí đúng thời gian, kịp thời
- Gia hạn thanh quyết toán chứng từ đến hết quý l năm sau Đề xuất về quản lý khoa học công nghệ
Cơ quan quản lý cần có quyết định phê đuyệt sơm Đề xuất liên quan đến đề tài
Trang 10NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Vị khuẩn lậu (Neisseria gonorrhoeae) là căn nguyên sây ra bệnh lậu ở mọi lứa tuổi Theo Tổ chức Y tế Thế giới số người mắc bệnh lậu ngay cane lang, hang năm trên Thế giới số ca mới mắc là 6Ö triệu người tỷ lệ mắc không có xu hướng thuyên giảm trong khi đó bệnh lậu là đồng tác nhân lây truyền với HIV/AIDS [55] [67]
Bệnh lậu tuy không sây nguy hiểm tới tính mạng bệnh nhân, nhưng nếu không được điểu trị kịp thời thì sẽ để lại nhiều đi chúng và biến chứng nguy hiểm như: vô sinh , chửa ngoài tử cune, mù loà ở trẻ sơ sinh |4] [7]
Việc dùng kháng sinh điều trị bệnh lậu đã có kết quả tốt nhưng do việc sử dung kháng sinh một cách bừa bãi ở những nước đang phát triển đã tạo điều kiện gia tăng sự để kháng kháng sinh thông thường sử đụng trong điều trị của vi khuẩn lậu Sự xuất hiện, lan truyền các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh ngay ca những thuốc lựa chọn tốt nhất cho điều trị bệnh lậu như: quinolones
ccftriaxon, spectinomycine trên toàn Thế giới là một vấn dé nan giải [65], [66] Tại Việt Nam các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm lậu cầu ở phụ nữ đến
khám phụ khoa là 0,3 đến 0;7% Hàng năm số người đến khám và điều trị lậu ở các bệnh viện rất lớn gây tốn kém nhiều đến kinh tế và sức lao động Việc sử
dung kháng sinh một cách bừa bãi trong cộng đồng đã gây nên tý lệ vi khuẩn
Trang 11tetracycline, 12 — 17% khang chloramphenicol, 15 — 17% kháng kanamycine,
50% khang penicillin [12], [13]
Các công trình nghiên cứu còn lẻ tẻ, theo đõi không liên tục do đó chưa thấy được biểu đồ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đối với từng kháng sinh
đang được sử dụng ở Việt Nam Cần có sự theo dõi liên tục để giám sát tính
kháng kháng sinh của lậu cầu, từ đó loại bỏ những kháng sinh bị lậu cầu để kháng, sử dụng những kháng sinh thích hợp trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh lậu
Mục tiêu của đề tài:
1 Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu với các kháng sinh thông thường đang được sử dụng điều trị ở Việt Nam 2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của một số kháng sinh đối với vi
Trang 122.1 VI KHUAN LAU
2.1.1 Lịch sử về bệnh lậu
Bệnh lậu được người Ai Cập cổ đại mô tả từ năm 1550 trước Công Nguyên Sau đó Hypocrat mô tả: “Đây là bệnh của những người ăn chơi trác táng chìm đấm trong lạc thú của thần vệ nữ ” [2], [3]
Đến thế kỉ thứ 13 bệnh lậu được biết là một bệnh LTQĐTD
Dau thé ki 19 John Hunter, một bác sĩ người Anh đã tự tiêm cho mình mủ lấy từ bệnh nhân nhưne bệnh nhân này không may mắc vả 2 bệnh: bệnh lậu và giang mai cho nên người ta vẫn lầm tưởng bệnh lậu và bệnh giang mai là một
Đến siữa thế kí 19, người ta mới phân biệt bệnh lậu và bệnh giang mai là hai bệnh khác nhau về căn nguyên
Năm 1879 được Neisser mô tả vi khuẩn lậu là căn nguyên gây nên bệnh lậu
và được Leistikow và Loeffler nuôi cấy lần đầu tiên trên môi trường nhân tao
vào năm 1882
Năm 1885, Bumm chứng minh vai trò gây bệnh của vi khuẩn lậu [23]
Năm 1928 A.Fleming tìm ra penicillin, sau đó không lâu kháng sinh này được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng nói chung và bệnh lậu nói riêng [28]
Trang 132.1.2.1 Hình thể và cấu trúc:
Vị khuẩn lậu có tên khoa học là Neisseria gonorrhoeae, thuộc họ Neisseriaceae Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt nhau về một số tính chất sinh vật hoá học (lên men đường glucose và không sinh hơi khi sử dụng một số loại đường) Dựa vào tính chất này, người ta phân biệt vi khuẩn lậu với một số Neisseria hoại sinh khác [23]
Trên tiêu bản lấy mủ từ bệnh nhân bị bệnh lậu và nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn hình hạt cà phê, bắt mầu Gram (—), hai mặt dẹt quay vào nhau Vị khuẩn lậu có kích thước 0,6um x 0,8um, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng Trong tế bào bạch cảu đa nhân trung tính vi khuẩn lậu là loại vi khuẩn độc chiếm tế bào bạch cầu đa nhân trung tính (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống trong tế bào) Trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính người ta có thể pặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều cặp, có khi xếp lèn chặt trong lòng bạch câu đa nhân trung tính Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không có lông, không có roi (êm mao) một số chủng vi khuẩn lậu có pili Tinh chat bat mau, vi trí nằm trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính của vi khuẩn lậu có giá trị lớn trong chẩn đoán xác định khi kết hợp với tiền sử bệnh và triệu chứng lâm sàng
