Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 385 PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CỦA CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) TRONG CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM L.) EXPRESSION OF CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) IN TOMATO (LYCOPERSICON ESCULENTUM L.) SVTH: Nguyễn Khắc Tiệp Lớp 05SH, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa GVHD: PGS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc, ThS. Lê Thị Thính Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế TÓM TẮT Chúng tôi đã phân tích sự biểu hiện của tiểu đơn vị B độc tố cholera (CTB) trong cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.). Gen mã hóa CTB thích hợp với thực vật được dung hợp với trình tự SEKDEL và tạo dòng trong vector biểu hiện bên cạnh promoter CaMV 35S. Gen CTB sau đó được biến nạp vào cây cà chua thông qua Agrobacterium tumefaciens. Sáu dòng cây chuyển gen riêng lẽ được tái sinh trên môi trường chứa kanamycin sau 2 tháng. Khuếch đại DNA genomic cà chua bằng phản ứng PCR đã chứng minh sự có mặt của CTB trong cây cà chua. Sự biểu hiện và tự lắp ráp của protein CTB thành cấu trúc oligomer bằng kích thước pentamer được xác định bằng phân tích Western blot. Protein CTB tái tổ hợp trong cây cà chua có ái lực mạnh với GM1-ganglioside gợi ý rằng CTB đã bảo tồn những vị trí kháng nguyên cần cho liên kết và gấp nếp thích hợp thành cấu trúc pentamer. ABSTRACT We analysed expressing of the B subunit of cholera toxin (CTB) in tomato (Lycopersicon esculentum L.). Gene encoding the CTB adapted to the coding sequence of plants was fused to the endoplasmic reticulum retention signal (SEKDEL) to enhance its level of expression in plants and was cloned into a plant expression vector adjacent to the CaMV 35S promoter. The CTB gene was then introduced into tomato plant by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method. Six independent transgenic lines were regenerated on medium containing kanamycin after 2 months of culture. PCR amplification of genomic DNA confirmed the presence of the CTB in the transgenic tomato plants. Expression and assembly of CTB protein into oligomeric structures of pentameric size were observed in transgenic plant extracts by Western blot analysis. The recombinant CTB protein synthesized in the tomato plants showed strong affinity for GM1- ganglioside suggesting that the CTB conserved the antigenic sites for binding and proper folding of pentameric CTB structure. 1. Mở đầu CTB là tiểu đơn vị liên kết của độc tố cholera (CT-cholera toxin) của vi khuẩn Vibrio cholerae, một loại vi khuẩn gây bệnh tả ở nhiều nước đang phát triển. Độc tố CT có khối lượng phân tử 84 kDa, bao gồm các tiểu đơn vị (subunit) A và B. Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Tiểu đơn vị B chứa 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết với các điểm thụ cảm glucosphingolipid trên bề mặt tế bào eukaryote [6]. Tiểu đơn vị A chui qua màng tế bào và hoạt hóa enzyme adenylcysla - của tế bào ruột và giảm hấp thu NaCl của các nhung mao ruột và nước từ tế bào chảy vào lòng ruột dẫn đến tiêu chảy [13]. Một số nghiên cứu trên động vật mô hình cho thấy CTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc và màng nhầy để chống lại CT (Jiang et al., 2007). Vì vậy, CTB là một ứng viên kháng nguyên đầy hứa hẹn trong sản xuất vaccine phòng bệnh tả. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 386 Vaccine thực vật đã thu hút nhiều sự chú ý và đã trở thành tiêu điểm nghiên cứu và phát triển mạnh từ năm 1990 khi Curtiss và cộng sự lần đầu tiên thông báo về sự biểu hiện của kháng nguyên bề mặt của Streptococcus mutans (SpaA) trong cây thuốc lá [15]. Đến nay đã có nhiều protein kháng nguyên được biểu hiện thành công trong thực vật như protein kháng nguyên bề mặt của virus viên gan B (HBsAg-hepatitis B surface antigen) [3]; protein kháng nguyên của virus viêm gan E (HEV-hepatitis E virus) [10]; tiểu đơn vị B của độc tố E. coli mẫn cảm với nhiệt (LTB-the Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit) [5]. Tiểu đơn vị B của độc tố cholera (CTB- cholera toxin B subunit) cũng được biểu hiện trong cây thuốc lá, cây khoai tây, cây cà rốt, cây rau diếp [2,6,7]. Sản xuất protein kháng nguyên trong cây trồng rẻ hơn sản xuất bằng cách nuôi cấy vi khuẩn, nấm, tế bào côn trùng hoặc tế bào động vật có vú. Mặt khác, các kháng nguyên có nguồn gốc thực vật an toàn cho người hơn các kháng nguyên có nguồn gốc từ động vật và vi sinh vật, vì các chất tạp nhiễm và mầm bệnh của thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người [4]. Cà chua là một loại cây trồng phổ biến trên thế giới, quả của nó giàu dinh dưỡng, có thể ăn sống và đặc biệt nó có lượng DNA trên genome đơn bội tương đối nhỏ và có những nghiên cứu tốt về mặt di truyền. Vì vậy cà chua là cây trồng lý tưởng để sản xuất protein kháng nguyên dựa trên cơ sở thực vật [14]. Trong báo cáo này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu về biểu hiện gen CTB trong cây cà chua làm cơ sở cho việc phát triển mô hình vaccine thực vật sau này. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Vector biểu hiện được sử dụng là vector pMYO53 (Hình 1) mang gen CTB[5]. Hình 1. Vector biểu hiện pMYO53 mang gen CTB. pNOS: promoter của gen nos, NPTII: gen neomycin phosphotransferase, T-nos: terminator của gen nos, pCaMV 35S: promoter của CaMV 35S, sCTB: gen CTB tổng hợp, LB: biên trái, RB: biên phải. Cây cà chua (Lycopersicon esculentum L, CV311) chuyển gen CTB [1] được sử dụng để phân tích sự biểu hiện. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân tích PCR DNA tổng số của cà chua được tách chiết từ lá theo phương pháp của Kang et al., (2004). Phân tích PCR được thực hiện bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen CTB đã tối ưu như sau: mồi thuận 5’- ATGGTGAAGCTCAAGTTCGG-3’ và mồi ngược 5’-GTAGTTAGCCATGCTATTAG-3’. Thành phần PCR (trong 50 µl) bao gồm DNA khuôn mẫu (100 ng DNA tổng số của cà chua hoặc 10 ng DNA của pMYO53), 10 pmol mồi , 200 1,25 unit Taq polymerase (BioRad). : 95 0 : 95 0 LB pNOS NPTII t-NOS pCaMV 35S s CTB 3’UTR RB SEKDEL HindIII BamHI KpnI EcoRI Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 387 , 55 0 , 72 0 72 0 . Sản phẩm PCR được điện di trên 1% agarose gel và nhuộm bằng ethidium bromide. 2.2.2. Phân tích Western blot Mẫu lá cà chua (0.5 g) được nghiền trong nitrogen lỏng và tái huyền phù trong 1 ml đệm chiết (200 mM Tris-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 400 mM sucrose, 10 mM EDTA, 14 mM 2- mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0,05% Tween-20). Thu dịch nổi protein tổng số bằng ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C. Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng phương pháp [9] với BSA được dùng làm chất chuẩn. Protein tổng số và CTB tinh sạch được điện di SDS trên 12% polyacrylamide gel ở 80 V. Thẩm tích protein sau khi điện di SDS lên màng Hybond-C bằng hệ thống Trans-blot ® SD Semi-dry transfer cell (Biorad) ở 15 V trong 30 phút. Hạn chế phản ứng không đặc hiệu bằng 3% BSA trong đệm TBST (TBS + 0.05% Tween-20) ở nhiệt độ phòng (RT) qua đêm. Ủ màng Hybond-C với 1: 5.000 kháng thể CTB (Sigma C3062) trong đệm TBST với 1,5% BSA ở RT trong 2 giờ. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBST. Tiếp theo, ủ màng với 1: 7.000 kháng thể gắn alkaline phosphatase (Promega S3731) trong đệm TBST ở RT trong 2 giờ. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBST và 1 lần bằng đệm TMN (100 mM Tris pH 9.5, 5 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl). Phát triển màu bằng BCIP/NBT trong đệm TMN. 2.2.3. Phân tích liên kết CTB-GM1 Bọc các giếng của microplate bằng monosialoganglioside GM1 (Sigma) với 100 l/giếng (3 g/ml) trong đệm bicarbonate (pH 9.6). Đối chứng được bọc bằng BSA cũng một lượng tương tự như trên, ủ ở 4 o C qua đêm. Rửa microplate 3 lần bằng đệm PBST, hạn chế phản ứng không đặc hiệu với 1% BSA trong đệm PBS ở 37 o C trong 2 giờ. Rửa microplate 3 lần đệm PBST, ủ với dịch chiết protein 37 o C trong 2 giờ. Rửa microplate 3 lần bằng đệm PBST, ủ với 1: 5.000 kháng thể CTB (Sigma C3062) trong đệm PBS chứa 0,5% BSA ở 37 o C trong 2 giờ. Rửa microplate 4 lần bằng đệm PBST. Tiếp theo, ủ màng với kháng thể gắn horseradish peroxidase (Sigma, G7641) tỷ lệ 1:10.000 trong đệm PBS chứa 0,5% BSA ở 37 o C trong 2 giờ. Rửa microplate 4 lần bằng đệm PBST, phát triển màu bằng TMB (100 µL/giếng) (Pharmingen 2606KC và 2607KC). Đo OD (490 nm) bằng hệ thống ELISA tự động (BioRad). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Xác định gen CTB trong cây chuyển gen Sự hiện diện của gen CTB trong cây cà chua CTB trong vector pMYO53, trong này gợi ý gen C cà chua chuyển gen 2). 3.2. Phân tích biểu hiện của gen CTB Kết quả phân tích Western blot được trình bày M PC NC 1 2 3 4 5 6 564 bp 414 bp Hình 2. Điện di sản phẩm PCR. M: Chuẩn kích thước DNA (λ/Hind III), 1-6 cây cà chua chuyển gen CTB, NC: cây cà chua hoang dại, PC: vector pMYO53 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 388 ở hình 3 cho thấy có 3 dòng trong số 6 dòng cây chuyển gen xuất hiện tín hiệu lai có khối lượng phân tử vào khoảng 50 kDa tương đương với tín hiệu lai của protein tinh sạch của vi khuẩn được sử dụng như là đối chứng dương tính. Trong khi đó, cây hoang dại không có tín hiệu lai nào. Kết quả này khẳng định protein CTB đã biểu hiện trong cây cà chua chuyển gen và đã lắp ráp thành cấu trúc oligomer tương đương với cấu trúc pentamer của CTB vi khuẩn. Hình 3 cũng cho thấy 3 dòng cà chua chuyển gen còn lại mặc dù có mang gen CTB nhưng không thấy tín hiệu lai. Kết quả này cho biết protein CTB đã biểu hiện trong cây cà chua chuyển gen. Tuy nhiên, sự biểu hiện của gen ngoại lai ở các cây tái sinh thường là không giống nhau. Hình 3. Phân tích Western blot protein CTB trong cây cà chua. M: Chuẩn khối lượng phân tử protein (14,4-97 kDa); PC: CTB tinh sạch của vi khuẩn, NC: cây cà chua không chuyển gen; 1-6: cây cà chua chuyển gen CTB. Ái lực liên kết của protein CTB trong cây cà chua chuyển gen với thụ thể ganglioside-GM1 được xác định bằng phân tích GM1-ELISA. Kết quả trình bày ở hình 4 cho thấy protein CTB của các cây cà chua chuyển gen có ái lực đối với GM1-ganglioside nhưng không có ái lực đối với BSA. Khả năng liên kết của protein thực vật với các thụ thể ganglioside phụ thuộc vào sự hình thành cấu trúc pentamer từ các monomer [12]. Sự lắp ráp các monomer thành cấu trúc pentamer là cần thiết cho sự liên kết và nhận biết của các tế bào niêm mạc ruột [8]. Hiệu lực liên kết k protein CTB với ganglioside-GM1 chứng tỏ rằng các tiểu đơn vị CTB từ thực vật đã có tính cộng tác với GM1 [11]. Cả hai phân tích Western blot và liên kết GM1-ELISA trên cây cà chua chuyển gen đã chứng minh protein CTB tự lắp ráp thành cấu trúc pentamer có hoạt tính sinh học. Hình 4. Phân tích CTB-GM1. 