Động học enzym

Động học enzym

2.2.3 Các phương pháp tách từng phần protein enzyme 28

43

3.2.1 Các lớp enzyme 44

4.5 Phương pháp thăm dò và phát hiện các nhóm chức năng trong

trung tâm hoạt động của enzyme

57

4.5.2 Phương pháp đánh dấu bằng cơ chất đặc hiệu hoặc coenzyme 59

Chương 7 Động học Enzyme 74

8.2 Điều hòa hoạt độ và số lượng của enzyme trong tế bào 94

Chương 1

Mở đầu1.1 Định nghĩa enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Chúng có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi

là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme

1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme

Do enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần lớn các nghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme

Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII

- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX

- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX

- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay

1.2.1 Giai đoạn 1

Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men

1.2.2 Giai đoạn 2

Ở giai đoạn này các nhà bác học đã tiến hành tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men

Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố gắng đi sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men Van Helmont

đã nhận thấy thực chất của sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức

ăn và giải thích cơ chế của nó với sự so sánh nó với quá trình lên men rượu Danh từ ferment (từ chữ Latinh fermentatio - sự lên men) được Van Helmont dùng để chỉ tác nhân gây ra sự chuyển biến các chất trong quá trình lên men rượu

Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumur cũng đã nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa Nhà tự nhiên học này đã cho chim quạ đen nuốt những miếng thịt đặt sẵn trong ống kim loại

có thành đã được đục sẵn và buộc vào dây thép Sau vài giờ đã không thấy

gì ở trong ống Hiện tượng này đã thúc đẩy sự nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả năng tiêu hóa của dịch dạ dày Sau thí nghiệm này một thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý là Spalanzani đã lặp lại thí nghiệm bằng cách lấy dịch dạ dày trộn với thịt mới và thấy có hiện tượng hòa tan xảy ra

Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây

ra quá trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây

Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc bấy giờ

Tiếp đó người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như enzyme phân giải protein của dịch tiêu hóa trong dạ dày như Pepsin (Emberle và Shwan) - những nhà khoa học người Đức, năm 1836)

Sau đó, lý thuyết xúc tác đã ra đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius có quan điểm cho rằng tăng tốc độ phản ứng là hiện tượng xúc tác Đây là một quan điểm đúng Song thật đáng tiếc là nhà khoa học này

đã coi các chất xúc tác này hoạt động được là do " lực sống" không theo

sự điều khiển của con người Đây là quan điểm duy tâm, siêu hình đã làm trì trệ sự phát triển của khoa học nhất là ảnh hưởng sâu sắc đến sưh phát triển của ngành enzyme học

1.2.3 Giai đoạn 3

Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX Ở giai đoạn này một số lượng rất lớn các enzyme ở dạng hòa tan đã được tách chiết

Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh với nhau: đó là trường phái Pasteur - nhà bác học vĩ đại người Pháp và trường phái Liebig

- nhà bác học nổi tiếng người Đức

* Trường phái Pasteur:

Năm 1856 Pasteur đã đề cập đến bản chất của quá trình lên men Ông cho rằng không thể tách các enzyme khỏi tế bào Tác dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống của tế bào và quá trình lên men rượu

là kết quả hoạt động sống của tế bào nấm men chứ không phải là kết quả của tác dụng của enzyme Ông đã tiến hành thí nghiệm và nhận thấy nếu một dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để trong bình đã khử trùng thì không xảy ra quá trình lên men rượu Chính vì suy nghĩ ấy, Pasteur đã chia các enzyme thành 2 loại: "enzyme có tổ chức" và "enzyme không có

tổ chức"

Theo ông, các "enzyme có tổ chức" là những enzyme không thể tách khỏi tế bào, khi tách chúng sẽ bị mất tác dụng xúc tác như các enzyme của các tế bào nấm men thực hiện quá trình lên men rượu; còn các "enzyme không có tổ chức" là các enzyme có thể thực hiện tính xúc tác của nó ngoài cơ thể như các enzyme có trong dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin ở trong

dạ dày, amylase ở trong tuyến nước bọt, trong mầm thóc )

Quan điểm sai lầm này của Pasteur đã thống trị ngành enzyme học trong một thời gian dài Năm 1878 Kuhne đã đề nghị dùng danh từ

"ferment" (từ tiếng Latinh: fermentatio = lên men) để gọi các "enzyme cớ

tổ chức" và đã gọi các chất chiết có tác dụng xúc tác cho phản ứng hóa học là các enzyme (từ chữ Hy Lạp: en = bên trong, zyme = men rượu, tức

là "ở trong nấm men" để gọi các enzyme "không có tổ chức" Danh từ enzyme được xuất phát từ đây

* Trường phái Liebig:

Chống lại quan điểm trên của Pasteur, Liebig (trước đó có cả Berzelius) cho rằng có thể không có hoạt động của các tế bào vi sinh vật cũng có quá trình lên men Điều đó có nghĩa là ông coi enzyme như là một chất hóa học gây nên hiệu quả tương tự như các chất xúc tác, tác dụng cả ở trong và ngoài tế bào, không phụ thuộc vào hoạt động sống cúa vi sinh vật.Nhưng năm 1871 Liebig thất bại vì thực nghiệm không chứng minh được quan điểm trên của mình Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men đã nghiền nát đều không có tác dụng gây lên men rượu Cũng vào năm1871 Manatxein là một bác sĩ người Nga đã dùng cát thạch anh nghiền các tế bào nấm men và thu được dịch chiết không chứa tế bào có khả năng biến đổi đường thành rượu Nhưng những quan sát này đã không được ai chú ý tới Chính vì vậy, quan điểm siêu hình của Pasteur đã hạn chế khá nhiều sự phát triển của ngành enzyme học Đến năm 1897, H Büchner - một nhà khoa học người Đức đã nhận được dịch chiết nấm men bằng cách phân huỷ tế bào hoàn thiện hơn Trong thí nghiệm này, các tế bào nấm men được nghiền nát hoàn toàn cùng với bột thủy tinh, sau đó được ép bằng áp suất cao Dịch chiết thu được không chứa tế bào vẫn có khả năng gây ra quá trình lên men (chuyển hóa glucose thành rượu) Điều đó chứng tỏ quá trình lên men rượu không phải là kết quả của hoạt động sống của tế bào nấm men mà là kết quả tác dụng của các enzyme vốn có trong các tế bào Do đó, quan điểm sai lầm

