Thực nghiệm đề tài khảo sát thành phần hóa học của cây bá bệnh
Trang 23.NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
3.1 Nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành khảo sát cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia Jack)
mua ở các hiệu thuốc dân tộc trong thành phố Hệ Chí Minh (đường Hải Thượng Lãn Ông, quận 5) Cây được phơi và sấy ở 60°C đến khối lượng không đổi và
được dùng để làm thực nghiệm
3.2 Điều chế các loại cao:
1.65 kg cây khô nghiền nhỏ và trích bằng phương pháp đun hoàn lưu, sau đó đem cô quay dich trích ở áp suất kém ta thu được cao metanol thô (61g) Cho
phan cao thô này hòa tan vào nước và lần lượt chiết với các dung môi eter dầu
hỏa, acetat et và butanol, cơ quay thu hồi dung môi ta thu được các loại cao tương ứng: cao eter dầu hỏa, cao acetat etyÌ, cao butanol và dịch nước
Sơ đề ly trích các loại cao Cây khô xay nhuyễn (1.65 kg ) -Đun hoàn lưu trong MeOH -Loc ở -Cô quay thu hồi dụng môi Cao thô MeQH
-Héa tan trong | lit H,O
Trang 33.3 Kết quả và biện luận:
Thực hiện sắc ký cột cao chioroform trên silica gel pha thường với các
dụng môi giải ly lần lượt là eter dầu hỏa, acetat etyl, metanol, kết hợp với sắc ký cột ngược pha (ODS-RP18) và sắc ký bản mông pha thường, ngược pha (RP18) và sắc ký bấn mồng điều chế, chúng tôi đã cô lập được 5 hợp chất NH1, NH2, NHS, NH4, NHS
Bằng các kết quá phổ nghiệm kết hợp với tài liệu tham kháo chúng tôi đã
nhận danh được các hợp chất này lần lượt la 25-O-metylpiscidol A, trucallan-7- 24-đien-3-on, epi-sapeline, quassin và L8-hidroxiqguassin
Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc các hợp chất trên,
3.3.1 Chất NHI
Nhận định ban đầu cấu trúc của NHI dựa trên phổ 'ÍC-NMR và DEPT suy đốn NHÍ thuộc nhóm chat triterpen
Tín hiệu trên phổ 2C cho biết NHI có 31 carbon, Phổ DEPT 90 và 135
cho thấy sự xuất hiện của 9 nhóm metyl (CHạ), 8 nhóm CH¡, 7 nhóm CHÍ và 7
carbon tif cap
Tín hiệu cộng hưởng trên phổ 'H có sự hiện điện của proton thuộc các nhóm metyl của triterpen xuất hiện Ở trường cao (bang 1)
Tham khảo tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của cây bá bệnh trích từ cao metanol và chloroform cho thấy hợp chất này có thể thuộc khung
sườn tirucaHan Phân giải phổ BCLNMR cia NHÍ thấy hợp chất này có một nhóm carbonyl (ốc 216.9 ppm), một nối đơi tam hốn ứng với độ dịch chuyển hóa học của hai carbon xuất hiện ở vị trí 117.9 ppm và 145.9 ppm và có ba
carbon nối với oxy xuất hiện tai vi tri 68.7 ppm; 76.4 ppm, 79.8 ppm Từ đó, so
sánh độ địch chuyển hóa học của các carbon của NHI với một số đại diện của
