NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae TRÊN BÃ MÍA ĐỂ SẢN XUẤT RƯỢU DÂU TẰM

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae TRÊN BÃ MÍA ĐỂ SẢN XUẤT RƯỢU DÂU TẰM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



ĐỒ ÁN MÔN HỌC CHUYÊN NGÀNH

cerevisiae TRÊN BÃ MÍA ĐỂ SẢN XUẤT RƯỢU

DÂU TẰM

SVTH : PHAN NGỌC MỸ HÒA

CBHD: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Tp.HCM, tháng 6 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự thành kính, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

 PGS TS Nguyễn Đức Lượng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học BáchKhoa TpHCM – đã gợi ý đề tài và hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốtquá trình thực hiện đồ án này

 Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thứcquý báu có liên quan đến đề tài

 Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùnghọc tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 5

1.1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI: 2

1.2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: 3

1.3.NỘI DUNG NGIÊN CỨU: 3

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 4

2.1.NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae: 5

2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men: 5

2.1.2.Đặc điểm sinh lý của nấm men: 7

2.2.1 Ưu & nhược điểm của nấm men cố định: 11

2.2.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào: 11

2.2.3 Kỹ thuật cố định tế bào: 13

2.3 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN BÃ MÍA: 16

2.3.1 Nguồn bã mía: 16

2.3.2 Cấu tạo hóa học bã mía: 16

2.4 PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BÃ MÍA: 20

2.4.1 Vật liệu: 20

2.4.2 Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: 20

2.5 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RỰƠU VANG DÂU TẰM: 23

2.5.1 Bản chất của quá trình lên men: 23

2.5.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae: 25

2.5.3 Dâu tằm: 25

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: 27

2.5.5 Quá trình lên men rựơu vang: 31

CHƯƠNG III: TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 35

3.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI: 36

3.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM: 42

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại chất mang 12

Bảng 2.2 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào 14

Bảng2 3.: Thành phần hóa học của bã mía 17

Bảng 2.4 Thành phần hóa học của dâu tằm 26

Bảng 2.5 Hàm lượng vitamin có trong dâu tằm 26

Hình 2.1 Cấu tạo tế bào nấm men.(a) Mô hình mặt cắt tế bào, (b) Hình mô phỏng các

thành phần của tế bào 5

Hình 2.2 Vỏ tế bào nấm men 6

Hình 2.3 Cấu trúc màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein) 6

Hình 2.4 Chức năng của chất dinh dưỡng 8

Hình 2.5 Chu kỳ sinh sản của nấm men Saccharomyces 9

Hình 2.6 Đồ thị sinh trưởng và thành phần dinh dưỡng trong lên men vi sinh 10

Hình 2.7 Sản lượng và năng suất mía 16

Hình 2.8 Cấu trúc của lignocellulose Lớp S1 vàS3 chứa hemicellulose và cellulose vô định hình nhiều hơn Lớp S2 chứa các vùng cellulose kết tinh .17

Hình 2.9 Cấu tạo cellulose 18

Hình 2.10 Cấu trúc Hemicellulose 19

Hình 2.11 Cấu tạo Lignin .20

Hình 2.12 Cấu trúc của chất mang bã mía.(a) Hình sợi bã mía ,(b) Hình nấm men bên trong bã mía, (c) Hình nấm men bám vào nhu mô bã mía 22

Hình 2.13.a Quá trình đường phân 24

Hình 2.13.b Quá trình chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol 25

Hình 2.14 Cây dâu tằm Đà Lạt 26

Hình 2.15 Dâu tằm đen Đà Lạt 26

Hình 3.1 Đồ thị cho thấy sự giảm khối lượng bã mía theo thời gian 36

Hình 3.2 Đánh giá các thông số của quá trình lên men rượu liên tục trên thân cây mía với các nồng độ pha loãng .38

