- O CH2 COOH phđn ly
Cấu trúc phđn tử enzyme
4.5. Phương phâp thăm dò vă phât hiện câc nhóm chức năng trong trung tđm hoạt động của enzyme
trong trung tđm hoạt động của enzyme
Đđy lă việc khó khăn vă phức tạp, phải sử dụng hăng loạt phương phâp khâc nhau. Khi xâc định được vai trò quan trọng của một nhóm năo đó đối với hoạt tính enzyme, chưa có nghĩa lă nhóm đó thuộc trung tđm
Cơ chất + Vùng hoạt động Enzyme Phức hợp ES Cơ chất + Enzyme Phức hợp ES
hoạt động của enzyme, bởi vì có nhiều nhóm chức năng chỉ lăm nhiệm vụ duy trì cấu trúc không gian hoạt động cho phđn tử enzyme.
Muốn thăm dò, phât hiện vă xâc định câc nhóm chức năng của phđn tử enzyme, người ta thường dùng câc phương phâp vật lý, hóa học, xâc định hằng số ion hóa của câc nhóm chức năng vă tốt nhất lă kết hợp với việc nghiín cứu cấu trúc phđn tử của enzyme vă của trung tđm hoạt động.
Câc phương phâp vật lý có khả nưng phâ huỷ một câch đặc hiệu câc nhóm chức năng của enzyme thường không nhiều, vì khó có thể chọn được câc tâc nhđn chỉ phâ huỷ một số nhóm hóa học nhất định mă lại không lăm ảnh hưởng đến toăn bộ cấu trúc của phđn tử enzyme. Chính vì vậy, thông thường người ta khóa, phâ huỷ, hoặc đânh dấu câc nhóm chức năng đó bằng câc thuốc thử hóa học như chất ức chế đặc hiệu, cơ chất hoặc coenzyme .
4.5.1. Phương phâp dùng chất ức chế
Tùy trường hợp có thể dùng câc chất ức chế đặc hiệu khâc nhau, ví dụ: - Đối với một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt động lă ion sắt người ta dùng xyanua (cyanide CN) để phât hiện vai trò của ion sắt đối với hoạt tính của enzyme vì CN kết hợp với ion sắt lăm cho enzyme mất khả năng vận chuyển điện tử. Ví dụ CN ức chế enzyme cytochromoxydase.
- Một số enzyme cần có ion kim loại tham gia văo quâ trình xúc tâc hoặc để giữ ổn định cấu trúc phđn tử enzyme. Để thăm dò phât hiện đặc tính cần kim loại của chúng, người ta dùng chất kết hợp kim loại như EDTA (Ethylen diamino tetraacetate) hoặc orthophenantrolin... Nếu lă enzyme cần kim loại thì sẽ mất hoạt tính.
- Để thăm dò vai trò nhóm - S - CH3 của methionine đối với hoạt tính của enzyme thì oxy hóa nhóm năy thănh sunfoxit tương ứng:
vă enzyme sẽ mất khả năng xúc tâc.
- Vai trò của nhóm - SH của Cysteine đối với hoạt động của enzyme được xâc định bằng câch cho phản ứng với muối kim loại nặng hoặc dẫn chất của chúng ví dụ PCMB (parachloromercuri - benzoate) hoặc cho phản ứng với iodoacetate.
Dưới tâc dụng của câc chất đê níu, nhóm SH của enzyme sẽ bị khóa vă enzyme mất hoạt động.
- Để phât hiện nhóm imidazol của Histidine đối với hoạt tính của enzyme người ta phâ huỷ nhóm năy bằng phương phâp oxy hóa quang học - S - CH3 O
với sự có mặt của xanh metylen hoặc cho phản ứng với iodoacetate. Khi nhóm chức năy bị phâ huỷ hoặc bị khóa thì enzyme đều mất hoạt tính.
- Để tìm hiểu vai trò của nhóm ε - NH2 của lysine có thể cho phản ứng với fluordinitro benzen (FDNB) để tạo thănh dinitrophenyl (DNP) mău văng. FDNB phản ứng với câc nhânh bín của amino acid khâc như imidazol, phenol, thiol thì tạo ra dẫn chất DNP không mău.
Cũng có thể ức chế nhóm ε - NH2 bằng câch cho phản ứng với những yếu tố oxy hóa.
- Vai trò của nhóm - OH của serine đối với hoạt tính của enzyme được thăm dò bằng câch cho tâc dụng với chất ức chế đặc hiệu lă diisopropylfluor-phosphate (DFP). DFP sẽ khóa nhóm - OH của serine vă enzyme mất hoạt tính.
Trong một số trường hợp câc nhóm chức năng tham gia văo cơ chế xúc tâc có thể được phât hiện dễ dăng hơn so với câc nhóm hóa học khâc cùng loại, đó lă nhờ khả năng phản ứng đê tăng lín do vị trí đặc biệt của chúng trong phđn tử enzyme.