triterpen có đặc điểm như trên thấy NH1 khá giống với hợp chất piscidinol A
Trang 4(36) (bảng số liệu) Vậy NHÍ là một hợp chất triterpen khung trrucalian tương tự
như hợp chất piscidinol A
Tổng hợp tín hiệu nhận được từ phổ !H-NMR cho thấy có tín hiệu của proton cia hai nhóm hydroxy 6 vi tri 2.67 ppm (1H, d, J = 9.5 Hz) va 3.51 ppm
(1H, d, J = 1.5 H2), một nhóm metoxy ở 3.25 ppm (3H, s) Mặt khác, so sánh độ dịch chuyển hóa học tại vị trí C-23 ~ C-27 gitfa NUE va piscidinol A (36) cho
thay tin hiéu cha C25 cla NHI da dich chuyén vé phia truéng thdp (5c 79.8 ppm) so vdi C25 cia 39 (Sc 74.3 ppm) Suy dodn, nhé6m metoxy gan trén carbon 25, hai nhóm hydroxy còn lại sẽ gắn trên hai carbon 23 và 24, 32 QOH NH A 57 78 OH 3 OR 16 ny, 39 R=H 29 “28 RHE R= Me
Kết luận: NHI có cấu trúc của một hợp chat triterpen c6 cdu tric metyl
eter của piscidinol A, 25-O-metylpiscidinol A
Theo tài liệu, hợp chất này đã được cô lập trước đây từ quả của cây Phellodendron chinense có tên là pheHochin NHỊ cũng được điều chế từ phần
Ứng mở vòng cpoxy của hợp chất niloticin (37) bằng phan ứng metanol giải
Trong nghiên cứu này, NHI là một hợp chất thiên nhiên cô lập từ cây bá bệnh
nhưng chúng tôi cũng không loại trừ khả năng nó được tạo thành trong quá trình ly trích bằng dung môi metanol
Trang 53.3.2 Chất NH2
Các tín hiệu cộng hưởng nhận được từ phổ ''C-NMR, DEPT 90 và DEPT
135 cho thấy NH2 có 30 carbon, 8 nhóm CH;, 9 nhóm CH;, 6 nhóm CH và 7
carbon tứ cấp Phổ 'H-NMR cho thấy sự xuất hiện của các proton metyl của hợp chất triterpen ở trường cao (bảng 2) Suy đoán, NH2 cũng là một hợp chất
triterpen như NHI
So sánh phổ `H và ''C của NH2 với phổ của NHI vừa xác định cấu trúc ở trên cho thấy về cơ bản phổ của NH2 giống NHỊ, độ dịch chuyển hóa học của
các carbon trên 4 vòng A, B,C, D của NH2 giống với độ dịch chuyển hóa học
của các carbon này của NHI (xem bảng l) Vậy, sườn carbon của NH2 cũng là tirucallan, có bốn vòng giống như NHI
⁄ ⁄
DG %
Tuy nhién, phé 'H va ?C của NH2 so với NHI có một số điểm khác nhau,
đặc biệt là các tín hiệu ứng với các carbon và hydro trên mạch nhánh (xem bảng 1)
Phổ C-NMR ctia NH2, không còn sự hiện diện của các carbon nối với
oxy, thay vào đó xuất hiện thêm một nối đơi tam hốn tại hai carbon có độ dịch
chuyển hoá học 125.2 ppm và 131.0 ppm
Tín hiệu cộng hưởng nhận được trên 'H-NMR chỉ có duy nhất một mũi đôi
xuất hiện ở trường cao tại vị tri 0.88 ppm (d, J = 5.5 Hz, H;-21) Suy ra, nối đôi
Trang 6
nằm ở vị trí carbon 24 và 25 Sự suy luận này hoàn toàn phù hợp với độ dịch
chuyển hóa học của proton đính trên carbon 26, 27 dịch về phía trường thấp [ồn