2.1.2.2 Khả năng đề kháng
Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khi ra khỏi cơ thể vi khuẩn rất đễ chết Sức đề kháng của vi khuẩn lậu rất kém, dễ bị bất hoạt khi ở điều kiện ngoại cảnh Chúng ký sinh bắt buộc ở vật chủ, vi khuẩn chết rất nhanh ở 55°C, chỉ sau 5 phút Trong điểu kiện khô và giàu oxy, vi khuẩn lậu chết sau 1-2 giờ Với hoá
chat phenol 1%, mercuric chloric 0,01%, formol 0,1%, sublime 0,1%, vi khuẩn chét sau 1-5 phiit tiép xtic [2]
Trang 14Vi khuẩn lậu mọc tốt trên môi trường chọn lọc Thayer-Martin có chất tăng sinh Isovitalex và chất ức chế V-C-N
+ Chất tăng sinh (Isovitalex) Thành phần bao gồm : - Diphosphopyridin nucleotide (coenzyme) - Carboxylase - P.aminobenzoic acid - Thiamin-HCL - Vitamin B12 - L-glutamine - L-cystine-2HCL - L-cystine-HCL-2H,O - Adenine - Guanin-HCL - Ferric nitrate-9 H,O _ Dextrose + Chất ức chế (V-C-N): - Vancomycin - Colistin - Nystatine
Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 35—36°C, độ ẩm >70%, khí trường CO từ 3-10%, pH 7,3 Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính là 0,5—1 mm,
Trang 15Sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn lậu tự dung giải nhanh chóng, thông thường có những khuẩn lạc to ra, khi nhuộm Gram, ta thấy những song cầu khuẩn phình lên Nếu để 48-72 giờ khuẩn lạc có kích thước tới 3 mm
Có 5 dạng khuẩn lạc kiểu Tị, T;, Tạ, Tạ, Tạ Trong đó khuẩn lac kiéu T,, T,
có kích thước nhỏ, dạng S, vi khuẩn có pili Còn khuẩn lạc kiểu Tạ, T„ T;
thường to phẳng, không có lấp lánh sáng, không có pili [2]
2.1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn lậu
Nhiều tác giả đều cho rằng kháng nguyên của vi khuẩn lậu rất phức tạp, đặc hiệu cho từng týp và có liên quan chặt chẽ với tính chất gây bệnh, các kháng nguyên được biết đó là:
- Kháng nguyên pili có ở những vi khuẩn có khuẩn lạc kiểu 1¡, T; bản chất là protein Kháng nguyên T; và T; có mol.wt dao động từ 17.000 đến 21.000 Chức năng của pili là giúp vi khuẩn lậu bám vào niêm mạc và trao đổi vật chất đi truyền giữa những chủng có pili [23]
- Kháng nguyên LPS bao gồm các chuỗi đường đơn, ngắn: glucose,
galactose, 3-keto-2-deoxioctanoic acide, glucosamine, ethanolamine với các tỷ lệ khác nhau do đó được gọi là LOS LOS có hiện tượng đảo pha, chính hiện tượng này quyết định sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào và bất hoạt bổ thể là cơ chế thích nghỉ lẩn tránh miễn dịch Vai trò của LOS là nội độc tố đóng vai trò
đặc hiệu của vi khuẩn lậu giúp phân biệt chúng với các cầu khuẩn Gram (-) khác
[23]
- Kháng nguyên màng ngoài (OMA) cũng đóng một vai trò quan trọng Bản chất của kháng nguyên này là protein, các protein được biết là :
IA: mol.wt 32.000
Trang 16Đây là 2 dạng kháng nguyên cơ bản, 2 kháng nguyên này đặc hiệu týp huyết thanh
Protein II có ở hầu hết các tế bào đứng liền nhau của vi khuẩn lậu, làm cho khuẩn lạc lấp lánh như hạt sương Vai trò của protein này giúp vi khuẩn lậu bám vào tế bào biểu mô [23]
2.1.2.5 Tính chất di truyền của vi khuẩn lậu
Trong các nghiên cứu về vật liệu di truyền của vi khuẩn lậu đáng quan tâm nhất là 3 dạng plasmid:
- Loai 1: plasmid 24,5 Md cé khả năng hoạt hoá các plasmid khác - Loai 2: plasmid 2,6 Mid chưa rõ chức năng
- Loại 3: plasmid quy định sinh B-lactamase Đây là plasmid quy định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu và là plasmid quan trọng nhất, được nghiên cứu nhiều nhất [23], [55]
2.1.2.6 Tính chất miễn dịch của vi khuẩn lậu
Kháng thể kết hợp bổ thể ở huyết thanh bệnh nhân đã được phát hiện từ lâu
và được sử dụng để chẩn đoán huyết thanh học Kháng thể kết hợp bổ thể có thể tồn tại trên bệnh nhân sau nhiều năm mắc bệnh cho dù bệnh đã khỏi Hiện nay: do phát triển kỹ thuật enzyme (ELISA) người ta đã phát hiện có ít nhất 3 lớp kháng thể: IgM, IgA, IgG kháng lại pili của vi khuẩn lạu Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch trong số bệnh nhân bị bệnh cũng khác nhau Sự khác nhau đó có ý nghĩa so
sánh giữa nhóm người bị bệnh và nhóm người lành Ở người bị bệnh lậu cấp