4.5.2. Phương phâp đânh dấu bằng cơ chất đặc hiệu hoặc coenzyme
- Nhiều người cho rằng dùng cơ chất đặc hiệu để đânh dấu câc nhóm chức năng lă hợp lý nhất song cũng gặp nhiều khó khăn vă phức hợp được tạo thănh thường không vững bền (phức hợp enzyme - cơ chất dễ dăng bị phđn ly ngược chiều, phức hợp enzyme - sản phẩm của phản ứng cũng phđn ly với tốc độ cao). Tuy vậy, bằng phương phâp thực nghiệm khôn khĩo người ta đê tâch được câc sản phẩm trung gian của phản ứng kết hợp với enzyme bằng liín kết đồng hóa trị vững bền. Ví dụ như người ta đê tâch được phosphoserine đânh dấu trong trường hợp của phosphoglucosemutase ở quâ trình phản ứng vận chuyển phosphore, hoặc phức hợp enzyme với sản phẩm trung gian của triosephosphate dehydrogenase.
- Phương phâp đânh dấu bằng coenzyme cũng được sử dụng vă có giâ trị trong một số trường hợp. Như người ta đê nghiín cứu trung tđm hoạt động của cytochrome C bằng câch dùng coenzyme heme lăm chất đânh dấu cũng như dùng pyridoxal phosphate lăm chất đânh dấu để nghiín cứu một số enzyme cần coenzyme năy lăm yếu tố phối hợp.
Cần lưu ý lă chỉ có thể dùng coenzyme, cơ chất hay chất giống cơ chất để đânh dấu những nhóm chức năng trong trung tđm hoạt động của enzyme khi năo liín kết hóa học giữa chất đânh dấu với những nhóm năy
đủ vững bền hoặc được biến thănh những liín kết vững bền bằng phương phâp thích hợp. Mặt khâc, khi cơ chất hoặc coenzyme kết hợp với enzyme đê lăm cho enzyme không bị ức chế bởi câc thuốc thử đặc hiệu có thể do enzyme hoặc cơ chất đê kết hợp với câc nhóm chức năng, hoặc cũng có thể lăm ngăn câch một câch đặc hiệu giữa câc nhóm chức năng của enzyme vă thuốc thử. Như vậy, ở câc trường hợp đê níu, câc nhóm chức năng đều được kết luận bằng câch suy luận giân tiếp chứ không phải bằng câc kết quả thực nghiệm trực tiếp.
4.5.3. Xâc định trị số pK của câc nhóm hoạt động
Enzyme lă một phđn tử protein đặc hiệu có nhiều nhóm hóa học có thể bị ion hóa, nín enzyme có thể tồn tại dưới nhiều trạng thâi ion hóa khâc nhau; nhưng thường chỉ có một dạng ion của phđn tử enzyme có khả năng thể hiện hoạt tính xúc tâc, trong đó chính trạng thâi ion hóa của câc nhóm hoạt động của enzyme có liín quan trực tiếp đến quâ trình xúc tâc.
Trạng thâi ion hóa của câc nhóm khâc không có liín quan trực tiếp đến cơ chế xúc tâc của enzyme thường không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Trạng thâi ion hóa của enzyme, của cơ chất vă của phức hợp enzyme-cơ chất chịu ảnh hưởng trực tiếp của pH của môi trường phản ứng. Do đó nghiín cứu ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme có thể tìm được trị số pK của nhóm hoạt động của enzyme (K = hằng số ion hóa, pK = - logK), Với trị số của pK có thể suy đoân câc nhóm hoạt động của enzyme.
Cũng cần chú ý rằng, phương phâp xâc định trị số pK chỉ lă những chỉ dẫn sơ bộ vă cần phải phối hợp với nhiều phương phâp khâc.
4.5.4. Nghiín cứu cấu trúc phđn tử
Câc phương phâp hóa học đặc hiệu hoặc xâc định trị số pK chỉ lă những thông tin cần thiết để suy đoân vă chưa đủ để chứng minh về vai trò của câc nhóm hoạt động. Vì vậy cần phải nghiín cứu cấu tạo hóa học vă cấu trúc không gian của phđn tử enzyme vă đặc biệt lă của trung tđm hoạt động. Bằng câch cắt bỏ dần câc gốc amino acid của phđn tử enzyme người ta đê chứng minh hoạt độ enzyme chỉ phụ thuộc văo một số bộ phận nhất định của phđn tử enzyme.Ví dụ papain lă enzyme thủy phđn protein, khi bị cắt bỏ 2/3 số gốc amino acid vẫn còn hoạt động, trung tđm hoạt động nằm ở đầu nhóm - COOH.