1.68 ppm (Hạ-26, s); 1.60 ppm (H:-27, s)] so sánh với NHI
Kết luận: NH2 có cấu trúc của hợp chất triterpen khung tirucallan với một nhóm carbonyl; hai nối đôi, một nối ở vòng B tại vị trí 7, 8 và một nối nằm
Trang 83.3.3 Chất NH3
Phổ 'H-NMR của NH3 có các tín hiệu các proton của nhóm metyl của
triterpen xuất hiện ở trường cao ( 7 nhóm metyl ở 0.72 (3H, s, H-I§); 0.79 (3H, s,
H-19); 0.85 (3H, s, H-28); 0.98 (3H, s, H-29); 1.00 (3H, s, H-30); 1.31 (3H, s, H- 26); 1.32 (3H, s, H-27)), có một proton néi déi 6 84 5.27 (1H, dd, J=3;5, H-7)
Từ đó cho thấy NH3 là một hợp chất triterpen có khung tirucallan như là NHI
và NH2
Ngoài ra, các tín hiệu trên phổ 'H-NMR cho thấy NH3 có sự hiện diện
của bốn proton của các carbon oxigen héa 6 54 3.23 (1H, dd, J=4;11.5, H-3),
3.91 (1H, dd, J= 5311.5, H-21a), 3.40 (1H, dd, J=2.5;11.5, H-21b), 3.95 (1H, m,
H-23)
Các tín hiéu cong huéng nhn dugc tiv phd “C-NMR, DEPT 90 va DEPT
135 cho thấy NH3 có 30 carbon, 9 nhóm CH;, 8 nhém CH, 7 nhém CH va 7
carbon tif cap
Phổ !'C-NMR của NH3 không còn tín hiệu của nhóm ceton, thay vào đó
là tín hiệu của nhóm carbinol ở õc 79.3 (C-3) Ngoài ra, phổ '$C-NMR của NH3 còn có các tín hiệu của carbon oxigen hóa ở õc 74.2 (C-25), 70.1 (C-21) và 86.5
(C-24)
Từ những suy luận trên và dựa theo tài liệu tham khảo””Ì xác định NH3 là
chất epi-sapeline
Trang 113.3.4 Chất NH4
Phổ 'H-NMR của NH4 có tín hiệu của bốn nhóm rmetyÌ ở trường cao 1.88 (3H, s, H-18); 1.18 3H, s, H-19), 1.12 3H, d, J=7, H-28); 1.58 (3H, s, H-30), một proton oleln ở 5.31 (1H, d, J=2.5Hz, H-3), một proton của € oxigen hóa của
vòng lacton ở 4.28 (1H, dd, J=1;3 Hz, H-7), hai nhóm metoxi ở 3.67 @H, s, 12-
OCH3), va 3.6 (3H, s, 2-OCH;)
Các tín hiệu trên phổ °C cho thấy NH4 có chứa 22 carbon, trong đó có 6 nhóm CH¡, 2 nhóm CHạ, 6 nhóm CH, có hai mũi của liên kết C=C ở 148.2 (C-2)
và 116.4 (C-3), hai mũi của carbon nối đôi ở 148.3 (C-12) và 137.5 (C-13), hai
mỗi ở 197.8 (C-1) và 191 (C-11) là hai mũi của nhóm C=O bất bão hòa, ngoài ra còn có một mũi ở 82.1 là mỗi của C oxigen hóa (C-7), một tín hiệu ở vị trí 169.1 là C của nhóm lacton (C-16)
So với tài liệu tham khảo cho thấy NH4 là quassin!?”),
HạcO
Trang 123.3.1.4 Chất NH5
Phổ 'H -NMR của NHŠ có tín hiệu của ba nhóm metyl ở trường cao 1.17
(3H, s, H-19), 1.13 (3H, d, J=7, H-28); 1.62 (3H, s, H-30), một mũi proton olefin 6 64 5.33 (1H, d, J= 2Hz, H-3) , mét proton gan véi carbon oxigen héa của vòng lacton 6 54 4.32 ppm (1H, dd, J=2;5, H-7), hai proton carbinol 8 8, 4.53 (1H, d,
J=14.5Hz, H-18) va 4.31 (1H, d, J=14.5Hz, H-18) , một mũi ở õ„; 10.29 (s) là mũi