về enzỵme "có tổ chức" và enzyme "không có tổ chức" mà thực chất là về bản chất của enzyme đến lúc này mới hoàn toàn bị đánh đổ, mở ra một thời kỳ phát triển mới của ngành enzyme học Cũng từ đó đã không có sự phân biệt về nội dung giữa thuật ngữ "ferment" và "enzyme" Có thể nói rằng, công trình của Büchner đã đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong lịch sử phát triển của enzyme học Sau đó, nhiều loại enzyme trong

cơ thể sống đã được tìm ra Vì vậy việc phân loại và gọi tên các enzyme một cách thống nhất càng cần thiết Năm 1883, Duyclo, nhà bác học Pháp

đã đề ra nguyên tắc phân loại enzyme theo cơ chất (substrate) do chúng biến đổi và thêm đuôi tận cùng "ase" vào Ví dụ enzyme phân giải tinh bột (amilun) là amylase Tuy vậy, trong thực tế còn tồn tại nhiều ngoại lệ về thuật ngữ, ví dụ những tên gọi enzyme pepsin, trypsin, catalase trước đây vẫn được dùng

Ở thời kỳ này, dựa vào thành tựu của hóa học, đặc biệt là hóa lý và hóa keo, các nhà khoa học đã hướng vào việc nghiên cứu các tính chất hóa

và lý học của enzyme cũng như hoàn thiện các phương pháp làm thuần khiết enzyme

Giai đoạn quan trọng nhất trong thời kỳ này là các công trình của nhà bác học vĩ đại người Đức E Fisher Ông đã đặt nền móng cho những khái niệm hiện đại về tính đặc hiệu của enzyme, về sự tương tác không gian giữa enzyme và cơ chất Giả thuyết nổi tiếng của ông là giữa enzyme

và cơ chất kết hợp với nhau như "ổ khóa với chìa khóa" Rồi những nghiên cứu của Bach và Palladin về các enzyme ôxy hóa khử đã tạo nên

cơ sở cho việc xây dựng học thuyết ôxy hóa khử sinh học Trong thời gian này người ta cũng đã phát hiện ra được tính tác dụng thuận nghịch của enzyme (Đanilepski, 1894), các coenzyme cũng đã được phát hiện (Harden và Young, 1906) Họ là những người đã khám phá ra rằng, dịch chiết tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho quá trình lên men là

"zymase" và "cozymase" Họ nhận thấy dịch chiết tế bào nấm men mất hoạt tính xúc tác nếu bị thẩm tích hoặc bị đun lên đến 50oC Nhưng dịch chiết đã bị thẩm tích không hoạt động sẽ hoạt động khi được trộn với dịch

đã bị đun nóng không hoạt động Như vậy hoạt độ phụ thuộc vào sự có mặt của hai loại chất: thành phần không bền với nhiệt (heat - labile); không có thể thẩm tích được (được gọi là zymase) và một phân đoạn bền với nhiệt (heat - stable), có thể thẩm tích được (được gọi là cozymase) Ngày nay chúng ta biết rằng "zymase" bao gồm tất cả enzyme, còn

"cozymase" bao gồm các ion kim loại, ATP, ADP và các coenzyme như NAD+ Thời gian này người ta cũng đã hiểu biết được tác dụng kìm hãm

và hoạt hóa của một số enzyme (Sorensen 1909) Vào đầu thế kỷ XX, đã phát sinh ra cơ sở động học trong tác động của enzyme dựa vào những nghiên cứu của nhà bác học Anh là Brown và nhà bác học Pháp là Henri Đến năm 1913, Michaelis và Menten đã phát triển các công trình trên và nêu lên thuyết động học của sự xúc tác enzyme

Sau đại chiến thế giới lần thứ nhất nhà bác học nổi tiếng người Đức

là Willstatter đã có rất nhiều cống hiến trong việc tìm hiểu bản chất hóa học của enzyme Đó là công trình khoa học 5 năm của ông và các cộng sự (1922) nhằm làm thuần khiết enzyme bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc Qua đó từ nhận xét thấy là ở những giai đoạn cuối của quá trình làm thuần khiết enzyme, thường bị mất đi những chất chưa được biết nào đó do, đó enzyme bị mất tính xúc tác, đã cho phép Willstatter nêu lên lần đầu tiên giả thuyết về enzyme hai cấu tử (enzyme hai thành phần) Nhóm hoạt động (coenzyme, coferment, agon) chỉ có khả năng xúc tác khi kết hợp với

phần protein đặc hiệu (apoferment, apoenzyme, feron = protein) nó xác định các đặc tính của enzyme và đóng vai trò chủ đạo trong việc thể hiện tác dụng xúc tác của enzyme Willstatter đã coi feron (protein) là chất trơ chả có tác dụng gì Agon là chất được hấp phụ trên chất này Và vào năm

1926, trong một dịp thuyết trình, ông đã cho rằng enzyme không thuộc một trong các hợp chất đã biết, tức là enzyme không phải là protein, không phải là glucid, mà chúng là những "chất đặc biệt" Đó chính là quan niệm sai lầm của Willstatter Ông là người đã tìm ra được nhiều phương pháp làm sạch enzyme cũng như làm sáng tỏ nhiều tính chất đặc hiệu enzyme Nhưng mục đích chính là làm sáng tỏ bản chất hóa học của enzyme thi ông lại không đạt được

