tiểu luận máy điện di

Tiểu luận Máy điện di I. ĐẶT VẤN ĐỀ. Máy điện di dùng để phát hiện và xác định ADN trong tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật. Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để có thể sử dụng để phân tích AND và ARN nhưng phương pháp điện di trên gel vẫn được sử dụng nhờ ưu điểm nhanh gọn và tương đối đơn giản. Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 1 II. NỘI DUNG 1. Axit deoxyribonucleic (AND) và nguyên tắc xác định 1.1. Axit deoxyribonucleic (AND) 1.1.1. Định nghĩa. - Acid Deoxyribo Nucleic (viết tắt ADN theo tiếng pháp hay DNA theo tiếng Anh ) là một phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các dạng sống bao gồm cả một số virus. - ADN thường được coi là vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử tham gia quyết định các tính trạng. Trong quá trình sinh sản, phân tử ADN được nhân đôi và truyền cho thế hệ sau. 1.1.2. Cấu trúc hoá học của AND. - ADN tồn tại chủ yếu trong nhân tế bào, cũng có mặt ở ti thể, lạp thể. ADN là một loại axit hữu cơ có chứa các nguyên tố chủ yếu C, H, O, N và P (hàm lượng P có từ 8 đến 10%) - ADN là đại phân tử, có khối lượng phân tử lớn, chiều dài có thể đạt tới hàng trăm micromet, khối lượng phân tử có từ 4 đến 8 triệu, một số có thể đạt tới 16 triệu đơn vị cacbon. - ADN cấu tạo theo nguyên tắc đa phân, mỗi đơn phân là một loại nuclêôtit, mỗi nuclêôtit có 3 thành phần, trong đó thành phần cơ bản là bazơ – nitric. 4 loại nuclêôtit mang tên gọi của các bazơ – nitric, trong đó A và G có kích thước lớn, T và X có kích thước bé. - Trên mạch đơn của phân tử các đơn phân liên kết với nhau bằng liên kết hoá trị là liên kết hình thành giữa đường C 5 H 10 O 4 của nuclêôtit này với phân tử H 3 PO 4 của nuclêôtit bên cạnh, (liên kết này còn được gọi là liên kết photphodieste). Liên kết photphodieste là liên kết rất bền đảm bảo cho thông tin di truyền trên mỗi mạch đơn ổn định kể cả khi ADN tái bản và phiên mã. - Từ 4 loại nuclêôtit có thể tạo nên tính đa dạng va` đặc thù của ADN ở các loài sinh vật bởi số lượng, thành phần, trình tự phân bố của nuclêôtit. 1.1.3. Cấu trúc không gian của ADN - Mô hình ADN theo J.Oatxown và F.Cric có đặc trưng sau: + Là một chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch pôlinuclêôtit xoắn đều quanh một trục theo chiều từ trái sang phải như một thang dây xoắn, mà 2 tay thang 2 là các phân tử đường (C 5 H 10 O 4 ) và axit phôtphoric sắp xếp xen kẽ nhau, còn mỗi bậc thang là một cặp bazơ nitric đứng đối diện và liên kết với nhau bằng các liên kết hiđrô theo nguyên tắc bổ sung, nghĩa là một bazơ lớn (A hoặc G) được bù bằng một bazơ bé (T hoặc X) hay ngược lại. Do đặc điểm cấu trúc, ađenin chỉ liên kết với timin bằng 2 liên kết hiđrô và guanin chỉ liên kết với xitôzin bằng 3 liên kết hiđrô. + Do các cặp nuclêôtit liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung đã đảm bảo cho chiều rộng của chuỗi xoắn kép bằng 20 Å , khoảng cách giữa các bậc thang trên chuỗi xoắn bằng 3,4Å, phân tử ADN xoắn theo chu kỳ xoắn, mỗi chu kỳ xoắn có 10 cặp nuclêôtit có chiều cao 34Å . 1.2. Nguyên tắc xác định 1.2.1. Điện di là gì? Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Điện di hay điện di trên gel áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử AND,ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích. 3 Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 1.2.2. Nguyên tắc của phương pháp Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để phân tích ADN và ARN, nhưng cho đến nay điện di trên gel là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả nhờ ưu điểm nhanh và tương đối đơn giản. Nguyên tắc của phương pháp là do: dưới tác động của điện trường, các phân tử ADN (thường tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau. Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đó người ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ. Trên điện trường các phân đoạn ADN có kích thước càng nhỏ càng có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn. Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể quan sát thấy nhờ sử dụng các thuốc nhuộm phát huỳnh quang, chẳng hạn như ethidium (chất này gắn kết với ADN bằng cách cài vào khe ở giữa các nucleotit). Mỗi một băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có cùng kích thước. Có hai loại vật liệu làm gel được sử dụng phổ biến trong điện di, đó là agarose và polyacrylamid. Trong đó, gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưng khoảng kích thước ADN có thể phân tích hẹp. Vì vậy, điện di trên gel polyacrylamid có thể phân tách được các phân đoạn ADN khác nhau thậm trí chỉ một cặp nucleotit (1 bp) duy nhất, nhưng thường chỉ để phân tích các đoạn ADN kích thước vài trăm bp. Còn gel agarose có khả năng phân tách thấp hơn đối với các phân đoạn ADN kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các phân đoạn ADN kích thước lớn tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp). Các phân đoạn ADN kích thước lớn không thể “lọt” qua các lỗ có kích thước nhỏ trên các bản gel, kể cả gel agarose. Thay vào đó, chúng sẽ “trườn” qua mạng lưới của gel bằng việc đầu này của phân tử đi trước, còn đầu kia theo sau. Kết quả là các phân đoạn ADN kích thước lớn (từ 30 đến 50 kb) có tốc độ di chuyển trên điện trường gần như tương đương và khó phân tách được bằng phương pháp điện di thông thường. Đối với các phân đoạn ADN kích thước lớn như vậy, người ta có thể phân tách bằng việc sử dụng phương pháp điện di xung trường (pulsed-field gel electrophoresis). Trong phương 4 pháp này, người ta sử dụng 2 cặp điện cực nằm chéo góc trên bản điện di . Việc “bật” và “tắt” luân phiên 2 cặp điện cực sẽ làm cho các phân đoạn ADN lớn thay đổi chiều. Các phân đoạn ADN có kích thước càng lớn càng chậm hơn trong quá trình thay đổi chiều di chuyển. Nhờ vậy, các phân đoạn có kích thước khác nhau sẽ phân tách ra khỏi nhau trong quá trình di chuyển. Kỹ thuật điện di xung trường trong thực tế có thể sử dụng để xác định được kích thước đầy đủ của nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc nhiễm sắc thể các loài sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, như nấm men. Những loài này có kích thước hệ gen khoảng vài Mb. Điện di không những có thể phân tách các phân đoạn ADN khác nhau về kích thước mà cả về hình dạng và cấu hình không gian của chúng. Các phân tử ADN ở dạng mạch vòng giãn xoắn hoặc bị “đứt gãy” ở một số nucleotit di chuyển chậm hơn trên trường điện di so với các phân tử ADN ở dạng mạch thẳng có cùng khối lượng. Tương tự như vậy, các phân tử ADN ở dạng siêu xoắn, kích thước và thể tích thu nhỏ thường di chuyển nhanh hơn trên trường điện di so với các phân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn hoặc có mức độ cuộn xoắn thấp hơn có cùng khối lượng. 