1, 2, 3: cây cà chua chuyển gen; NC: cây cà chua không chuyển gen. 4. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy sau khi được biến nạp bằng A. tumefaciens, gen CTB đã biểu hiện trong cây cà chua và chúng có ái lực liên kết khá mạnh với ganglioside-GM1. M PC NC 1 2 3 4 5 6 P 97 30 66 kDa Mật độ quang (490 nm) 1 2 3 NC 1 2 3 NC GM1 BSA 0.24 0.03 0.3 0.02 0.31 0.03 0.03 0.02 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 389 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Thị Thính (2010). Biểu hiện của CTB (Cholera Toxin B Subunit) trong cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.). Tạp chí công nghệ sinh học (đã gửi đăng) [2] Arakawa T, Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997). Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants. Transgenic Research 6: 403-413. [3] Gao Y, Ma Y, Li M, Cheng T, Li SW, Zhang J and Xia NS (2003). Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg, World J. Gastroenterol, 9(5): 996- 1002. [4] Giddings G (2001).Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology 12: 450-454. [5] Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE and Yang MS (2003). Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Research 12: 683-691. [6] Kang TJ, Loc NH, Jang MO, and Yang MS (2004). Modification of cholera toxin B subunit coding sequence to enhance expression in plants. Molecular Breeding 13: 143-153. [7] Kim YS, Kim BG, Kim TG, Kang TJ and Yang MS (2006). Expression of a cholera toxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca sativa L.) using Agrobacterium-mediated transformation system. Plant Cell Tiss Organ Cult 87: 203-210. [8] Kim TG, Kim MY, Kim BG, Kang TJ, Kim YS and Jang YS (2007). Synthesis and assembly of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca sativa L.). Protein Expr Purif 51: 22-27. [9] Lowry OH, Brough NJ, Rondaller J and Farr AL (1951) Protein measurement with folic phenol reagent, J Biol Chemi, 193: 265-275. [10] Ma Y, Lin SQ, Gao Y, Li M, Luo WX, Zhang J and Xia NS (2003). Expression of ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes immunoactivity of expression products. Word Journal of Gastroenterology 9(10): 2211-2215. [11] Merritt EA, Sixma TK, Kalk KH, Van Zanten BA, Hol WG (1994). Galactose-binding site in Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT). Mol Microbiol 13: 745- 753. [12] Rosales-Mendoza S, Soria-Guerra RE, Olivera-Flores MTD, Lopez-Revilla R, Argullo- Astorga GR, Jimenez-Bremont JF (2007). Expression of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) in carrot (Daucus carota L.). Plant Cell Reports 26: 969-976 [13] Sack DA, Sack RB, Nair GB and Siddique AK. (2004). Cholera, The Lannet 363: 223-233. [14] Van Roekel JSC, Damm B, Melchers LS, and Hoekema A (1993). Factor influencing transformation frequency of tomato, Plant Cell Reports 2: 644-647 [15] Walmsley AM and Arntzen CJ. (2000). Plant for delivery of edible vaccines, Current Opinion in Botechnology 11: 126-129. . (LTB-the Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit) [5]. Tiểu đơn vị B của độc tố cholera (CTB- cholera toxin B subunit) cũng được biểu hiện trong cây thuốc lá, cây khoai tây, cây cà. động (BioRad). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Xác định gen CTB trong cây chuyển gen Sự hiện diện của gen CTB trong cây cà chua CTB trong vector pMYO53, trong này gợi ý gen C cà chua chuyển. protein (14,4-97 kDa); PC: CTB tinh sạch của vi khuẩn, NC: cây cà chua không chuyển gen; 1-6: cây cà chua chuyển gen CTB. Ái lực liên kết của protein CTB trong cây cà chua chuyển gen với thụ thể