Ngày nay người ta quan niệm nếu là enzyme hai thành phần thì phần coenzyme quy định kiểu phản ứng và chịu trách nhiệm làm bền Còn apoenzyme quy định tính đặc hiệu của enzyme cũng như tăng hiệu suất xúc tác

Coenzyme + apoenzyme = (holo) enzyme = (enzyme hoàn chỉnh)Coferment + apoferment = (holo) ferment

Coenzyme chỉ dùng để chỉ phần không phải protein của enzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme khi cho thẩm tích qua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập Phần không phải protein của enzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm "prostetic" khi nó liên kết chặt chẽ với phần protein của enzyme

1.2.4 Giai đoạn 4

Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết tinh được enzyme Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) đã thành công trong việc chứng minh protein được kết tinh từ hạt đậu tương là chất giống enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân urê Đây cũng chính là enzyme đầu tiên được kết tinh Bốn năm sau (1930) ở Mỹ Northrop đã tách được pepsin ở dạng tinh thể, và vào năm 1931 Northrop

và Kunitz cũng đã tách được trypsin ở dạng tinh thể

Trong thời kỳ này J.B.S Hardane đã viết quyển "Enzymes" Mặc dù lúc đó bản chất phân tử của Enzyme hầu như vẫn còn là bí mật, nhưng tác giả đã đưa ra dự đoán tuyệt vời về vai trò của các tương tác và liên kết yếu giữa enzyme và cơ chất trong cơ chế hoạt động của enzyme Điều này vẫn giữ nguyên tính thời sự trong thời đại của chúng ta

Các công trình của Sumner và Northrop đã mở ra một chương mới trong lịch sử phát triển của enzyme học hiện đại Những kết quả đạt được

đã cho phép xác định được một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein Phải nói rằng bản chất hóa học của phần lớn enzyme là protein và định nghĩa có tính chất kinh điển về Enzyme phải xem lại từ sau phát hiện của T R Cech năm 1981 Cech đã phát hiện một RNA có hoạt tính xúc tác như enzyme và gọi là ribozyme (xuất phát từ các tên ribose và enzyme) Ribozyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa tiền chất RNA thông tin (pre - m RNA) thành m-RNA Do đó enzyme không nhất thiết phải là protein! Đây là một phát minh có ý nghĩa rất lớn Tác giả của phát minh này được giải Nobel năm 1989 Cho đến nay khoảng 100 ribozyme đã được biết Có thể nói rằng, những công trình đã nói ở trên đã

mở màn cho giai đoạn thứ tư của lịch sử phát triển enzyme học kéo dài cho đến hiện nay

Từ giữa thế kỷ thứ XX, nhất là thời gian gần đây enzyme học phát triển rất mạnh Nhờ ứng dụng các phương pháp mới, hiện đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như cơ chế tác dụng của nhiều enzyme, cơ chế của quá trình sinh tổng hợp enzyme và sự điều hòa hoạt động của enzyme trong tế bào

Người ta đã xác định được cấu tạo của coenzyme Đã xác định được mối liên hệ của enzyme và các vitamin (nhiều vitamin là thành phần cấu tạo của coenzyme và phần lớn các vitamin tan trong nước là thành phần cấu tạo của các coenzyme)

Người ta cũng đã xác định được các enzyme xúc tác cho các quá trình trao đổi chất như: hệ thống enzyme đường phân, Embden - Meyerhof - Parnas năm 1933, hệ thống enzyme của chu trình Kreps - Szent Gyorgy năm 1937 (chu trình citric acid), chu trình ornithrin trong trao đổi chất của protein năm 1932 (Krebs - Henseleit) Nhờ những phương pháp mới trong việc tách và làm sạch enzyme, người ta đã xác định được vai trò rất quan trọng của kim loại trong sự xúc tác của enzyme

và tác dụng hoạt hóa của chúng Đã xác định được sự phân bố của các enzyme trong tế bào Đã nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như cấu tạo các protein enzyme Bằng phương pháp Rhengen, người ta đã nghiên cứu cấu trúc của của phân tử enzyme, như cấu trúc của ribonuclease (1960, Stein).Trong vòng hơn 40 năm trở lại đây đã nghiên cứu các enzyme sinh tổng hợp như nucleotide phosphorylase (Greenberg Marago, 1955), DNA

- polymesase ( Kornberg,1956), RNA - polymesase (Spieglman, Hurwist,

1958 - 1961) và các nghiên cứu về điều hòa sinh tổng hợp protein - enzyme của Jacob, Monod (1961).

Từ năm 1961 đã phát hiện ra isoenzyme trong cơ thể là enzyme xúc tác có thể tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, xúc tác trong cùng một cơ thể, cho một phản ứng, có sai khác một số tính chất như độ di động điện di

Năm 1969 người ta đã tổng hợp được enzyme đầu tiên là ribonuclease (Denkewalter và Hirschmann, Gutte và Merrifield) Đây là enzyme gồm 124 amino acid, bền với nhiệt, có thể đun nóng lên 800C với thời gian ngắn

Có thể tổng hợp enzyme bằng hai phương pháp khác nhau:

- Tổng hợp từng peptid riêng biệt rồi sau đó nối lại với nhau

- Dùng chất giá (polymer): cắm lên trên này một gốc amino acid, sau

đó cắm tiếp 123 gốc amino acid khác Việc tổng hợp này đã thành công trong 3 tuần bao gồm 11931 giai đoạn, 369 phản ứng Đã nêu lên được một phương pháp mới về tổng hợp enzyme Ở đây người ta đã dùng phương pháp tự động hóa, khi được 124 gốc amino acid thì chuỗi polypepid tự tách ra Điều này cho thấy mỗi khi chuỗi polypeptid đã được lựa chọn theo một trật tự đúng đắn thì có thể tự uốn cong trong không gian Đấy chính là khả năng tự tổ chức