Trang 17Neisseria là các cầu khuẩn Gram (-), xếp đôi không di động, ký sinh bất buộc, không phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường nhưng phát triển tốt trên môi trường huyết thanh, indole (-), oxidase (+), khi nitrite, khong khử nitrate Neisseriaceae bao gồm các giống : - Neisseria - Moraxella ~ Kingella - Acinetobacter [23]
2.1.3 Kha nang gay bénh 2.1.3.1 Đối tượng gây bệnh
+ Bệnh lậu ở người lớn :
Vi khuẩn lậu có một vật chủ duy nhất là người Bệnh liên quan chặt chẽ với hoạt động tình đục Vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho cả nam và nữ Triệu - chứng điển hình là đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo Nhưng cũng có khoảng
1/5 số người không có triệu chứng điển hình [35], [42], [53]
6 phụ nữ triệu chứng phức tạp hơn: tiết dịch niệu đạo, âm đạo VỊ trí bị bệnh của phụ nữ thường ở niệu đạo, cổ tử cung, tuyến Skène, tuyến Bartholin, có khi
tới cả tử cung, vòi trứng buồng trứng [39], [48]
Viêm trực tràng: thường gặp ở những người đồng tính luyến ái nam Triệu trứng viêm trực tràng do vi khuẩn lậu thường không điển hình
Nhiễm vi khuẩn lậu ở họng thường gặp ở bệnh nhân đồng tính luyến ái nam [251 [38]
Trang 18+ Bệnh lậu ở trể em :
Thường biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong thời kỳ sinh con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày Nếu không được điều trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà Có thể gặp viêm âm hộ, âm đạo, niệu đạo do vi khuẩn lậu ở các bé gái do dùng chung chậu với bố mẹ bị bệnh lậu
+ Nhiễm vi khuẩn lậu lan toả :
Bệnh thường gặp ở những người bị bệnh lậu nhưng không được điều trị kịp thời, đúng phác đồ Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ Biểu hiện của bệnh như: viêm khớp, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên đa [3]
2.1.3.2 Cơ chế bệnh sinh
Theo một số tác giả thì sự cố định và di chuyển của vi khuẩn lậu trên niêm mạc đã bắt buộc vi khuẩn lậu phải dính vào niêm mạc để chống lại ma sát gây ra khi có dòng chảy của nước tiểu và các chất nhầy Sự cố định này đã được
khẳng định khi quan sát trên kính hiển vi điện tử Do sự xâm nhập và sự bám
dính nhanh chóng của vi khuẩn lậu vào tế bào niêm mạc, trên lâm sàng, hiện tượng đái dắt xuất hiện đầu tiên Kháng nguyên màng ngoài (protein II) đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn lậu bám dính vào tế bào và giúp vi khuẩn lậu xâm nhập vào tế bào biểu mô trụ Sự xâm nhập của vi khuẩn lậu vào sâu hơn nữa bị các tế bào biểu mô lát tầng ngăn chặn, nên ở đây đã xảy ra một phản ứng viêm Kết quả là gây ra mủ ở niệu đạo, đó là dấu hiệu đầu tiên của
bệnh [3], [23]
2.1.3.3 Một số yếu tố có liên quan đến tỷ lệ nhiễm vì khuẩn lậu
- Về tuổi
Trang 19hợp bị bệnh lậu lây lan theo đường tình dục phổ biến ở lứa tuổi từ 16-40 [22],
[29]
Nhiều thông báo cho thấy, lứa tuổi bị nhiễm vi khuẩn lậu đường sinh dục
ngay từ tuổi rất nhỏ (3-4 tuổi) Số bệnh nhân dưới 10 tuổi cũng chiếm tỷ lệ đáng
kể Tuổi bị bệnh có thể gặp ở lứa tuổi >70 [11], [21], [37] - Về giới
Nhiều công trình nghiên cứu về bệnh lậu cho biết: tỷ lệ nam giới bị bệnh lậu cao hơn nữ giới ở hầu hết các nước trên thế giới Một nghiên cứu ở Nigieria cho biết: trong số 214 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu, nam giới chiếm tỷ lệ 75,2% và nữ giới là 24,8% [24]
- Nghề nghiệp
Thực ra vấn đề về nghề nghiệp có liên quan đến sự nhiễm bệnh rất khác biệt ở nhiều nước trên thế giới Một nghiên cứu tại Indonesia, tác giả xết nghiệm cho 502 phụ nữ hành nghề mại dâm, tỷ lệ nhiễm vị khuẩn lậu là 29,9% là một tỷ lệ khá cao [54] Ngược lại một thông báo khác tại Bỉ cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng gái mại dâm chỉ chiếm 8,2% [62] Nghiên cứu ở Nigeria cho biết: ty lệ trong những bệnh nhân bị bệnh lậu, người buôn bán là 38%; cán bộ viên chức là 24,5%; sinh viên là 26,7%; không nghề nghiệp là 50% [24]
- Giáo dục sức khoẻ :
- Giáo dục y tế và sức khoẻ, trong đó vấn để giáo dục về việc thay đổi hành vi tình dục đang trở thành khía cạnh quan trọng trong dịch tễ học bệnh lậu Ở các nước Bắc Âu tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu cao vào những năm 1970 và kéo dài đến năm 1985 Sau đó, do công tác giáo dục sức khoẻ cộng đồng phát triển mạnh mà tỷ lệ bệnh giảm xuống rất nhiều [26]
Ở các nước đang phát triển kể cả Việt Nam, mấy năm gần đây chúng ta đã
Trang 20trong cộng đồng
2.1.4 Chẩn đoán vi khuẩn lậu trong phòng xét nghiệm