Hình 3.3 Cố định và duy trì hiệu quả tế bào cố định theo thời gian 40

Hình 3.4 Tốc độ tăng trưởng theo thời gian của tế bào cố định 40

Hình 3.5 Sự thay đổi của pH theo thời gian 41

Chương 1: Mở đầu

CHƯƠNG 1:

LỜI MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI:

Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rựơu vang là loại đồ uống lên men trực

tiếp từ nước quả Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắngtrong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho,nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang

là rượu không chưng cất từ các loại nước quả

Sản xuất rượu trái cây dựa trên cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lênmen các loại nước quả dưới tác dụng của hệ enzyme nấm men Nấm men sử dụng nguồn

cơ chất từ nước quả ( nho, mơ, dứa, dâu tằm, … ) có chứa đường glucose, fructose, cácchất peptin, các axit hữu cơ ( axit tactaric, malic, sucsinic) và muối của những axit này,các hợp chất màu, hợp chất hương, vitamin, muối khoáng, …vừa để tăng sinh khối, vừatạo ra sản phẩm rượu, CO2 , glyxerin, axit acetic, axit lactic, …

Hiện nay, có hai phương pháp lên men rượu vang: lên men tự nhiên và lên men nhờcác chủng nấm men thuần khiết Phương pháp sản xuất rượu vang từ chủng thuần khiết córất nhiều ưu điểm: thời gian lên men nhanh, sử dụng triệt để nguồn cơ chất, nồng độ cồnthu được cao hơn lên men tự nhiên là 0,1 – 1o , vang sáng màu nhanh hơn, có hương vịthanh khiết hơn

Trong quá trình sản xuất rượu nấm men thường bị loại bỏ sau khi kết thúc quá trìnhlên men Nấm men sau khi loại bỏ không thể tái sử dụng gây lãng phí Hơn thế nữa, nấmmen phân tán trong dung dịch, nên không thể lọc bỏ hết triệt để, trong quá trình bảo quảnphần nấm men còn sót lại sẽ lắng xuống đáy, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm về chỉtiêu cảm quan Để giải quyết những vấn đề này, các nhà khoa học đã đề ra biện pháp: sửdụng nấm men cố định vào lên men rượu

Phương pháp này mục tiêu là giữ các tế bào nấm men trên một chất mang, nhằm tănghệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phươngpháp cố định đã được áp dụng

Đối với sản xuất qui mô công nghiệp, người ta lên kế hoạch sản xuất dựa trên chi phínguyên liệu, và chi phí sản xuất Vì thế nên xu hướng hiện nay là tận dụng nguyên liệu rẻtiền hoặc phế phẩm Điều này đã dẫn đến nhiều cuộc nghiên cứu, nhằm tìm kiếm, nhữngnguyên liệu rẽ tiền thường bị lãng quên, hay cách tận dụng nguồn phế phẩm

Chương 1: Mở đầu

Ở nước ta, nghề trồng dâu tằm đã có từ rất lâu Tuy nhiên, lại có truyền thống là

“trồng dâu nuôi tằm”, lấy lá mà không lấy trái Trái dâu được làm mứt, bánh kẹo, nhưmột nguồn kinh tế phụ Có thể nói, trái dâu ở nước ta bị xem như là nguồn sản phẩm thứcấp của ngành nông nghiệp Vì hàm lượng đường trong dâu tằm khá cao ( 10%), màu tráidâu rất đậm và có đặc điểm rất riêng để tạo ra vang đỏ Thế nên, việc ứng dụng dâu trongsản xuất rượu vang mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn mà ta không thể bỏ qua

Như đã nói ở trên, cố định tế bào nấm men là một phương pháp mới, đi đôi với nó làvấn đề chất mang Tiêu chí kinh tế đặt ra là chất mang càng rẻ, càng dễ tìm, càng tốt Dựavào lý thuyết về yêu cầu chất mang, cũng như nguyên tắc của phương pháp, thì các vậtliệu lignocellulose là một chất mang sinh học đã được khám phá, và bã mía đã được ápdụng Bã mía là nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp sản xuất đường, thường đượclàm nguyên liệu cho ngành sản xuất thức ăn gia súc và làm nguồn nguyên liệu cho nhàmáy Tuy nhiên, nguồn phế phẩm này rất lớn, và tiềm năng không nhỏ,nên ngày nay đã

có nhiều hướng nghiên cứu ứng dụng bã mía Một trong số đó là nghiên cứu cố định visinh vật trên bã mía

Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu phương pháp cố định nấm men trên bãmía, và khả năng ứng dụng của nó vào sản xuất rựơu vang

Để giải quyết những vấn đề trên, ta tiến hành các bước:

Khảo sát các yếu tố ành hưởng của quá trình cố định nấm men

Khả năng ứng dụng nấm men cố định trên bã mía vào sản xuất

CHƯƠNG 2:

TỔNG QUAN

Chương 2: Tổng quan

2.1 NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae:

Giống Saccharomyces quan trong nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được dùng

nhiều trong công nghiệp thực phẩm Một số chủng nấm men dùng trong công nghiệp sảnxuất bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rựơu vang, sản xuấtglycerol hoặc enzyme invertase

2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men:

2.1.1.1 Hình thái:

Tế bào hình cầu, hình ovan, elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy, hoặc đôi khi làhình sợi Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển

và diều kiện môi trường xung quanh

Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µm, chiều dài 8

µm Trọng lượng riêng của nấm men (1,055 – 1,060 KDa) không khác mấy so với vikhuẩn (1,050 – 1,142 KDa) [5]

 Vỏ tế bào:

Bao quanh nấm men Cấu tạo bởi

protein, polysaccharide, phosphate và lipid

Trong thành phần poly saccharide có chứa

glucan (chủ yếu) và manan ( chiếm 90%

chất khô của vỏ)

Glucan là thành phần chính của vỏ, là

một polyme của glucoza Nằm phía trong

tiếp giáp màng tế bào chất Nếu lớp glucan

bị phá hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy

Manan có thể kết hợp với protein tạo thành

lớp manoprotein rất khó phá hủy [5]

Là lớp màng mỏng, dày 0,1 nm dính chặt với tế bào chất

Chức năng của màng tế bào chất:

+ Bảo vệ, hàng rào thẩm thấu

+ Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại

+ Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào

+ Nơi khu trú của một số enzym và bào quan (ribosome)

Vận chuyển vật chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu chọn lọc màng tế bào.Đặc tính này phụ thuộc enzyme phospholipase và lipase [5]

Hình 2.2 Vỏ tế bào nấm men [16]

Hình 2.1 Cấu tạo tế bào nấm men.(a) Mô hình mặt cắt tế bào[16], (b) Hình mô

phỏng các thành phần của tế bào[15 ]

Chương 2: Tổng quan

Hình 2.3 Cấu trúc màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)[14]

Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp chất khác

Có độ nhớt cao, chứa các bào quan Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của nấm men [5]

Dạng hạt nhỏ hoặc hình que, dạng sợi Hình dáng thay đổi trong quá trình nuôi cấy,hình que, hình sợi đơn hoặc kết chuỗi Số lượng ti thể dao động mạnh từ 1 – 50 Trongmôi trường có nồng độ glucozse thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ởnồng độ cao chỉ thấy 30 – 40

Hầu hết các phản ứng năng lượng đều xảy ra ở đây Cấu trúc của ti thể biến đổi khinấm men chuyển từ điều kiện kỵ khí sang hiếu khí Ở môi trường kỵ khí với không cólipid thì ti thể rất đơn giản gồm: hai lớp màng, nhưng không có nếp gấp Nếu thêm lipid

sẽ tạo nếp gấp [5]

Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA Kích thước nhân không đồng nhất ởcác chủng nấm men và ngay cả cùng một chủng [5]

giống như tế bào thực vật [5]

2.1.2.Đặc điểm sinh lý của nấm men:

2.1.2.1.Thành phần hóa học của tế bào nấm men:

Nước chiếm 75% khối lượng Thành phần sinh khối khô là:

Chất vô cơ 5 – 10

Cacbon 25 – 50

Nitơ 4,8 – 12

Protein (N x 5,25) 30 – 75

Lipit 2 – 5

Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% chất tro [5]

2.1.2.2.Dinh dưỡng nấm men:

Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp tinh bột,

cellulose, hemicellulose Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose, fructose, maltose,

saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose, melibiose

Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là axit béotùy thuộc vào thành phần của các axit này Trong đó axit acetic và glucose được sử dụngđồng thời Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước

Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO2 trong trao đổi chất của nấm men,

vì CO2 là chất hoạt động sinh học Những dạng liên kết với CO2 đều cần thiết cho nấmmen, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt acid hữu cơ khác[5]

Nguồn nitơ cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những hợp chất hữu

cơ hoặc vô cơ

Tuy nhiên nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni:amoni sulfat, phosphat, muối axetat, lactat, malat, Trong môi trường chứa muối amoni,đặc biệt là sulfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit sử dụng sau hoặc làmaxit hóa môi trường Môi trường lỏng ammoniac (NH4+), là môi trường lý tưởng cho nấmmen chỉ sau axit amin Nấm men sử dụng cả ure và pepton

Nấm men tiêu hóa tốt acid amin tự nhiên, các nucleotide purin, pyrimidin, protein,một số amin, còn pepton kém hớnvà không sử dụng protein Các acid amin đóng vai trò lànguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon Nấm men chỉ sử dụng axit amin dạng tự nhiên Hàmlượng nitơ phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí, chủng loại nấm men.[5]

Chương 2: Tổng quan

Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng

Trong đó nhu cầu phospho là được quan

tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu

huỳnh, …

Phospho chứa trong nhiều hợp chất

quan trong của tế bào Nấm men sử dụng

tốt nguồn phosphor vô cơ là ortophosphat

Thiếu phosphor trong môi trường dẫn đến

sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá

hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon, nitơ

Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá hỏng sự traođổi chất và tổng hợp enzyme, protein Trong điều kiện kỵ khí, S bị khử thành H2S

Nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như: mangan, đồng, sắt,kẽm, …[5]

2.1.2.3 Đặc tính sinh sản của nấm men:

Nghiên cứu đặc tính di truyền của nấm men tại Đan Mạch (1935), ông Carlsberg phát

hiện: các loài thuộc giống Saccharomyces có thể biến đổi giữa 2 dạng đơn bội và nhị bội.

Tế bào nấm men có hai giới tính α và a Các tế bào đơn bội sinh ra α và a được hình thànhqua nguyên phân bằng cách nảy chồi Chúng kết hợp với nhau thành bào tử lưỡng bội aα.Khi gặp điều kiện dinh dưỡng kém, chúng giảm phân tạo nang chứa 4 bào tử: 2α và 2a.Sau đó, tế bào sinh sản theo kiểu vô tính hoặc hữu tính

Hình 2.4 Chức năng của chất dinh

dưỡng [14]

Hình 2.5 Chu kỳ sinh sản của nấm men Saccharomyces [13]

(1): Quá trình sinh sản vô tính ( nảy chồi )

(2): Quá trình sinh sản hữu tính ( giao hợp )

(3): Quá trình tạo nang chứa 4 bào tử

Quá trình sinh sản của nấm men liên quan chặt chẽ đến sự nảy chồi Chồi tách khỏi tếbào mẹ khi có kích thước bằng tế bào mẹ và bắt đầu sinh sản Thời gian thế hệ là chu kỳsinh sản được tính là khoảng thời gian giữa hai lần phân chia Thời gian thế hệ của nấm

men Saccharomyces cerevisiae là 2h Quá trình nảy chồi diễn ra đồng thời với bắt đầu

tổng hợp AND Quá trình này liên quan đến hiện tượng làm mềm vỏ tế bào bằng enzymelytic, enzyme này tác dụng lên polysaccarit của thành vỏ tế bào Từ chồi mới hình thànhcác vật liệu mới của tế bào lớn dần lên, hình thành vách ngăn chitin, mannan, glucan.Chồi tách ra và để lại sẹo [5]