Những thành tựu nghiên cứu cơ bản về enzyme là cơ sở để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tế

Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đầu thé kỷ XXI, người

ta đã chú ý nghiên cứu việc ứng dụng enzyme Người ta đã tận dụng các nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến các nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau Ở nhiều nước đã hình thành ngành công nghệ enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm enzyme để phục vụ cho các ngành sản xuất khác nhau và cho y học

1.3 Phương hướng nghiên cứu enzyme

Ngành enzyme học đã trải qua một thời kỳ phát triển khá dài Nhờ những phương pháp vật lý, hóa học, con người đã đạt được những thành tựu rực rỡ trong việc nghiên cứu bản chất của enzyme Kể từ khi các nhà khoa học đổ xô vào việc tìm kiếm bản chất của enzyme; từ suy nghĩ cho rằng sự xúc tác là do "lực sống" (Berzelius, 1835) qua việc coi enzyme chỉ hoạt động được khi còn ở trong cơ thể sống (Pasteur, 1856) đến việc khẳng định một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein (Sumner, Northrop (1926, 1930) và đến gần đây với phát hiện RNA có

hoạt tính xúc tác của enzyme và được gọi là ribosyme (Cech, 1981) và xem enzyme không nhất thiết phải là protein, chứng tỏ sự phát triển đầy sôi động của ngành enzyme học Có thể nói enzyme học là một môn học

có vị trí then chốt trong hóa sinh Môn học này đang phát triển mạnh mẽ

và xâm nhập vào rất nhiều ngành khoa học, nó đang là đối tượng nghiên cứu của các nhà hóa lý, hóa sinh, lý sinh và đặc biệt thu hút sự chú ý của các nhà sinh học và sinh y học vì những hiểu biết cơ bản về enzyme cũng như về sự xúc tác sinh học có liên quan mật thiết vơi sinh học phân tử và y học phân tử là những kiến thức cơ bản rất quan trọng của sinh học và sinh

y học

Bởi vậy, hiện nay hướng nghiên cứu và phạm vi của nhũng vấn đề enzyme học có thể được tóm tắt như sau:

1) Với mục đích xác định cấu trúc phân tử của chúng, người ta đang

cố gắng hoàn thiện những phương pháp tách và tinh chế enzyme Nhờ vậy

có thể nhận được các chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao để có thể dùng cho việc nghiên cứu những tính chất cơ bản và có thể sử dụng trong y học.Các phương pháp có thể tiến hành là:

- Sắc ký ái lực: Để giữ lại chất cần thiết và cho sang quá trình phản hấp phụ

- Sắc ký hấp phụ lựa chọn: Được tiến hành ở trên cellulose, sephadex.2) Nghiên cứu điều kiện và tốc độ tác động của các enzyme cũng như ảnh hưởng của các yếu tố vật lý và hóa học đối với hoạt động của enzyme.3) Làm sáng tỏ bản chất của quá trình xúc tác của enzyme và cơ chế tác dụng của nó Ở đây cần xem xét mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng của protein enzyme có khả năng xúc tác (ví dụ trong một số trường hợp xem trung tâm hoạt động của enzyme ở chỗ nào để tổng hợp ở phần đảm bảo chức năng của nó: papain ở trung tâm hoạt động của enzyme có nhóm SH ở 1/3 phân tử, vì vậy chỉ cần tổng hợp 1/3 phân tử enzyme là đủ cho mục đích của mình

4) Nghiên cứu sinh học enzyme Điều đó có nghĩa là phải tìm hiểu

sự tạo thành enzyme trong tế bào sống, tác dụng điều chỉnh hoạt động của enzyme, vai trò của chúng trong việc thực hiện các chức năng sinh lý khác nhau ở cơ thể sống Cần phải xem sự phân bố của enzyme trong tế bào, qua đó thấy được mối liên hệ giữa chức năng và cấu tạo giữa các thành phần tế bào Ngoài ra cũng cần nghiên cứu mối quan hệ hợp tác giữa các enzyme trong tế bào để xem quy luật tác dụng của enzyme Đồng thời

cũng cần nghiên cứu sự tiến hóa của enzyme liên quan với sự phát sinh và tiến hóa của sự sống.

5) Nghiên cứu tính đặc hiệu của các enzyme

6) Nghiên cứu cải tiến phương pháp và kỹ thuật thực nghiệm mới của hóa lý, sinh học vào nghiên cứu enzyme để thúc đẩy sự phát triển của enzyme học

7) Nghiên cứu enzyme ứng dụng trong thực tế nhằm mục đích hạ giá thành, tăng độ bền của chế phẩm Đó chính là mục đích cuối cùng của enzyme học Để thực hiện được mục đích này, cần phải có hướng giải quyết:

- Cải tạo nguồn nguyên liệu vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt

- Chọn phương pháp tách

- Dùng lặp lại (enzyme không tan)

Từ năm 1950 đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo các chế phẩm enzyme không tan bằng cách gắn enzyme vào các chất không hòa tan như thủy tinh, cellulose, nilon Nhờ ở dạng không tan nên có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định, vì vậy nâng cao hiệu quả sử dụng enzyme (Ví dụ trong công nghiệp dệt chế phẩm amylase của các vi khuẩn Bac subtilis, Bac mesentericus, Bac diastaticus, Bac amylosolvens có tính ưu việt là chịu nhiệt độ cao, dùng trong rũ hồ vải (tẩy lớp hồ bột trên vải, tạo điều kiện tốt, dễ dàng khi nhuộm, tẩy vải sau này, nhưng để tận dụng tiếp thì người ta liên kết với bột thủy tinh để tạo thành các chế phẩm enzyme không tan)