Chẩn đoán vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo, cổ tử cung và viêm kết mạc mắt
trẻ sơ sinh là phát hiện hình thể của vi khuẩn, nuôi cấy phân lập và phát hiện kháng nguyên, kháng thể
Trong các trường hợp viêm niệu đạo, cổ tử cung cấp tính, việc lấy mủ hoặc dich tiết làm tiêu bản nhuộm Gram, soi trực tiếp xác định hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn lậu có giá trị cao, đặc biệt là ở các tuyến cơ sở mà ở đó chưa có điều kiện, phương tiện để nuôi cấy phân lập vi khuẩn Theo Van der Pol bằng phương pháp nhuộm Gram lấy mủ từ niệu đạo của bệnh nhân nam đã cho kết quả cao, phương pháp này có độ nhạy 96,4% và độ đặc hiệu 94,7% [60]
Tỷ lệ phản lập vỉ khuẩn lậu dương tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố : - Bệnh ở giai đoạn cấp tính hay giai đoạn mạn tính
- Đã hoặc chưa sử dụng kháng sinh - Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
- Thời gian gửi bệnh phẩm
Giá trị của phương pháp nhuộm Gram :
Nếu như nam giới việc chẩn đoán trong giai đoạn cấp tính bằng phương pháp nhuộm, soi trực tiếp có tý lệ dương tính cao thì đối với nữ giới bằng phương pháp này chỉ đạt tỷ lệ dương tính từ 40-60% [48]
Giá trị của những kỹ thuật xét nghiệm hiện đại :
Trang 21và rút ngắn thời gian xét nghiệm Theo Hossain va cộng sự bằng kỹ thuật ELISA, đã giúp cho phát hiện nhanh vi khuẩn lậu ở cổ tử cung nữ giới và niệu đạo ở nam giới Tác giả đã so sánh với phương pháp nhuộm ram và nuôi cấy, kết quả ELISA cho độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu cao là 98% [40]
- Trong những năm gần đây, nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR, người ta đã phát hiện những bệnh nhân nam và nữ bị bệnh lậu có triệu chứng và không có triệu chứng một cách chính xác Theo nghiên cứu của Van der Pol, bang k¥ thuat PCR tác giả đã xét nghiệm nước tiểu cho 943 bệnh nhân có triệu chứng và không có triệu chứng Tác giả cho biết độ nhạy và độ đặc hiệu của thử nghiệm này là 76,9% và 99,8% đối với bệnh nhân không có triệu chứng Đối với bệnh nhân có triệu chứng, độ nhạy và độ đặc hiệu là 98,8% và 99,8% [60] Thử nghiệm PCR được nhiều bệnh nhân chấp nhận vì nhiều lý do mà họ không muốn đến phòng xét nghiệm để lấy mủ, địch tiết ở bộ phận sinh dục [52] [60]
- Một vấn đề không kém phần quan trọng là vai trò và kinh nghiệm của xét nghiệm viên tại các Labo, nhất là các Labo chưa có phương tiện và trang thiết bị phục vụ cho nuôi cấy Vì vậy, cần có sự trao đổi kinh nghiệm giữa các Labo với nhau và có sự giám sát, kiểm tra chất lượng của các Labo tiêu chuẩn
- Dù các xét nghiệm có hiện đại đến đâu cũng khơng thể thay thế hồn tồn phương pháp nhuộm soi, ni cấy và phân lập vì nếu có kinh nghiệm, không một thử nghiệm nào nhanh bằng phương pháp nhuộm Gram phát hiện hình thể
vi khuẩn lậu
Trang 222.2 Bệnh lậu và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trên thế giới 2.2.1 Tình hình bệnh lậu trên thế giới
- Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu người bị bệnh lậu Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu người mới mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6% Ở London (Anh), theo dõi 516 thai phụ trong
2 năm, người ta thấy thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4% [37], [55], [62]
- Tỷ lệ lây lan ở các nước cũng khác nhau: Bỉ là 0,3%, Uganda 3,4%, châu Mỹ La tỉnh 1,2% {55], [57] [60]
- Ở châu Phi, tỷ lệ viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn lậu là
5-10/1000 trẻ sơ sinh sống, trong khi đó ở Mỹ tỷ lệ này là 0,1-0,6/1000 trẻ sơ
sinh sống [67]
2.2.2 Tình hình kháng kháng sinh của vì khuẩn lậu trên thế giới
Việc sử dụng penicilline trong điều trị bệnh lậu lần đầu tiên được khuyến cáo vào thập niên 40 Bệnh nhân bị bệnh lậu được điều trị bằng penicilline cho kết quả tốt Năm 1950, bất đầu xuất hiện những chủng vì khuẩn lậu kháng lại penicilline Mức độ kháng lại penicillin ngày càng gia tăng với tốc độ khác nhau tùy từng vùng và từng khu vực trên thế giới Cho đến năm 1976, lần đầu tiên xuất hiện các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có B-lactamase, các chủng này phân lập được ở Anh, Mỹ, Tây Phi, châu Á (Philippines) và vùng Cận Đông
'[28], [55]
Su kháng penicilin do hình thành -lactamase của một số chủng vi khuẩn lậu là trở ngại lớn trong điều trị, vì chúng không bị tiêu diét béi penicillin liéu
cao mà bắt buộc phải thay thế bằng một kháng sinh khác Ở châu Á, châu Phi tỷ