2.1.2.4 Sinh trưởng của nấm men:

Chương 2: Tổng quan

Hình 2.6 Đồ thị sinh trưởng và thành phần dinh dưỡng trong lên men vi sinh [14]

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong lên men, gồm 4 pha: pha thíchnghi, pha tăng trưởng, pha cân bằng, pha suy vong

Pha thích nghi: ( pha lag ) nấm men mới cấy vào môi trường, đang thích nghi với môi

trường mới Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không, nồng độ chất dinh dưỡng còn rấtnhiều Đây là thời kỳ tiềm phát của nấm men, trong đó một số tế bào bị ức chế, thậm chí

có thể chết Số lượng tế bào nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng khôngđáng kể, nhưng sự trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ Kích thước tế bào tăng, hàm lượngprotein, axit nucleic tăng lên Trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm men cấyvào càng trẻ khỏe và pha lag càng ngắn

Pha tăng trưởng: ( pha log ) tăng sinh khối, tế bào phát triển ồ ạt theo cấp số nhân: 20

 21  22  23  24  … 2n với tốc độ tăng trưởng là cực đại Kích thước tế bàonấm men ở pha này nhìn chung là nhỏ nhất, vì chúng cón phải sinh sản Đối với tế bàotrong pha này chúng có hoạt tính sinh lý, sinh hóa rất đặc trưng và rất nhạy cảm vớinhững nhân tố bất lợi của môi trường

Trong pha này, chất dinh dưỡng giảm mạnh và bắt đầu xuất hiện sản phẩm trao đổi chấtkhông cần thiết đối với giống và quá trình chuyển sang pha ổn định Nếu là quá trình thusinh khối ta nên thu vào cuối giai đoạn này

Pha cân bằng: quần thể tế bào ổn định, tỉ lệ sinh ra bằng tỷ lệ mất đi Sản phẩm trao

đổi chất tích tụ nhiều, chất dinh dữơng cạn kiệt Thu sản phẩm trao đổi chất trong phanày

Pha suy vong: tế bào chết, dinh dưỡng cạn kiệt và tế bào chất tăng dần Tế bào nấm

men có khả năng tự phân do enzyme proteaza nội bào Các tế bào sống trở nên già đi,kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt Tế bào chất bị tự phân trởnên trống rỗng và bên trong còn lại những hạt cầu béo nhỏ [5]

2.2 PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH VI SINH VẬT:

2.2.1 Ưu & nhược điểm của nấm men cố định:

Ưu điểm:

Có thể tái sử dụng nhiều lần

Sản phẩm sạch, giảm chi phí tinh sạch

Bền với môi trường nhờ sự bảo vệ của chất mang

Điều chỉnh hình dạng kích thước để phù hợp với thiết bị

Hạn chế sự rửa trôi của tế bào trong quá trình sản xuất liên tục

Giảm chi phí, giá thành

Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa chất mang và cơ chất

2.2.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào:

2.2.2.1 Yêu cầu chất mang:

Có tính trơ cao ( bền hóa học), không bị hòa tan, không tác dụng với những sản phẩmthứ cấp sinh ra trong dịch

Bền sinh học ( không bị vi sinh vật phá hùy)

Tính chất cơ lý bền vững, ổn định, để chịu được tác động của môi trường

Có độ xốp, để quá trình trao đổi chất được thực hiện dễ dàng

Không gây ức chế hay làm mất hoạt tính enzyme của vi sinh vật

Có khả năng bám dính tốt dễ gắn vi sinh vật vào

An toàn với môi trường

Không cạnh tranh với cơ chất

Chương 2: Tổng quan

Rẻ tiền, dễ tìm[2][3]

2.2.2.2 Phân loại chất mang:

Có hai loại chất mang:

Chất mang tự nhiên: Tinh bột, cellulose, agar, alginate, BC ( bacterial cellulose), Chất mang nhân tạo: polyme từ mủ cao su, poly striren, poly acetate

Bảng 2.1 Phân loại chất mang [3]

Hữu cơ Tự nhiên Agarose, cellulose, alginate, BC

(bacterial cellulose), …Nhân tạo Polyacrylamide, poly striren, poly vinyl

Vô cơ Tự nhiên Seolit, silicate, …

Nhân tạo Allumimium oxide ( Al2O)

Cellulose: giá rẻ, tính cơ lý khá tốt, nhưng không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử

dụng dạng sợi và vi hạt

Agarose: ổn định, đồng nhất, dễ tạo hạt, tuy nhiên giá đắt nên khônng sử dụng trong

sản xuất mà chỉ dùng trong nghiên cứu, y học

Alginate: tạo gel trong môi trường có CaCl2, để nhốt enzym và tế bào, nhưng tính chấtkhông ổn định trong môi trường có phosphat Dù vậy, đây là vật liệu dễ tìm, rẻ ( acidalginic có trong rong biển), có khả năng tạo gel, tạo hạt Nên ứng dụng nhiều trong côngnghiệp, cố định tế bào và enzym

Poly acrilamide: có nhiều đặc tính quý báo: bền, tính trơ cao, độ trương tốt, độ đồng

nhất cao, kích thước lỗ gel có khả năng điều chỉnh, diện tích tiếp xúc lớn Tuy nhiên giáhơi cao

Seolite: Men/2 O Al2O3.xSiO2 yH2O Là các tinh thể alluminosilicat, có cấu trúc khônggian ba chiều, mang các lỗ xốp kích thước cỡ phân tử Được dùng nhiều trong cố địnhnấm men

2.2.3 Kỹ thuật cố định tế bào:

2.2.3.1 Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang:

Vật liệu: Thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxit kim loại, đất hiếm, cao lanh, …

Nguyên tắc thực hiện: Thông qua các liên kết cộng hóa trị( giữa nhóm amin và nhóm

cacboxyl), liên kết tĩnh điện giữa những bề mặt mang điện tích, lực Vandewalls Cácphương pháp gắn này cụ thể dựa trên, những nguyên tắc sau:

+ Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất mang.+ Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra 2 trường hợp:

Trường hợp 1: Chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amincủa protein vi sinh vật

Trường hợp 2: Phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang những chất cókhả năng phản ứng Tiếp theo đó, là tạo liên kết giữa các nhóm trên chất mang với tế bào

vi sinhvật

Ưu & nhược diểm của phương pháp: Phương pháp này có thể tạo được những liên

kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trịnày thường tốn công và mắc tiền [2][3]

Vật liệu: Sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt mạnh như: cellulose, agarose,

polyacrylamide, chitin, nylon, thủy tinh, …

Nguyên tắc thực hiện: Dựa vào cơ chế hấp phụ Có thể xảy ra các trường hợp sau:

+ Thứ nhất là, chất mang có nhiều lỗ xốp, tế bào vi sinh vật bám vào các lỗ xốp và toàn

bộ bề mặt chất mang

+ Thứ hai, đối với chất mang không có lỗ xốp (thủy tinh) tế bào sẽ bám trên bề mặt chấtmang

+ Thứ ba, khi chất mang tích điện (nhựa trao dổi ion) chúng sẽ tạo liên kết ion

Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi

trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào vi sinh vật dư

Ưu & nhược điểm: Ưu điểm của phương pháp là dễ thực hiện, đơn gản Tuy nhiên, có

nhược điểm là liên kết vật lý này rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang [2][3]

2.2.3.2 Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel:

Vật liệu: Có thể sửa dụng các loại sau:

Ion gel: các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên kết

ion

Với chất mang polymer như covalent: trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với cácmonomer rồi đem trùng hợp, hoặc trộn chung với polymer tạo liên kết giữa các sợipolymer.