Việc ứng dụng enzyme amylase (α - amylase và glucoamylase) đã đem lại những thay đổi cơ bản trong kỹ thuật sản xuất đường tinh bột So với phương pháp acid, phương pháp thủy phân bằng enzyme có những ưu điểm hơn hẳn, lượng glucose thu được cao hơn (5 - 10%), cho phép loại trừ khả năng tạo thành các sản phẩm phụ có vị đắng, yêu cầu về thiết bị đơn giản, kết quả cho phép thu được glucose với hiệu suất cao, chất lượng tốt và giá thành rẻ hơn

1.4 Những vấn đề cần đề cập khi nghiên cứu enzyme

Thông thường khi nghiên cứu enzyme người ta thường xác định độ bền của chế phẩm enzyme Muốn vậy, cần xem xét những điểm sau đây:1) Tính chất phân tử protein enzyme

Trước hết phải xem đến tính chất lí học Đó là hình dạng phân tử điểm đẳng điện, độ bền của enzyme với pH, nhiệt độ

Kế đến phải xem tính chất hóa học của phân tử enzyme Đó chính là cấu trúc phân tử enzyme.

2) Tính chất xúc tác của phân tử enzyme Ở đây phải xem bản chất của phản ứng, tính đặc hiệu của enzyme

Phải chú ý đến cấu tạo của trung tâm hoạt động cũng như mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng của nó

Tính chất của enzyme: đó chính là các tính chất động học của enzyme.3) Tính chất sinh học của enzyme

Đó chính là sự phân bố của enzyme trong tế bào, sự sinh tổng hợp protein enzyme cũng như ảnh hưởng của sự thiếu hụt enzyme ở trong cơ thể sống

Ngoài ra ở đây cần chú ý đến ,mối liên hệ giữa enzyme nghiên cứu

và các enzyme khác, các tính chất miễn dịch cũng như tạo thành hiện tượng cảm ứng enzyme

1.5 Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450

trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời

đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Nguyễn Hữu Chấn, 1983 Enzyme và xúc tác Sinh học Nxb Y học, Hà Nội

2 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000 Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội

3 Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972 Enzyme I, II Đại học Tổng hợp, Hà Nội

4 Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo trình sinh hóa hiện đại Nxb Giáo dục, Hà Nội

5 Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn Đồng, 2004 Hóa sinh học Nxb Y học, Hà Nội

6 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật Nxb KH&KT, Hà Nội

7 Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000 Hóa sinh Công nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội

Tài liệu tiếng nước ngoài

1 Bermeyer H U, Bermeyer J and Grasel M (editors) 1983 Methods of enzymatic analysis Vol II Verlag chemie Weinheim

2 Lehringer A L., 2004 Principle of Biochemistry, 4th Edition W.H Freeman, 2004

3 Pelmont J., 1993 Enzymes Presses universitaires de grenobe

4 Stryer L., 1981 Biochemistry W.H.Freeman and company San Francisco

5 Biochemical information, 1973 Boehringer Mannheim GmbH Biochemica

Chương 2

Phương pháp nghiên cứu enzyme

Có hai loại phương pháp dùng để nghiên cứu các phản ứng enzyme Một trong hai phương pháp đó là lựa chọn các mẫu sau những thời gian nhất định và đo sự biến đổi của phản ứng enzyme Qua hàng loạt điểm riêng biệt nhận được sẽ xây dựng được đường biểu diễn của các bước phản ứng Phương pháp khác là tiến hành quan sát bản thân hỗn hợp phản ứng theo tiến trình xảy ra và có thể xây dựng được một số lớn những thay đổi, hoặc dựa vào các phương pháp tự động để ghi lại Chúng ta sẽ nhận được những đường biểu diễn liên tục các bước phát triển của phản ứng enzyme

Ở phương pháp đầu, người ta thường đo nồng độ cơ chất hoặc nồng độ sản phẩm của phản ứng Nếu phản ứng tăng thi cả hai cách vừa nêu ở trên có thể được sử dụng để đo hoạt động của enzyme

Trong mỗi trường hợp xác định tốc độ, người ta phải nhận được ít nhất là 3 điểm: một điểm ở thời điểm không, điểm thứ hai ở khoảng thời gian nhất định đã trôi qua, điểm thứ 3 ở khoảng thời gian lớn gấp hai lần khoảng trước Từ đó có thể kiểm tra được sự đúng đắn của phản ứng enzyme trong khoảng thời gian quan sát

Nói chung, phần lớn các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu các phản ứng enzyme là loại phương pháp nghiên cứu liên tục vì nó được mọi người ưa dùng hơn

2.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

Như phần đầu đã nói đến, enzyme là những chất xúc tác sinh học

có bản chất protein và rất không ổn định Trong những điều kiện bất lợi, chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú ý tránh những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó Thông thường phần lớn các enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 ± 2) Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme

Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân và các điều kiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme Đặc biệt là khi tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp Nhiệt độ thường

dùng cho các công việc này thông thường từ 00C đến 50C Đối với các enzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt

độ thấp hơn (từ - 50C đến - 200C) Trong các trường hợp này, người ta hay

sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí người ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc Ví dụ về một số hỗn hợp làm lạnh đã được trình bày trên bảng 2.1

Bảng 2.1 Hỗn hợp làm lạnh

Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được

Nước đá: H 2 SO 4 đậm đặc 100: 25 (4:1) - 20,0 0 C

Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch có

pH < 5 hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trong acid Do đó, tùy thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh pH quá acid hoặc quá kiềm Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ và rất thận trọng các acid hoặc kiềm Và khi thêm hóa chất

để điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 00C Khi làm việc với enzyme cũng cần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí Để tránh việc tạo bọt có thể xảy ra, người

ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được lắc Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tính enzyme Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm ammonium sulfate dưới dạng dung dịch bão hòa của nó

Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng ) không dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe ) mà dùng dụng cụ inox

Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn Ở một số trường hợp, khi tách và làm sạch enzyme có hiện tượng giảm dần hoạt độ, vì vậy cần phải làm thí nghiệm nhanh Tốt nhất là thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quảng Ví dụ tách chiết các enzyme chống oxy hóa (antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu không thì mất hoạt tính Còn ở microsome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn

không ảnh hưởng đến hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và các enzyme oxy hóa khử.