Trang 23Theo WHO năm 1992 tại các nước trong khu vực Tây-Thái Bình Dương người ta đã phân lập được các chủng vi khuẩn lậu có -lactamase là: Hồng Kông 40%, Hàn Quốc (30%), Thái Lan (28,2%), Nhật Bản (2,9%) [65]
Năm 1987, ở Hàn Quốc đã có 8,2% các chủng vị khuẩn lậu kháng lại spectinomycin (vào thời kỳ đó spectinomycin được coi là thuốc điều trị vi khuẩn lậu đặc hiệu nhất) Theo thông báo của WHO năm 1993 tỷ lệ kháng spectinomycin của vi khuẩn lậu là 5,5% & New Caledonia; 5,3% ở Trung Quốc năm 2000 [65], [71]
_ Đối với kháng sinh thuộc nhóm quinolon thế hệ 1-2: theo WHO, những năm gần đây các kháng sinh thuộc nhóm quinolone đã được sử dụng nhiều để diéu trị bệnh lậu, tuy vậy chỉ sau một thời gian vi khuẩn lậu đã kháng lại các kháng sinh này với tỷ lệ ngày càng gia tăng nhanh chóng: Trung Quốc là 54.2%
(1997.1998) tăng lên 85,2% (2000); ở Nhật Bản tỷ lệ này là 40%, Hàn Quốc
(16%), Brunei (12%), Singapore (19%), Philippines (37,9°é) [68], [69], [71]
Ccftriaxon là kháng sinh mới thuộc thế hệ thứ 3 của nhóm cephalosporin, nó có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh lậu vì có hoạt tính cao đối với vi khuẩn lậu và đối với cả các chủng đã kháng lại peniciliin, tetracycline với mức độ cao Ty _lệ 100% các chủng vi khuẩn lậu nhạy cảm với ceftriaxon với MIC đưới 0,008 mcg/ml Theo WHO và một số nước trên thế giới cho đến năm 2000 chưa có chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ceftriaxon ở khu vực Đông Nam châu Á và
châu Phi [24], [26], [30], [33], [34] Cống theo thông báo cha WHO: nam 1998 ở Mỹ người ta đã phân lập được chủng vi khuẩn lậu kháng lại ceftriaxone trong
khi kháng sinh này được biết đến là rất nhạy cảm với vi khuẩn lậu ở hầu hết các quốc gia trên thế giới [5Š]
Vấn để đa kháng với kháng sinh của vi khuẩn lậu ngày càng được đề cập đến nhiều, nhất là ở những nước đang phát triển Đặc biệt là các chủng TRNG/PPNG
Trang 24lần đầu tiên được phân lập ở Anh, Pháp năm 1988 Ở châu Phi, các chủng TRNG/PPNG chiếm 80% các chủng phân lập {27}, [55], [61]
- Ngày nay, các chủng đa để kháng đã lan rộng, nguyên nhân là do dùng kháng sinh tetracyclin và penicillin đường uống để điều trị bệnh lậu tại những
nước đang phát triển
Không chỉ đừng lại ở đó người ta còn ghi nhận nhiều kiểu đa để kháng với 1 trong 2 loại hay cả 2 loại kháng sinh trên với kanamycine, chlorarnphenicol và quinolone Nhiều tác giả cho rằng các chủng đa để kháng này còn làm giảm
nhạy cảm với các cephalosporin thế hệ 3 [8], [27]
2.3 Bệnh lậu và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam 2.3.1 Tình hình bệnh lậu ở Việt Nam
Trang 252.3.2 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam
Trong tình hình kinh tế thị trường thời mở cửa, xã hội Việt Nam cũng có những biến đổi tiêu cực nhất định, trong đó nổi lên các vấn đề tệ nạn xã hội mà nạn mại dâm là một vấn đề đáng báo động Một trong những hậu quả của hành nghề mại dâm là các bệnh LTQĐTD phát sinh và phát triển Một trong những bệnh hay gặp nhất là bệnh lậu Do việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát mà vi khuẩn lậu ngày nay đã kháng lại các kháng sinh thông thường, vì vậy các thầy thuốc lâm sàng phải thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới mà sự kháng lại những kháng sinh nay cia vi khuẩn lậu chưa có hoặc tỷ lệ còn thấp
Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu đối với kháng sinh như:
- Theo Lê Tử Vân và cộng sự (1978-1981): tỷ lệ vi khuẩn lậu nhạy cảm với
penicillin (59,04%); tetracycline (60,08%); erythromycin (63,05%) [18]
- Theo Đào Việt Hải và cộng sự nghiên cứu tại Đắc Lắc (1991): tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại peniclln là 88%; cephalothin (18,25%); tetracycline
(88,35%); cloramphenicol (39,47%) và erythromycIne (38,64%) [6]
- Theo Nguyễn Văn Thục tại thành phố Hồ Chí Minh (1994): tỷ lệ vi khuẩn
lau khang lai penicillin 14 94,67%; tetracyclin (5,33%); gentamycin (15,38%); ceftriaxone (0%); chloramphenicol 1,33%; nalidixic acid 1,33% [17]
- Theo Lé Van Hưng, (từ 4.1997 đến 3.1998) tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại
penicillin 14 80,43%; ciprofloxacin (5,43%); tetracycline (31,52%); nalidixic
acid (12,3%) [10]
- Theo Lê Thị Phương (1996-2000) tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là 65,46%; cephalothin (5,15%); tetracyclin (40,50%); erythomycin (2,06%);
Trang 26ciprofloxacine (42,67%); nalidixic acid (56,68%); chloramphenicol (23,23%); specunomycine (0,64%) [12] [13]