cua proton nhóm hydroxyl (18-OH), ngoài ra NHŠ còn có tín hiệu của hai nhóm -
OCH; 6 3.68 (3H, s, 2-OCH3) va 3.63 (3H, s, 12-OCH;)
Từ các tín hiệu trên phổ '”C cho thấy NH5 có chứa 22 carbon, phổ DEPT
có tín hiệu của 5 nhém CH; , 3 nhóm CH¡;, 8 C tứ cấp, một liên kết C=C ở 147.0
(C-2) và 115.6 (C-3), một liên kết C=C đ 138.1 (C-12) và 146.7(C-13), có hai tín
hiệu của nhóm C=O bat bão hòa ở õc 196.9 (C-1) và 190.8 (C-11), một nhóm C=O lacton ở õc 168.2 (C-16) So sánh với phổ của chất quassin, NH5 có một vị
Trang 143.4 Thực nghiệm:
3.4.1 Các điều kiện thí nghiệm
3.4.1.1.Dung môi:
Oo CHCH: chưng cất lại, nhiệt độ 61-62°C MeOH ching cat lai, nhiét dé 64°C ° Acetat etyl (Trung Quốc)
° Eter dầu ( Trung Quốc) chưng cất ở nhiệt độ từ 60-00°C,
oO n-Butanol ( Trung Quốc)
3.4.1.2.Phương pháp sắc ký:
S Sắc ký bản mồng bản nhôm loại silica gel pha thường (Merck, Kielselgel
60 F2s„, 250m),
°o Thuốc thử H;ạSO¿ đậm đặc, nóng: load
° Sắc ký cột bấp phụ trên silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60, 40 - 6Qum), siica gel pha ngược RPus ( Merck, RP-18 Fosas }
3.4.1.3.Máy nhổ:
© NMR hiệu Bruker Avance 500 (SDOMH¿ cho 'H-NMR va 125MHz cho BC.NMR) ở Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Hà Nội
° Dung môi chạy phể (với TMS là nội chuẩn): CDCh,
3.4.2 Điều chế các loại cao
1.65 kg cây khô nghiền nhỏ và trích bằng phương pháp đun hoàn lưu, sau
đó đem cô quay dịch trích ở áp suất kém ta thu được cao metanol thé (61g) Cho phần cao thô này hòa tan vào nước và lần lượt chiết với các dung môi eter đầu
hỏa, acetat etyl và butanol, cô quay thu hổi dung môi ta thu được các loại cao tưững ứng: cao eter dau hóa, cao acetat etyl, cao butanol và dịch nước
Trang 15
3.4.3 Khảo sát cao chioroform
Cao chloroform (23.8 g) dude sac ky cét trén silicagel pha thường với hệ dung môi lúc đầu là chioroform sau đó tang dan d6 phan cực với hệ CHCH IMeOH thu được 13 phân đoạn Tiến hành sắc ký bản móng 13 phân đoạn trên
thấy các phân đoạn 1, 2, 4, 5,8 cho các vết tách tương đối rõ ràng
Sau đây chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các phân đoạn này,
3.4.3.1, Khảo sát phân đoạn 2:
Sắc ký cột phân đoạn A2 với dung môi CHCI;100% thu được 8 phân đoạn
E1-E8, sau đó tiếp tục sắc ký cột phân đoạn E2 bằng dung môi CHCH 100%
được 12 phân đoạn ELI-EL12, tiến hành sắc ký cột EL2 được 9 phân đoạn 11-19, cũ cạn dung môi phân đoạn J8 xuất hiện tỉnh thể màu trắng Rứa, kết tính lại
trong cter dầu hóa: aceat etyl(9:1) thu được NHI Sơ đề cô lập chất NHỈ Phân đoạn À2 (2.5%) Sắc ký cội siHca gel dung mdi CHC]; 100% được § phân đoạn EI-E§ phân đoạn E1(1,9g) Sắc ký cội silica gel dụng môi CHCI; 100% được § phân đoạn ELI-EL12 * Phân đoạn EL2 (1.526)