Gel aginate: tiến hành như sau: Đầu tiên gel alginate được đun sôi để nguội đến 30oC.Sau đó, khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào tỷ lệ 1:1, khuấy nhẹ 30vòng / phút, trong5’ – 10’ Tạo hình, cố định hình trong dung dịch CaCl2 Tiếp theo, rửa nước vô trùng.Cuối cùng bảo quản lạnh

Ưu & nhược điểm:

Phương pháp này có ưu điểm là: hiệu suất cao, tế bào ít bị rửa trôi Tuy nhiên, vì nằm

trong khuôn gel nên không chịu được khuấy trộn Các tế bào trong khuôn gel phân bốkhông đồng đều, các tế bào nằm trên bề mặt sẽ tham gia lên men Đồng thời sản phẩmtrao đổi chất làm trương nở hạt gel, gây bể vỡ [2][3]

2.2.3.3 Phương pháp cố định không có chất mang:

Vật liệu: Sử dụng các tác nhân liên kết như: glutaraldehyde, toluen, hexamethylen, … Nguyên tắc: Sử dụng các tác nhân liên kết để gắn tế bào thành một khối Các tác nhân

này phải có tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật và liên kết với thành tế bào visinh vật [2][3]

Bảng 2.2 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào

Hấp phụ lê bề mặt rắn Phương pháp đơn giản, Lực liên kết yếu, tế bào

điều kiện nhẹ nhàng,đảm bảo sự sống tốt cho

tế bào

dễ bị tách khỏi nếu cólực cơ học, số lượng tếbào bị hấp thụ thấp

Tạo liên kết cộng hóa trị Độ bền giữa các liên kết

tốt, khả năng trao đổichất cao

Tế bào gắn vào khảnăng sống thấp, hoạt lựcthấp Do đó, đòi hỏi tếbào phải có khả năng tạoliên kết vơi chất mang

Nhốt vào hệ gel Hiệu suất nhốt cao, độ

bền cao, có khả năngứng dụng với nhiều loại

tế bào

Hoạt tính tế bào thấphơn tế bào tự do, vì bịchất mang cản trở Cóthể xảy ra sự cạnh tranhgiữa chất mang và cơchất Những sản phẩmbậc hai tích tụ có khảnăng làm hư hỏng chấtmang

Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng, nên tùy vào mục đích công nghệ,cách tiến hành mà chọn phương pháp cố định phù hợp

2.3 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN BÃ MÍA:

2.3.1 Nguồn bã mía:

Việt Nam là một đất nước nhiệt đới, rất thuận lợi cho việc phát triển mía đường Hiệnnay mía đường, được trồng trên cả nước, nhiều nhất là vùng Đồng bằng sông Cửu Long,Đông Nam Bộ, và Duyên hải Nam Trung Bộ [12]

Chương 2: Tổng quan

Hình 2.7 Sản lượng và năng suất mía [12]

Theo như thống kê, sản lượng mía mỗi năm là 1,3 triệu tấn dùng trong công nghiệp,tức là có khoảng hơn 1 triệu tấn bã mía được thải ra mỗi năm Đây là nguồn nguyên liệudồi dào cho sản xuất

2.3.2 Cấu tạo hóa học bã mía:

Bã mía chứa khoảng 40% cellulose, 24% hemicellulose và 25% lignin Trong tế bàothực vật, bao gồm bã mía, có một vách có cấu tạo gồm 3 lớp ( S1, S2, S3) được baoquanh bởi lignin Các lớp S1, S3 chứa chủ yếu là cellulose và hemicellulose vô định hình.Lớp S2 chứa cellulose kết tinh Vùng kết tinh được định dạng bởi liên kết hydrogen theomột sắp xếp có thứ tự Tuy nhiên, các vùng vô định hình cũng tồn tại trong cellulose.Cellulose, hemicellulose, lignin hiện diện giữa ba lớp S1, S2, S3 Sự minh họa cấu trúcthành tế bào được thể hiện qua hình 2.8