Qua tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trên Thế giới và ở Việt Nam có thể sơ bộ nhận định: penicillin, ciprofloxacine và tetracycline là những kháng sinh bị vi khuẩn lậu kháng lại cao nhất (dao động từ 40-60%) Đã xuất hiện chủng vi khuẩn lậu kháng lại spectnomycine là kháng sinh hiện đang được coi là có hiệu lực để điều trị bệnh lậu [66], [68], [69]
- Trên Thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu về nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với vi khuẩn lậu, các tác giả đều cho rằng: tuỳ từng nước, từng vùng ma MIC của các kháng sinh với vi khuẩn lậu có khác nhau vi dụ khi nghiên cứu về ciprofloxacin theo Dan M tại Israel MIC đao động từ 1-4 mcg/ml, nhưng theo Martin I tai Canada thi MIC dao dong tir 1-32 mcg/ml
Trang 273 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Chủng vi khuẩn lậu
571 chủng vi khuẩn lậu được lấy ngẫu nhiên từ 880 chủng đã được chúng tôi làm xét nghiệm xác định từ 8662 bệnh nhân
Các bệnh nhân trên đều có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, viêm kết mạc mắt, được các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán nghi nhiễm vi
khuẩn lậu
Tại Viện Da liễu Trung ương và Trung tâm Da liễu Hà Nội, từ tháng 1 năm 2001 đến tháng 12 năm 2003
3.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Đối với bệnh nhân nam giới:
Lậu cấp: miệng sáo đỏ, sưng, có mủ hoặc địch tiết ở niệu đạo có màu trắng đục, vàng hoặc hơi xanh, khi đi tiểu thấy nóng buốt, đôi khi có lẫn máu
Lậu mạn tính: các triệu chứng không rầm rộ, không điển hình như lậu cấp, đi tiểu ít nóng hơn, mủ ít hơn, có khi chỉ tiết địch vào buổi sáng
- Đối với bệnh nhân nữ giới :
Hội chứng tiết địch âm đạo có thể thấy đi tiểu buốt hoặc khó tiểu tiện
Khám tuyến Skène, Bartholin, niệu đạo, cổ tử cung có mủ vàng hoặc hơi xanh
Bệnh nhân có cảm giác đau bụng, có viêm đỏ lỗ niệu đạo, đôi khi có sốt nhẹ - Viêm kết mạc mắt trẻ sơ sinh :
Sau đẻ 48 giờ mắt trẻ sưng tấy, đau, không mở được, mủ xuất hiện giữa hai mí mắt Trẻ đau quấy khóc, hai mí mắt sưng to
Trang 28- Khám lâm sàng không có triệu chứng của bệnh lậu - Các bệnh nhân tưởng tượng mình bị bệnh lậu - Dang dùng thuốc kháng sinh
3.1.4 Vi khuẩn nghiên cứu
Vi khuẩn gây viêm kết mạc mắt, niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung được để cập đến trong nghién cifu nay 1a: Neisseria gonorrhoeae
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Môi trường phán lập vỉ khuẩn lậu
3.2.1.1 Môi trường Thayer-Marfin và cách pha chế
Thạch GC chứa 10% Hemoglobin Powder của hãng BBL, (Mỹ) (Baluimore Bacteriological Laboratory) Cách pha chế môi trường - - GC Agar Base: 36g - Nước cất 2 lần có pH=7,3: 500 ml - Đun cách thủy cho tan hết thạch, hấp ướt 121°C trong 15 phút để nguội xuống 50°C - Bột máu bò khô: 10g
- Nước cất 2 lần, pH=7,3: 500ml (cho 100ml nước cất 2 lần vào 10g bột máu bò khô trộn đều cho tan hết, cho đủ 500ml nước cất)
- Hấp ướt 121°C trong 15 phút, để nguội xuống 50°C, cho 1% chất tăng
sinh, 1% chất ức chế vào môi trường máu bò, lắc đều phân phối ra cdc hop petri
Trang 29- Chất tăng sinh Isovitalex của BBL (Mỹ) bao gồm các acid amin giàu dinh
dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn lậu phát triển
- Chất ức chế V-C-N (BBL) (Mỹ) là chất ức chế trực khuẩn Gram (-), Gram
(+), cầu khuẩn Gram (+) và nấm nhưng không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lậu
3.2.2 Môi trường Thayer-Martin lam kháng sinh đồ Cách pha chế môi trường -
- 36g thach GC Agar Base hoa với 500ml nước cất 2 lần đun sôi cho thạch tan hết hấp ướt 121°C trong 15 phút, lấy ra để nguội xuống 50°C rồi cho vào
môi trường 1% Isovitalex (chất tăng sinh), lắc đều
- 10g bột máu bị khơ hồ trong 500ml nước cất 2 lần Khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn, hấp ướt 121°C trong 15 phút Để nguội xuống 50°C, trộn đều với môi trường GC Agar đã chuẩn bị ở trên, đổ vào hộp petri có đường kính 9cm với số lượng 25ml thạch Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng và để vào tủ ấm 37°C trong thời gian từ 18-24 giờ để kiểm tra độ vô khuẩn
Bảo quản môi trường trong tủ lạnh 4-8°C, sử dụng trong vòng 10 ngày 3.2.3 Môi trường phân hủy đường nhanh :
Neisseria-4H của hãng BIO-RAD (Mỹ)
3.2.4 Chúng chuẩn vi khuẩn lậu quốc tế: do WHO cung cấp
Ký hiệu các chủng: QA1, QA2, QA3, QA4, QA5, QA6
3.2.5 Các thanh giấy E-test của hãng AB-BI ODI SK-Thụy Điển