1.2.3. Sự phát hiện AND AND có thể phát hiện nhờ sự phát huỳnh quang của liên kết etydi bromua (C 2 H 10 BrN 3 ) hay nhờ phương pháp chụp ảnh bằng tia X của đồng vị phóng xạ AND. Etydi bromua (0,5 µg/ml) có thể được thêm vào dung dịch đệm di chuyển, để quan sát sự biến động của mẫu, vì sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm dưới tác dụng của tia cực tím sẽ được biểu hiện ở dạng dải (để xác định được sự biến đổi đó: tắt nguồn cung cấp năng lượng và chuyển đổi thành phần agaroza cũ ra nắp thiết bị định tia cực tím gần khay vận hành. Đặt nắp lại và bật đèn để bắt lại sự điện di). Ngoài ra, sau khi điện di, gel biến màu trong dung dịch hòa tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H 2 O) khoảng từ 10 đến 60 phút rồi quan sát và chụp ảnh mẫu bằng phương pháp chiếu tia cực tím. Đế chụp ảnh gel, dùng phương pháp chiếu tia cực tím trên bề mặt tại mỗi vị trí ở đĩa vận hành hoặc di chuyển nhẹ bản gel trên bề mặt sẽ quan sát được tối đa (đĩa vận hành có 95% ánh sáng trắng với bước sóng 245nm và 40% ánh sáng trắng với bước sóng 254nm). Quan sát mẫu bằng tia cực tím ở bước sóng 366 nm hoặc làm giảm cường độ tia cực tím xuống 302 nm để giảm sự phát huỳnh quang của etydi bromua không liên kết, gel có thể bị mất màu bởi sự hút ẩm của nó trong 5 phút với MgCl 2 0,01M hoặc trong 1 giờ với MgSO 4 0,001M. Sự mất màu đã tạo điều kiện dễ dàng để phát hiện hàm lượng AND nhỏ. 5 2. Cấu trúc máy điện di. Máy điện di gồm ba bộ phận cơ bản: 2.1. Khay vận hành: Gồm khuôn đúc gel, khay di động trong suốt và bọt đệm bằng cao su. • Tác dụng: + Khuôn đúc gel là nơi tiến hành rót dung dịch đệm (thường là đệm điện di, gel agaroza). + Nhờ tác dụng của bọt đệm bằng cao su nên quá trình rót dung dịch đệm vào khuôn tránh tiếp xúc vào thành khuôn và thuận lợi cho quá trình lấy gel ra dễ dàng. + Trên khay di động trong suốt có đục các lỗ dùng để bơm các chất chỉ thị màu, chất tải lạnh etylen glycol. 6 2.2. Nắp có điện thế cao: Trên nắp có đầu ra của mã màu, dược nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy. Trên nắp có đầu ra của mã màu được nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy. Nắp có tác dụng bảo đảm an toàn trong quá trình điện di. 2.3. Buồng giảm xốc: Có ống nối điện cực, bục di chuyển và lỗ nạp etylenglycol/nước với tỷ lệ 50/50 7 Một số hình ảnh về máy điện di. 8 Máy điện di ngang Máy điện di đứng 3.Cấu trúc vận hành: 3.1 Chuẩn bị dung dịch 3.1.1. Chuẩn bị 250 ml dung dịch đệm. Hai dung dịch đệm được sử dụng phổ biến cho điện di AND được chuẩn bị theo công thức pha chế sau. * 10X Tris-borate-EDTA. Nguồn cung cấp chất đệm: (0,89 M Tris; 0,89 M acid boric; 20 mM EDTA; pH -8,2; 1000 ml) Tris base (FW 121.1) : 0,89 M 108,0 g Acid boric (FW 61.8) : 0,89M 55,0 g Dung dịch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02 g 40,0 ml Nước đã được khử ion hóa: 1000,0 ml pH luôn giữ ở 8,2 Trước khi sử dụng với dung dịch loãng 0,5 X với 45mM base tris; 45 mM acid boric và 1 mM EDTA Thường dùng pha loãng vì nước có nhiệt độ thấp 1X với 89 mM base tris; 89 mM acid boric và 2 mM EDTA * 10X Tris-acetate-EDTA cung cấp cho chất đệm (0,4 M tris; 0,2 M acid axetic; 10mM EDTA; pH-8,4; 1000 ml) Tris base (FW 121.1): 4,0 M 48,8 g Acid axetic (99,5%): 0,2 M 114,1 ml Dung dịch EDTA (0,5 M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Nước đã khử ion hóa: 1000,0 ml Khuấy đều đừng làm giảm pH. Pha loãng tới 1X trước khi sử dụng tới 40 mM base tris; 20 mM acid axetic và 1 mM EDTA. * Dung dịch EDTA (0,5 M; pH 8,0; 100ml) Na 2 EDTA.2H 2 O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Nước đã