SKC, silica gel CHC] : eter đầu
w (5:5) dude 9 phan doan (11 - 19) Phan doan JS (2.82)
Trang 16
3.4,3.2.Khao sat phân đoạn 1:
3 85% c ký cội cao Chloroform (23,8 g) trên silica gel pha thường với hệ dung
3 œ ¡ lúc đầu = 95 : 5 thu được 13 phân đoạn, ký hiệu A1 ~ A13 Sau đó tiếp tục sắc ký cột phân đoạn A4 trên sHica gel pha thường, hệ dung môi CHCI]; : eter đầu(5 : 5) thu được 29 phân đoạn, ký hiệu EI ~ E29, từ phân đoạn E6 đến phân
đoạn E10 hiển thị một vết giống nhau nên gộp chung lại E6,
Sắc ký cột phân đoạn E6 hệ dung môi eter dầu hỗa: acetat etyl (6:4) thu được 13 phân đoạn ŒEL,1-EL 13) Cô cạn dung môi, phân doan EL4 xuất hiện tinh
thể màu trắng Rửa và kết tỉnh lại trong CHCH thu được chất NH2 Sơ đỗ cô lập chất NH2 Cao CHCh (23,8 ø) Sắc ký cột silica gel với nhiều hệ dụng ly có độ phân cực tăng dẫn ¥ 13 phan doan (AI-Ai3) Ỳ Phan doan Al (5.22) SKC, silica gel CHC) : eter đầu (5:5) được 29
phân đoạn (EI — E29) Phân đoạn E6 (2.8g)
SKC, silica gel hé eter dau: acetat
ety! (6:4) thu được 13 phân đoạn (ELI-EL13)
NH2
Trang 17
3.4.3.3 Khao sát phân đoạn 8:
Sắc ký cột phân đoạn A8 với dung môi CHC1;:MeOH (98:2), sau đó tăng dân độ phân cực thu được 28 phân đoạn, sắc ký bản mồng thấy các phân đoạn từ
18 đến 22 cho một vết giống nhau nên gộp chung thành phân đoạn 22, sau đó sắc
ký cột phân đoạn 22 với hệ dung môi CHCH;:MeOH (99:1) thu được § phân đoạn
Cô cạn dụng môi phân đoạn B5 thấy xuất hiện tình thể mau tring, rửa và kết tỉnh
trong chloroform thu được NH3 Sơ để cô lập chất NH3 Phân đoạn À8 (4.53) Sắc ký cột silica gel với hệ dụng mơi CHCÌ;:MeOH (98:2) thu được 28 phân đoạn Phân đoạn 22 (152mg)
Sắc ký cội silica gel với hệ
Trang 18
3.4.3.4 Khảo sát phân đoạn 4
Sắc ký cột phân đoạn A4 với hệ dung môi CHCI; :MeOH (95:5) thu được
13 phân đoạn KI-K13, sau đó tiếp tục sắc ký cột phân đoạn K3 trên silica gel
pha đảo với hệ dung môi CHC]; : MeOH : HO (14:6:1) được 11 phân đoạn KI-
K11, cô cạn dung môi phân đoạn K6 thu được tỉnh thể màu trắng, rửa và kết tinh
lại trong CHC]; thu được NH4 Sơ đồ cô lập chất NH4 Phân đoạn A4 (5.2g) Sắc ký cột silica gel CHCI]; (95:5) thu được 13 phân đoạn K1-K13 Phân đoạn K3 (2.8 g)
Sắc ký cột silica gel pha
Trang 19
3.4.3.5 Khảo sát phân đoạn Š :
Sắc ký cột phân đoạn A5 với hệ dung môi CHC]; :MeOH (95:5) thu được 12 phân đoạn KI-K12, sau đó tiếp tục sắc ký cột phân đoạn K5 trên silica gel pha đảo với hệ dung môi CHC]; : MeOH : HO (14:6:1) được 8 phan đoạn K1-
K8, cô cạn dung môi phân đoạn K5 thu được tỉnh thể màu trắng, rửa và kết tinh