Dùng để xác định nồng độ ức chế tôi thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn
Trang 30Bao gồm 2 nhóm kháng sinh: Bảng 3.1: Nhóm chính Tên kháng sinh | Ký hiệu | Lượng kháng sinh/khoanh (hg) | Hãng sản xuất Penicillin PG 0,5 Oxoid Spectinomycine | SPT 100 Ciprofloxacine CIP i Ceftriaxon CRO 0,5 Tetracycline TE 10 Bảng 3.2 : Nhóm bổ sung ‘Ten khang sinh | Ky hiéu | Luong khang sinh/khoanh (ig) | Hang san xuat Chloramphenicol CL 30 Oxoid | Erythromycine E 15 Azithromycine AZM 15 Cefotaxim CTX 30 Cephalothin CE 30
3.2.7 Các dải giấy Acidometric
Phát hiện -lactamase có kích thước 5 x 0,5cm (Oxoid-Anh)
Trang 323.3.2 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
Theo qui trình kỹ thuật lấy bệnh phẩm của WHO (1995,1999) [63], [64]
+ Ởnữ giới
- Cổ tử cung: làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng, đặt mỏ vịt để bộc lộ cổ tử cung, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong cổ tử cung 2-3cm, để 5-10 giây cho dịch ngấm vào tăm bông, dàn mỏng trên tiêu bản
- 2 bên của tuyến Skène - 2 bên của tuyến Bartholin
- Niệu đạo: dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa sâu vào niệu đạo khoảng 1,5-2cm rồi xoay nhẹ tăm bông, để khoảng 5-10 giây
Rút tăm bông ra một cách nhẹ nhàng và dàn mỏng lên tiêu bản + Ởnam giới
Lậu cấp tính
Yêu cầu bệnh nhân bộc lộ bộ phận sinh dục, vuốt từ gốc đương vật lên dùng bông có thấm nước cất vô trùng, lau bỏ phần mủ ngoài trước khi lấy bệnh phẩm, dùng tăm bông đưa sâu vào niệu đạo 1,5-2 cm, xoay tròn, để tăm bông 5—10 giây cho dịch thấm vào tăm bông rồi rút ra một cách nhẹ nhàng, đàn mỏng trên
tiêu bản
Lậu mạn tính
Trang 33+ Dịch rỉ ở mắt trẻ sơ sinh
Đeo găng tay vô trùng, dùng ngón tay cái và ngón trỏ ấn nhẹ vào mí mắt trẻ
sơ sinh, mủ ở kết mạc chảy ra, dùng tăm bông vô trùng để lấy bệnh phẩm, để 5—
10 giây cho mủ ngấm vào tăm bông
Dàn bệnh phẩm lên tiêu bản, để khô tự nhiên và cố định bệnh phẩm bằng cách hơ nhẹ trên đèn cồn và tiến hành nhuộm Gram
3.3.3 Kỹ thuật nhuộm soi hình thể vị khuẩn và tế bào
Để khô tự nhiên, cố định trên ngọn lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải Tiến hành nhuộm Gram, nhuộm đơn theo thường qui của WHO năm 1995, 1999 Để khô tự nhiên
Nhận định kết quả :
Sử dụng kính hiển vi quang học với vật kính dầu
Khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy vi khuẩn có hình hạt cà phê 2 mặt đẹt úp vào nhau, bắt mầu Gram (-), vị trí nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa, kết luận là có song cầu khuẩn Gram (-), có thể nghĩ tới vi khuẩn lậu
3.3.4 Kỹ thuật nuôi cấy vì khuẩn
— Kỹ thuật lấy bệnh phẩm nuôi cấy chúng tôi tiến hành như kỹ thuật lấy bệnh phẩm soi trực tiếp
Trang 34Sau 18-24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu có đường kính từ 0,5-1 mm,
tròn, bờ khuẩn lạc đều, lồi, nhầy, óng ánh và có màu hơi xám Sử dụng 4 kỹ thuật để xác định vi khuẩn lậu:
- Nhuộm Gram: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn dàn lên tiêu bản, cố định tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram, soi trực tiếp dưới kính hiển vi quang học để xác định hình thể và tính chất bất màu của vi khuẩn
- Test Oxidase
Các bước tiến hành :
Dùng đầu Pipettc Pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên đải giấy thấm Whatman Nol kích thước 2,5 x 0,5cm đã được làm ẩm bằng 2-3 giọt thuốc thử: teramethyl P-phenylendiamin hydrochloride
1%
Phản ứng dương tính :
Trong vòng 5 giây khuẩn lạc từ màu đỏ hồng chuyển sang màu tím đậm - Test Superosol: lấy 1 lam kính sạch nhỏ lên 1 giọt dung địch
hydrogenperoxide 30% dùng que cấy lấy 4-5 khuẩn lạc trên đĩa hòa trực tiếp vào giọt thuốc thử trên phiến kính
Trang 35Môi trường Neisseria-4H gồm 4 loại đường : - Glucose - Mantose - Fructose - Sacharose + Chuẩn bị :
Dé hop kit ở nhiệt độ phòng - Phién thir (Well microplates)
- Dung dịch trộn vi khuẩn (Suspensolution)-2ml - Dung dịch Mc Farland cta kit-1ml
- Nắp nhựa đậy phiến thử - Micropipette nhỏ giọt - Que cấy
- Chủng vị khuẩn lậu cần thử + Các bước tiến hành :
- Chuẩn bị canh khuẩn: đùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy sau 18-24 giờ
- Hoà đều vi khuẩn lậu vào dung dịch có sẵn của kit - So sánh với độ đục Mc Farland số 3 của kit
- Dùng micropipette nhỏ vào mỗi giếng 100H] canh khuẩn trộn đều - Đậy nắp và ủ ở tủ ấm 37°C không có CO¿
Trang 36+ Cách đọc kết quả :
- Phản ứng đương tính: dung dịch chuyển sang màu vàng - Phản ứng âm tính: màu đỏ giữ nguyên