Một điều cần chú ý nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở nhiệt độ ấy Lúc này nhất thiết phải dùng máy ổn nhiệt ( thermostate) Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độ cần thiết thì mới tiến hành đo pH trong quá trình này cũng phải được giữ ổn định bằng dung dịch đệm và phải đảm bảo độ chính xác của pH: những phản ứng tạo acid thì phải thêm kiềm vào và ngược lại Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác lượng dịch enzyme Người ta thường dùng loại pipette không chia độ hoặc sau này dùng các loại micropipette Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzyme vào dung dịch nghiên cứu Ví dụ đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thì không nói chuyện nhiều Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp Một số enzyme ổn định ở dung dịch đậm đặc của ammonium sulfate Trong trường hợp này, người

ta giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm Trong điều kiện phòng thí nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme sẽ làm mất hoạt độ enzyme hoàn toàn Nhưng ở điều kiện chân không nếu sấy khô ở nhiệt độ thấp hoặc dùng phương pháp đông khô (lyophilization) thì có thể duy trì được hoạt động bình thường của chúng

2.2 Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme

2.2.1 Chọn nguồn nguyên liệu

Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển

của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim dùng để tách enzyme rất thuận lợi Dịch tuỵ tạng

có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác

Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông

tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein Renin là chế phẩm enzyme

có giá trị lớn trong công nghiệp

Ở thực vật: thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy Ví dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương

có nhiều enzyme urease

Thóc nảy mầm chứa nhiều α - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều β - amylase Người ta đã thu được một số chế phẩm enzyme thủy phân như papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu được từ các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa, còn fixin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus

Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiết xuất các chế phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu này không thể dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây:

- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài

- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được

- Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu

từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn và hạn chế ở trên

Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người

chủ động tạo ra được Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm.

Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất Số liệu tính toán cho biết, trong vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng

cơ thể chúng Trong khi đó, hệ enzyme của con lợn trên 50 kg chỉ có thể chuyển hóa được vài kg thức ăn trong ngày

Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, giá

rẻ, dễ kiếm như các phế liệu của các ngành sản xuất Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ để nuôi vi sinh vật Vì vậy dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao

Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời gian ngắn Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme

Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác

để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme Tuy vậy trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung các vi sinh vật muốn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn các điều kiện sau:

- Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn

- Dễ tách enzyme và không sinh độc tố

Có một điều lí thú là: trong điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý cơ thể của chúng ( thường được gọi là sự tổng hợp enzyme "bản thể") Nếu khi tăng hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, thì sự tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng Sự tổng hợp một lượng đáng

kể enzyme gọi là siêu tổng hợp enzyme

Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu hay là phương pháp nổi và phương pháp chìm

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm

ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ ) Để môi trường xốp người ta trộn thêm một lượng nhỏ mạt cưa Sau khi nuôi

đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường được sấy nhẹ, nghiền nhỏ Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế enzyme

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng Nguyên liệu chính và phổ biến là dịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn Sau khi nuôi, ta thu được canh trường lỏng - dạng thô

Để làm tăng lượng enzyme ở vi sinh vật chúng ta cần chú ý tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp được enzyme cần thiết và với số lượng nhiều Các chủng được phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), do đó cần tiến hành gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn, cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme

Ngoài ra cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của

vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Ví dụ: Muốn tách α - amylase ở nấm mốc (Asp Oryzae), người ta cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết α - 1,6 glucozid Muốn tách pectinase ở Asp Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin Đối với hemicellulase thì chất cảm ứng là hemicellulose; còn đối với proteinase chất cảm ứng có hiệu lực là protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomyces fradiae) Chất cảm ứng cũng có thể là những chất giống

cơ chất và những sản phẩm thủy phân của chúng Ví dụ: thay cho protein thì peptid và thay cho tinh bột thì erithrodextrin đều có tác dụng cảm ứng

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật Thông thường đối với α - amylase, pH tối

ưu cho sự sinh tổng hợp (pH = 7 - 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động của

nó (pH = 4,7 - 4,9) Các enzyme đường hóa khác của nấm mốc như glucoamylase thì pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp và cho hoạt động là chung nhau (4,5 - 5,0) Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng) Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có

thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

2.2.2 Chiết rút enzyme

Muốn tìm hiểu toàn bộ hoạt động sống của cơ thể sinh vật, chúng

ta phải biết bản chất của những biến đổi hóa học xảy ra trong từng mô tế bào Điều đó chỉ thực hiện được khi chúng ta tách được các tế bào ra khỏi các mô và chiết rút cũng như làm sạch các enzyme chứa trong chúng Từ các dạng enzyme tinh khiết thu được chúng ta có thể nghiên cứu sâu sắc

cơ chế tác dụng, tính đặc hiệu trong hoạt động xúc tác của chúng Tùy theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làm sạch cho thích hợp Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dầu trình tự và các thủ thuật ở các bước có thể thay đổi , song vẫn có những nguyên tắc chung

Như chúng ta đã biết, trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome ) của tế bào

Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều enzyme liên kết rất chặt chẽ với các cấu tử của tế bào

Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme

và chuyển chúng vào dung dịch

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết

bị đồng hóa (homogenizator) Thiết bị có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy Để việc phá vỡ có hiệu quả ở

mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn

đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô) Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các

mô liên kết

Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate

và chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ

Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính

Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý Trước hết đó là nhiệt độ Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút Ví dụ như nếu dùng máy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng Nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng Vì vậy cần dùng chất điện ly thích hợp Ví dụ khi chiết rút amylase, nếu cho thêm NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút thì hiệu suất chiết rút tăng lên 30% Người ta còn nhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% sẽ làm cho kết tủa enzyme tốt hơn và cấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn.

Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật,

có trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt độ enzyme Trong trường hợp này người ta còn cho thêm vào chất khử để loại màu Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của chlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xác định sau khi đã loại màu khỏi dịch chiết enzyme Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu Người ta thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và enzyme không bị giữ Ví dụ người ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc than hoạt tính Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn) Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn (Hình 2.1)

Hình 2.1 Thẩm tích để loại muối (NH 4 ) 2 SO 4 trong kết tủa protein

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất

có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc

pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc

ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt hoặc bền với acid

Thủ thuật được tiến hành như sau: dịch enzyme được giữ ở 50 -

700C hay ở pH = 5 trong một thời gian xác định Protein bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

2.2.3 Các phương pháp tách từng phần protein enzyme

Protein là các chất lưỡng tính,vì vậy trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau:

kiềmProtein - COOH protein - COO- + H+

acid

acid Protein - NH2 protein - NH+

3

kiềm

Ở một chỉ số pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm Kết quả là ở chỉ số nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau

Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch Mỗi một protein có một trị số pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không Trị số pH đó gọi là điểm đẳng điện Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein rất dễ bị kết tủa.Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp

Ở các phương pháp tách từng phần này, người ta có thể sử dụng phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng muối hoặc các dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký cột

Nói chung để đạt kết quả tốt, người ta thường phối hợp hai phương pháp với nhau

2.2.3.1 Dùng muối (NH4)2 SO4 để tách enzyme

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loại muối này lại rẻ và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C) Ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết

để kết tủa enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác

Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa

- Khi dùng bột:

Người ta cho từng ít một vào dịch chiết enzyme Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối

- Khi dùng dung dịch bão hòa:

Trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định Khái niệm về số phần trăm của độ bão

hòa hoàn toàn đã được đề cập đến Như ví dụ trên đã nói, enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH4)2

SO4 Khi cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết enzyme thì nồng độ (NH4)2 SO4 không tăng đột ngột

Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h hoặc để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu) Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2)

Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích như đã được trình bày ở phần trước Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt

Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ enzyme Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các enzyme có trọng lượng phân tử lớn xuống trước (xem phương pháp lọc gel 2.2.3.4.a)

Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng

Để tiện lợi người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH4)2 SO4

cho vào dung dịch đã có độ bão hòa cho trước (S1) để đạt đến một độ bão hòa cần thiết (S2)

Tùy theo trạng thái (NH4)2 SO4 cho thêm vào dung dịch chiết enzyme, mà có công thức tính toán khác nhau

một độ bão hòa nhất định Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn Lượng (NH4)2 SO4 đưa vào để dung dịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm.

- Đối với (NH4)2 SO4 ở dạng dung dịch bão hòa Thể tích (tính theo ml) của dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S1 để đạt đến một độ bão hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau:

100 (S2 - S1)

V (ml) =

1 - S2

2.2.3.2 Dùng dung môi hữu cơ

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước

Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu

Ở phương pháp này cũng chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống) Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới

00C và có thể đến - 200C, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme

Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy li tâm Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu

2.2.3.3 Dùng nhiệt

Cũng có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein enzyme tạp ra khỏi dịch chiết enzyme Tuy vậy phương pháp này ít được dùng vì hiếm enzyme bền với nhiệt

2.2.3.4 Các kỹ thuật sắc ký cột

Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết Do đó dịch chiết enzyme được

tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký (chromatography) là do hai chữ "chroma" là màu sắc và " grapho" là viết, nghĩa là "viết bằng màu" Thuở ban đầu, người ta đã sử dụng phương pháp sắc ký để tách các chất màu và chỉ sau này người ta mới áp dụng cho việc tách các chất không màu.

a Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl)

Gel sephadex là chất thoả mãn các yếu tố trên Sephadex là chế phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose Trọng lượng phân

tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu và lớn hơn Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kết glucsid 1,6 Sephadex nhận từ dextran bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử" và chất này trở thành không tan trong nước Số liên kết ngang tạo

ra càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ

Phương pháp lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này

là protein enzyme ) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ rơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (Hình 2.2

và hình 2.3.) Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex (Pharmacia) của Thuỵ Điển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác

nhau có ký hiệu từ G10 đến G200 Số ký hiệu nhằm chỉ ra mức độ nhận (hút) nước của chúng Ví dụ G10 để chỉ khi trương phồng thì 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g)

Hình 2.2 Hoạt động của lọc phân tử sephadex

Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng sau đây:

Các loại sephadex Trọng lượng phân tử

G 25 hạt tinh (F) hạt thô (C)

100 - 5000

G 50 hạt tinh (F) hạt thô (C)

Câc gel lọc phđn tử được sản xuất trong 4 cỡ hạt cùng trong một vòng lọc phđn tử: hạt thô (coarse), hạt trung bình (medium), hạt mịn (fine), hạt siíu mịn, rất mịn (superfine).

Hình 2.3 Tâch câc phđn tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel

Sự chính lệch nhiều vì phđn tử lượng của câc enzyme (12700 - 1.000.000) cho phĩp nghỉ rằng để tâch vă lăm sạch enzyme, phương phâp lọc gel sephadex lă phương phâp có nhiều triển vọng Nơi có ít liín kết ngang tâch chất có trọng lượng phđn tử lớn vă ngược lại Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quâ trình thẩm tích

Cùng nhóm chất rđy phđn tử có nguồn gốc polysaccharid, lă chế phẩm dextran như sephadex (pharmacia) còn có Molselect (Reanal) - lă sản phẩm của Hungary được ứng dụng nhiều trong nghiín cứu

Có thể dùng để lăm cô đặc câc chất có trọng lượng phđn tử lớn như protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh hơn so với thẩm tích), lọc gel tâch theo trọng lượng phđn tử (như protein huyết thanh) hoặc tâch câc sản phẩm protein được hình thănh dưới tâc dụng của enzyme phđn cắt (như γ - G - globulin bị cắt bởi papain)

