Chương1 :Tổng quan về lý thuyết1.1Tình hình nghiên cứuvề Enzyme Pectinase hiện nay1.1.1Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase trong nước1.1.2Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase ngoài nước1.2Giới thiệuvề Enzyme Pectinase1.2.1Khái niệm về Enzyme Pectinase1.2.2Nguồn gốc của Enzyme Pectinase1.2.3Cơ chất của Enzyme Pectinase1.2.4Phân loại Enzyme PectinaseDựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhómchính:•Pectinesterase•Cácemzimkhửmạch polymer•Protopectinase1.2.5Cơ chế hoạt động của enzym pectinaseTrung tâm hoạt động của enzym pectinase1.2.5.1Pectinesterase(PE)1.2.5.2Protopectinase1.2.5.3Các enzyme khử mạch polymer a.Enzym thủy phân lien kết glycoside( Hydrolase)Polymethyl galacturonase (PMG)Polygalacturonase(PG)b.Enzymcắt (Lyase)Polymethylgalacturonatelyase (PMGL)Polygalacturonatelyase (PGL)1.2.6Thu nhận Pectinasea)Nguồn thun hậnb)Thu nhận1.Thu nhận từ canh trường bề mặt2.Thu nhận từ canh trường bề sâuPhương pháp hiếu khíPhương pháp yếm khíChương2 :Ứng dụng của Enzyme Pectinase trong công nghệ thực phẩm2.1 Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang2.2 Ứng dụng trong lên men trà và cà phê2.3Sử dụng chế phẩm Pectinase trong trích ly các dược liệu đông y2.4Ứng dụng chếphẩm Pectinase trong sản xuất nước quả2.4.1Sử dụng Enzyme để sản xuấtnướcquả thanh trùng uống trực tiếptừ quả táovà quả vả2.4.2Sản xuất nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử2.4.3Sản xuất nước quả từ nho2.4.4Sản xuất nước mận2.5 Ứng dụng trong quá trình trích ly dầu thực vật2.6 Các ứng dụng khác trong công nghệ thực phẩm2.6.1Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy2.6.2Xử lí nước thải có chứa pectin2.6.3Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast2.6.4Sử dụng chếp hẩm Pectinase trong trích ly các dược liệu đông y
Chương I : Tổng quan về lý thuyết 1.1Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase hiện nay 1.1.1 Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase trong nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus. 1.1.2 Tình hình nghiên cứu về Enzyme Pectinase ngoài nước Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000). Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997).Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol, gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) 1.2 Giới thiệu về Enzyme Pectinase 1.2.1 khái niệm về Enzyme Pectinase Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, metanol.Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá.Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase.Chúng cũng có thể được chiết xuất từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “ thao tác trên gen trên chủng Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng hợp các enzyme phân giải pectine. 1.2.2 Nguồn gốc của Enzyme Pectinase Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzym này. Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001). Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease. Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá.Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase. 1.2.3 Cơ chất của Enzyme Pectinase Pectin là cơ chất của enzym pectinase.Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl * của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na + , K + hoặc NH4 + , hay bị decacboxyl hoá … Công thức nguyên của acid galacturonic: C 6 H 10 0 7 Công thức cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1. α-Galacturonic acid Β-Pectic acid Hình 1.1 :Cấu tạo của acid α- galacturonic và khung cấu tạo của pectin Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). Protopectin Đây là dạng pectin nguyên thuỷ.Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau.Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể.Dạng muối của acid pectic gọi là pectat. Acid pectinic Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp. Pectin Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic là thành phần chủ yếu. Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây Trái cây Hàm lượng pectin (% trọng lượng tươi) Táo 0,71 – 0,84 Chuối 0,59 – 1,28 Cà rốt 1,17 – 2,29 Nho 0,09 – 0,28 Bưởi 3,30 – 4,50 Chanh 2,80 – 2,99 Cam 2,34 – 2,38 Mơ 0,71 – 1,32 1.2.4 Phân loại Enzyme Pectinase Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính: Pectinesterase Các emzim khử mạch polymer Protopectinase Sơ đồ 1.2: Sơ đồ phân loại enzym pectinase 1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzym pectinase Trung tâm hoạt động của enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. 1.2.5.1 Pectinesterase(PE) Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) 1.2.5.2 Protopectinase Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. 1.2.5.3 Các enzym khử mạch polymer Chia làm 2 tiểu nhóm: a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase) Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại: - Endo-PMG: cắt ngẫu phân nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin. Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG) -Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin. Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG) Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: - Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG) - Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG) b. Enzym cắt (Lyase): Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5. Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm: Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin. - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin. Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại: - Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. [...]... xuống 24 độ C và nuôi trong 48 – 52 giờ Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế Để thu được Pectinase tinh khiết thì enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ (etanol 72,5 – 75% hoặc iso-propanol 55 – 57%) hay muối amoni sunfat có độ bão hòa 0,79% Nếu dùng etanol độ tinh khiết của chế phẩm enzyme khoảng 90%, nếu dùng muối thì khoảng... mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật Khi quả bị hư hỏng hoặc thực vật chết chúng sẽ cùng các loài VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật Bên cạnh Pectinesterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE như: cà chua, đậu nành, thịt quả chuối, quả cam, táo,… Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loại nấm... 1.2.6 Thu nhận Pectinase a) Nguồn thu nhận: Vi sinh vật tổng hợp Pectinase: Nguồn giàu Enzyme Pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Nấm mốc: Penicillium glaucum, P ehrlichii, P chrysogenum, P expanam, P.cilrimim, Aspergillus awamori, A foetidus, A niger,… Nấm men: Saccharomyces fragilis Vi khuẩn: Bacillius Polymyxa, Flavobacterium pentinovorum,… Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất... lượng 210% Trong quá trình nuôi cấy hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6 xuống còn 1,5 – 1,8% Để thu chế sản phẩm khô cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5 – 8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165 – 180 độ C và đi ra đạt 60 – 70 độ C Thời gian lưu của chế phẩm enzym trong thiết... phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 độ C Chế phẩm thu nhận được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với etanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối ammoniumsulfate (50-80%) Nếu kết tủa bằng etanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90%... nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có hai phương pháp sản xuất: 1 Thu nhận từ canh trường bề mặt: Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm nguồn dinh dưỡng bổ sung thường lá các muối ammonium, phosphoric…độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60 độ C nấm mốc A awamori thường được nuôi cấy ở 30 độ C trong thời gian 40 giờ, sau đó giảm xuống 24 độ C và nuôi trong. .. đã xử lý là 6,5 – 6,8 Nếu kết tủa bằng 2 – 2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzym trong kết tủa đạt 93 -95% so với hoạt độ ban đầu Phương pháp hiện đại chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường thép các bước cơ bản sau: • • • • Khử muối bằng phương pháp lọc gel Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang Tinh sạch bằng FPLC ... được tiến hành ở nhiệt độ 35 đọ C Cl Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu được pectinase thành phần môi trường có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)HP04 0,4%; K2HP04 0,7%; KH2P04 0,3%, NaCl 0,1%, MgS04 0,025%; FeS04 dạng vết, CaC04 0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic 0,5% Có thể thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium... rượu là 2 – 5 độ C, thời gian tiếp xúc của rượu càng ít càng tốt Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sây chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem đi bào quản 2 Thu nhận từ canh trường bề sâu: Phương pháp hiếu khí Sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng... phương pháp thẩm tích, sau đó sấy khô Phương pháp yếm khí Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HP04 0,75%; KH2P04 0,1%; CaC03 0,3%; nước chiết ngô: 0,5% Clostridium pectinofermentants có khả năng tổng hợp Pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tang trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời sự tích lũy sinh khối Sự tích lũy enzym tối đa tương ứng với pha ổn định của sinh trưởng qua 5-60h pH ban đầu của . tươi) Táo 0,71 – 0,84 Chuối 0,59 – 1 ,28 Cà rốt 1,17 – 2, 29 Nho 0,09 – 0 ,28 Bưởi 3,30 – 4,50 Chanh 2, 80 – 2, 99 Cam 2, 34 – 2, 38 Mơ 0,71 – 1, 32 1 .2. 4 Phân loại Enzyme Pectinase Dựa vào đặc. (Maria, 20 00), Botrytis cinerea (Wubben, 20 00), Rhizopus stolonifer (Blandino, 20 01), Aspergillus awamori (Blandino, 20 01), Penicillium viridicatum (Dênis, 20 02) , Trichoderma reesei (Lisbeth, 20 03),. nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 20 00; Blandino, 20 01; Denis, 20 02) 1 .2 Giới thiệu về Enzyme Pectinase 1 .2. 1 khái niệm về Enzyme Pectinase Enzyme pectinase là một nhóm