- Kết quả được so sánh với giếng chứng +Kết luận : Neisseria gonorrhoeae
Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu:
- Sơi trực tiếp: trên tiêu bản nhuộm Gram lấy mủ ở niệu đạo, cổ tử cung, dich ri mắt thấy có song cầu khuẩn Gram (-) hình hạt cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính
- Nuôi cấy: thấy khuẩn lạc đạng S, lấp lánh như giọt sương và có màu hơi xám Lấy khuẩn lạc nhuộm Gram thấy song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gr (-) đa đạng
- Test Oxidase (+) - Test Superosol (+)
- Test phan hiy duéng nhanh: chỉ phân huy dudng glucose Đủ những tiêu chuẩn trên ta kết luận: Neisseria gonorrhoeae 3.3.6 Kỹ thuật làm kháng sinh đồ
+ Kỹ thuật khuếch tán trên thạch
Tiến hành theo kỹ thuật khuếch tán trên thạch của WHO khuyến cáo cho chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu khu vực Châu Á Thái
Bình Dương [64]
Trang 37đày 4mm Hút bỏ canh khuẩn thừa trên mặt đĩa thạch - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch có đường kính 9 cm, đặt 6 khoanh giấy kháng sinh Khoanh giấy cách thành đĩa thạch 1 cm
- Để khoảng 10 phút cho kháng sinh khuếch tán đều
- Ủ ấm 35-36°C, 3-10% CO,, độ ẩm >70% Sau 18-24 giờ đo bán kính vùng vô khuẩn, kết quả tính bằng mm và so với bảng chuẩn
Cách đọc kết quả :
- Đo bán kính vùng vô khuẩn bằng thước tính ra mm nếu vùng vô khuẩn rõ ràng
- Nếu mép vùng vô khuẩn không rõ ràng đọc 80% bán kính vùng vô khuẩn - Nếu trong vùng vô khuẩn có một vài khuẩn lạc thì lấy khuẩn lạc đó ra nhuộm Gram Nếu đúng là vi khuẩn lậu, vẫn đo bán kính vùng vô khuẩn
- Nếu vùng vô khuẩn không tròn đều ta chọn ria nào tròn nhất thì đo và tính bán kính vùng vô khuẩn
*Kỹ thuật làm chứng kháng sinh đồ
Sử dụng vi khuẩn lậu (chủng chuẩn quốc tế) áp dụng cho từng lô môi trường và khoanh giấy kháng sinh Đọc kết quả và so sánh với độ nhạy của chủng chuẩn Từ đó đánh giá chất lượng môi trường và chất lượng khoanh giấy kháng
sinh
Đánh giá kết quả -
Trang 38S (Susceptible): nhay cam 1 (intermediate): trung gian R (Resistant): dé khang Bảng 3.3: Kích thước vùng vô khuẩn của các mức độ tính bằng mm (GASP) Các kháng sinh | Ký hiệu S I R Ghi chú Ceftriaxon CRO >6 <6 B kính Ciprofloxacine CIP >6 <6 - Cefotaxim CTX | >10,5 7,5-10,5 <7,5 - Tetracycline TE >2 non TRNG | <I TRNG ˆ Spectinomycine SPT >6 0 0 - Penicillin G PG >9 4-9 <3 - Chloramphenicol CL 212 <12 - Erythromycine EM 214 10-13,5 <10 - Cephalothin CE >9 6-9 <6 - Azithromycine AZM >9 6-9 <6 - + Kỹ thuật xác định MIC của kháng sinh với ví khuẩn lậu (E-test) Nguyên lý:
Trang 39Các bước tiến hành :
- Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ - Hoà đều vi khuẩn với nước muối sinh lý 0,9%,
- So với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland tương đương với 10Ẻ vi khuẩn/1ml
- Dùng tăm bông vô khuẩn nhúng vào canh khuẩn, ép tăm bông vào thành trong của ống canh khuẩn, loại bỏ canh khuẩn thừa
- Ria tăm bông lên bề mặt môi trường sao cho các đường ria liền nhau - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút
- Đặt các thanh giấy kháng sinh E-test Để khoảng 10-15 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuếch tán đều
- Để vào tủ ấm nhiệt độ 35-36°C, nồng độ CO, 3-10%, độ ẩm >70%
- Sau 18-24 giờ đánh giá kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với sự phát triển của vi khuẩn lậu
Cách đọc kết quả :
- Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử rõ ràng, kết quả MIC được đánh giá ứng với nồng độ kháng sinh in trên thanh thử tại góc bé bị ức chế
- Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử không đều nhau, kết quả được đánh giá ở phía vùng ức chế có giá trị nồng độ kháng sinh cao hơn
- Khi vùng ức chế vi khuẩn thấp hơn giá trị nhỏ nhất của thanh thử, kết quả được đánh giá là nhỏ hơn giá trị thấp nhất của nồng độ kháng sinh in trên thanh thử
Trang 40Bảng 3.4 : MIC của vi khuẩn lậu với một số kháng sinh Tên kháng sinh S (mcg/ml) I(mcg/mì) R(mcgíml) Ceftriaxon <0,25 - — Penicillin <0,06 0,12-1 >2 Spectinomycine <32 64 >128 Ciprofloxacin <0,06 0,5-0,06 >1 Chloramphenicol <0,5 - >2 Tetracycline <0,5 >2 >16 TRNG 3.3.7 Kỹ thuật xác định f-lactamase Dùng dải giấy acidometric (paper acidometric method) Nguyên lý :
Khi có sự hiện diện của B-lactamase thi men nay thuy phan benzyl penicillin thành peniciloid acid làm cho pH thấp và acid này khử iodine trong dải giấy, kết quả là màu xanh tím chuyển sang vàng
Cách làm :