được khử ion hóa: 70,0 ml NaOH (10M) tới pH 8,0 100,0 ml 3.1.2. Chuẩn bị bộ đệm tải mẫu. Để chuẩn bị bộ đệm cần chuẩn bị mẫu đệm thử (dung dịch mẫu) Mẫu đệm thử (Dung dịch mẫu) 9 (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) Nước đã được khử ion hóa: 7,0 ml Ficoll 400: 2,5 mg Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg Nước đã được khử ion hóa: 100 ml Chú ý 1: Sucroza và glycerol có thể được sử dụng để thay thế ficoll 400. Chú ý 2: Xylen cyanol (0,25%) mà di chuyển chậm hơn phenol bromua xanh, thì có thể tăng thêm một lượng nếu mong muốn, sự cô cạn dung dịch agaroza được xác định khi thêm vào có liên quan đến polynucleotit. 3.2 Đúc gel 3.2.1. Chuẩn bị gel và khuôn đúc - Chuẩn bị gel: Chuẩn bị khoảng 7 ml dung dịch agaroza ứng với mililit chiều dày gel (ví dụ: 1 gel 3 mm cần 0,3x7x10 = 21 ml). Hòa tan agaroza trong dung dịch đệm, điều chỉnh nhiệt độ hỗn hợp. Cho phép làm mát dung dịch đến 50 0 C trước khi rót vào khuôn. Để quan sát sự phân ly trong hiện tượng điện chuyển thường thêm 0,5 mg/ml etydibromua vào dung dịch gel. - Chuẩn bị khay di động: một tay giữ chặt khuôn đúc, tay kia đặt đầu khay di động và áp vào miệng bọt đệm và sau đó hạ thấp và đặt lên cuối của khuôn đúc. Đặt đầu còn lại của khay áp suất sát bọt đệm. - Chuẩn bị lược: Lắp hai rãnh trong lược vào đầu những đầu ốc vào mặt sau lược. Siết chặt ốc. Đặt lược vào mép khuôn và phần cuối của lược để cách khay di động khoảng 1mm. Siết chặt ốc để giữ chắc lược. + Di chuyển lược: Đặt khuôn lắp ráp lên mặt phăng nằm ngang. Đặt vào ống nivo lên khay di động, nó như thiết bị kiểm tra xem khuôn có đúng vị trí nằm ngang không. 3.2.2.Đúc gel - Đổ dung dịch agaroza vào khuôn đúc. Định hướng lược để các bề mặt lược gần miếng đệm bọt nhất và đặt nó lên cạnh khay. Lược luôn luôn ở vào vị trí thẳng đứng để tránh sự vặn vẹo hình dạng. Để chạy lượng mẫu gấp 2 lần, đặt lược thứ hai vào chính giữa khay. Cho phép thời gian tối thiểu để gel đặc lại là 30 phút. - Khi gel đã kết lại, lần lược tháo lược cẩn thận. Nhấc một phần và nghiêng nhẹ một đầu của lược, sau đó rút từ từ ra khỏi gel - Tháo khay di động và gel bằng cánh nắm lấy tay cầm của khay, ấn đầu áp vào miếng bọt đệm. Khi khay đã sạch đệm thì nhấc ra. Chuyển khay và gel tới chỗ mát. 10 [...]...3.4 Vận hành điện di - Làm sạch nền trước khi tiến hành, đặc biệt khi dùng điện áp cao hơn hoặc khi sự phân ly quy định trên 30 phút Chú ý: Để tiến hành phân ly, hoặc là thêm 0,5mg/ml etydibromua vào dung dịch đệm hoặc thêm 50mg/ml etydibromua vào bộ đệm Để quan sát, hãy cắt điện, tháo phần nắp và giữ đèn cực tím gần gel + Thêm từ từ etydibromua vào dung dịch đệm hay đệm mẫu... các dây màu tới các nguồn điện Đặt mức điện áp vào thiết bị bấm giờ theo mức độ phân ly * Vận hành Các loại gel agaroza được chuẩn bị lần đầu trong khuôn đúc gel Những mẫu được nạp vào trong các bể chứa và được phân ly Thuốc nhuộm huỳnh quang C12H20BrN3 có thể được thêm vào chất đệm và chất đệm điện di hoặc gel hoặc cả hai để tìm ra dấu hiệu của quá trình phân ly Sau khi điện di, gel có thể cho màu,... chế sự di chuyển Pha chế mẫu mới nếu nghi ngờ mẫu bị nhiễm bẩn Chọn loại agaroza với tốc độ thẩm thấu chậm Đặt khay đúng vị trí, không ấn mạnh vào bên trong 4 Ứng dụng - Trong nghành công nghệ thực phẩm hiện nay: ♦ Dùng để phân tách ADN (ARN) ♦ Tinh sạch các đại phân tử protein ♦ Tinh sạch các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng 13 - Ứng dụng điện di trong... đông thương mại, dung