Các phân tử lớn không thể đi vào các hạt Sephadex

Các phân tử nhỏ đi vào bên trong các hạt SephadexHạt Sephadex

Các Molselect cũng có ký hiệu từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng sau đây:

Các loại Molselect Trọng lượng phân tử

pH từ 2 – 11 Chất thứ ba là agarose loại sulphate Hay phổ biến là loại sepharose (pharmacia) Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử

có trọng lượng lớn hơn 106

Tóm lại bằng phương pháp lọc phân tử người ta có thể tách các chất

có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polymer, polysaccharid, nucleic acid , protein) ra Người ta có thể dùng kỹ thuật này

để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme.Việc sắc ký, lọc phân tử protein hoặc chiết xuất protein thường thu được dung dịch loãng, nếu không cô đặc dung dịch để cho phù hợp đối với các nghiên cứu tiếp theo thì không dùng được Molselect G -

25 rất thích hợp cho việc cô đặc các dung dịch loãng của các chất có trọng lượng phân tử lớn như protein, peptid Bằng cách trộn với dung dịch protein loãng, Moltelect sẽ nhận nước và chất có trọng lượng phân tử nhỏ, như vậy dung dịch protein được cô đặc mà không có sự thay đổi về pH và lực ion của nó

b Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.

* Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose

Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) - là một dẫn xuất este của cellulose Cellulose - O - CH2 – COOH Khi phân li cho ra COO- Đây là chất trao đổi cation Trên những cationit, thì các protein kiềm có thừa những nhóm amin và những nhóm kiềm khác được hấp phụ Sự hấp phụ trên các cationit được tiến hành với những dung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5 (Các protein kiềm có chứa các amino acid diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His)

Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este của cellulose.) C2H5

Đây là chất trao đổi anion

Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa những nhóm carboxyl tự do Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy

được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở

pH 7,5 - 8,5, (các protein acid có chứa các amino acid monoamin)

Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện, Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó Nếu thêm protein - enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient

Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme Ngoài việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4

Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex

Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex Ưu điểm của loại này

là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO-

- O - CH2 - COOH phân ly

COO - (mang điện tích âm)Đây là chất trao đổi cation

c Phương pháp dùng chất hấp phụ

Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định như silicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có thể được làm sạch với hiệu suất cao.

Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzyme Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách : chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 00C Bằng cách thay đổi độ pH hoặc lực ion của dung môi thích hợp, các enzyme được hấp phụ có thể được chiết khỏi chất hấp phụ

d Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography)

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử (chất) vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein

mà người ta nghiên cứu

Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel sepharose

Ở trên cột chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc

có thể bằng cách thêm cơ chất đã được hòa tan vào thì có thể tách được enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch

2.2.4 Kết tinh protein enzyme

Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng

Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch

(NH4)2SO4 Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt Thông thường là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein enzyme Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ Để kết tinh protein enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ Điều này có lẽ liên quan đến việc các chất có bản chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh.

2.2.5 Đánh giá tính đồng thể của protein enzyme

Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein

mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hòa tan, điện di và siêu ly tâm

- Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hoặc còn gọi là tính đồng nhất) của protein đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về

độ hòa tan

Cách làm như sau: Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng enzyme khác nhau Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc Cuối cùng xây dựng đường đồ thị

Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hòa tan và

số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng Sau đó dung dịch đạt được bão hòa Nếu protein đem hòa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn

Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão hòa đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hòa tan được nữa.

Hình 2.4 Đường biểu diễn độ hòa tan protein

Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn Nếu dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme thì sẽ có nhiều điểm uốn Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất

có kết quả Nay vẫn còn ứng dụng nhiều

- Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme

là phương pháp điện di Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng tính của protein, dựa trên cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm protein enzyme mang điện trong điện trường Đem chế phẩm protein enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định Nếu trên điện di đồ có một đỉnh thì chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể Nếu có hai đỉnh chứng tỏ có hai protein enzyme trong chế phẩm đó

- Phương pháp siêu ly tâm:

Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein enzyme Phương pháp được thực hiện như sau:

Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút Với tốc độ ly tâm rất lớn, người ta có thể tách ra được các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử khác nhau

Số lượng protein cho thêm

Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nó Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch Bởi vậy, cần phải quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm Chính vì vậy, trong cốc siêu ly tâm, người

ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn Nếu trong dung dịch có một loai protein enzyme (có một trọng lượng phân tử) thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh Nếu làm việc với hai protein enzyme thì sẽ có hai đỉnh v.v

2.3 Hoạt độ enzyme

2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng Theo dõi những biến đổi đó

có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme

Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

2 Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định

3 Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

2.3.2 Đơn vị hoạt độ enzyme

Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961

Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1µmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U = 1µmol cơ chất (10-6 mol)/ phút.

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)

- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử

- Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian

Hoạt độ phân tử lớn (còn gọi là con số chuyển hóa hoặc con số vòng: turnover number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh Như vậy, hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân

tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn Ví dụ người ta đã xác định được hoạt độ phân tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x

106) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), β-amylase (1,2 x 106)

Cũng cần chú ý rằng trong một số trường hợp định nghĩa về đơn vị hoạt độ enzyme ở trên không thể áp dụng được Nếu cần thiết chúng ta sẽ đưa ra các điều kiện thí nghiệm tương đối hoặc định nghĩa của các đơn vị khác Ở nơi có nhiều hơn một mối liên kết của phân tử cơ chất bị tấn công thì một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một micro - đương lượng của nhóm liên quan sau 1 phút ở điều kiện xác định Ở nơi có hai phân tử giống nhau phản ứng với nhau thì

1 đơn vị hoạt độ là lượng enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa của 2 µmol

cơ chất sau 1 phút