môi hữu cơ hoặc nước cất 11 Không cần thiết thay thế chất tải lạnh 3.6 Những chú ý cần thiết Nắp an toàn phải được lắp trước khi nối nguồn điện với nguồn cung cấp năng lượng Tất cả các công tắc điện và ngắt nguồn cung cấp điện trước khi tháo nắp an toàn Trước khi sử dụng lần đầu, làm đầy lỗ với một lượng 600 ml 50/50 etylen glycol/nước để ngăn chặn sự tổn thất không thể hồi phục... mới Sắp đệm cho thẳng và để nó vào vị trí cuối của khay dọc theo cạnh ngắn (7 cm), mặt sau của tường và sau đó ép vào đúng vị trí Lặp lại với miếng đệm thứ 2 trên tường đối di n với miếng đệm thứ 1 3.7 Điều chỉnh thiết bị điện di 12 Bể chắn mẫu: Để cho gel đặc lại tối thiểu là 30 phút và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi tháo lược Khi tháo lược giữ ở cạnh ngắn và nâng nhẹ để tránh gãy gel Giữ để không... ở phần trên của lỗ Đỗ đầy lỗ hỏng đến mức có thể như chất làm lạnh bằng ống phun hoặc máy bơm với 50 ml Bấm nút caosu màu nâu vào mỗi lỗ Sắp xếp dung dịch đã chuẩn bị trong thùng đá hoặc bên trong máy lạnh hoặc tủ lạnh không dưới 200C trong khoảng 1 giờ trước khi sử dụng (hóa chất được dự trữ trong phòng lạnh hoặc máy lạnh) Chú ý: Không đổ đầy với chất chống đông thương mại, dung môi hữu cơ hoặc nước... acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng 13 - Ứng dụng điện di trong nông nghiệp o Cải thiện phẩm chất những giống đặc sản o Chọn tạo các giống triển vọng III KẾT LUẬN Kỹ thuật điện di có nhiều ứng dụng lớn trong trong các quy trình sản xuất công nghiệp, nhất là trong nghành công nghệ thực phẩm hiện nay Vì vậy cần phải tìm hiểu và đưa kỹ thuật này vào ứng dụng rộng rãi hơn... thẳng đứng để tránh làm biến dạng bể chứa Giảm lớp đệm 1 mm từ bề mặt ở phía trên gel, giảm gradien nhiệt độ Tái tạo gel không đủ chất lượng: Thêm ficoll, glyxerol hay đường (mía) vào nhiều dung dịch lấy mẫu để đảm bảo mẫu lắng xuống đáy bể (chon chất ficoll) Chắc chắn mẫu thử được hòa tan hoàn toàn Giảm điện thế Giảm nồng độ mẫu thử Giảm thể tích Cần ít nhất 1mm gel dưới đáy lược để tránh mẫu rỉ ra... lỗ đó dưới – 20 0C (-4 0F) Có thể làm lạnh lượng dung dịch đó trong thùng đá, máy làm lạnh hoặc trong tủ lạnh Không điều chỉnh nhiệt độ dung dịch đệm hoặc gel trên 50 0C Ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt bằng cách làm lạnh lượng dung dịch đó trước khi sử dụng Để ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt trong quá trình kéo dài chạy điện áp cao, thay thế lượng dung dịch thứ 1 bằng lượng dung dịch thứ 2 đã được... không chạy dọc theo cột: Nếu chảy thành sợi trên khay bị hỏng thì phải thay thế Giảm điện áp Chọn chất đệm với nồng độ và hàm lượng dung dịch đệm thích hợp (lượng dung dịch đệm TBE chứa nhiều hơn loại TAE) Nếu chất đệm bị tháo ra hết thì ngưng hoạt động, tháo nắp, dùng ống hút lấy chất đệmtừ lỗ khác cho vào bên trong lỗ đối di n đến khi đầy chất đệm Nếu chất gel không đồng nhất, đặt khuôn đúc nằm ngang . ảnh về máy điện di. 8 Máy điện di ngang Máy điện di đứng 3.Cấu trúc vận hành: 3.1 Chuẩn bị dung dịch 3.1.1. Chuẩn bị 250 ml dung dịch đệm. Hai dung dịch đệm được sử dụng phổ biến cho điện di AND. . 1.2. Nguyên tắc xác định 1.2.1. Điện di là gì? Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Điện di hay điện di trên gel áp dụng trong sinh. đế máy. Trên nắp có đầu ra của mã màu được nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy. Nắp có tác dụng bảo đảm an toàn trong quá trình điện di. 2.3. Buồng giảm xốc: Có ống nối điện cực, bục di