Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng

Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng

MỤC LỤC

Mục lục i

Danh mục bảng iii

Danh mục hình iv

Lời mở đầu 1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu 2

1.2 Enzyme 3

1.2.1 Phân loại 3

1.3 Enzyme Bromelain 3

1.3.1 Cấu tạo hóa học 4

1.3.2 Cấu trúc không gian 4

1.3.3 Tính chất vật lý 5

1.3.4 Hoạt tính của Bromelain 5

a Hoạt tính phân giải 5

b Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelain 6

CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 8

2.1 Ứng dụng trong y dược 8

2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 8

2.1.2 Bromelain làm liền sẹo 9

2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp 9

2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch 9

2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn 9

2.1.6 Bromelain và HIV 9

2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 10

2.2.1 Bromelain làm mềm thịt 10

2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa 10

2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản 10

2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may 10

2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 10

2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease 10

2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng 11

CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN 13

3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain 13

3.1.1 Phương pháp siêu lọc 13

a Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc 13

b Các kiểu siêu lọc 14

c Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc 15

3.1.2 Phương pháp kết tủa 15

3.1.3 Phương pháp hấp phụ 18

3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain 18

3.2.1 Phương pháp thẫm tích 18

3.2.2 Phương pháp lọc Sephatex G-50 18

3.2.3 Phương pháp sắc kí 19

Kết luận 20

Tài liệu tham khảo 21

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelain thân 5Bảng 1.2 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain 6Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide của Bromelain 6

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain 4

Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800mcu/g) 12

Hình 2.2 Dược phẩm chức hàm lượng Bromelin cao 12

Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin 12

Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc giúp bệnh Gút 12

Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo 12

Hình 2.6 Dứa enzyme: Complex – 800 GDU 12

Hình 3.1 Lọc cross - flow 13

Hình 3.2 Kiểu một bước 14

Hình 3.3 Kiểu lô 14

Hình 3.4 Kiểu thể tích không đổi 15

Hình 3.5 Quy trình thu nhận enzyme Bromelain 17

Hình 3.6 Cấu tạo của kaolin 18

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sảnphẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme Việcsản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vìđược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặcbiệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giáthành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như antoàn sinh học, không gây bệnh đối với người Một trong những enzyme quan trọngtrong cuộc sống đó là enzyme Bromelain nó được ứng dụng trong công nghiệp, thựcphẩm và quan trọng nhất là trong y dược

Với những đặc điểm và tầm quan trọng của enzyme Bromelain Đề tài “Tìm

hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” được thực hiện nhằm ly trích

và giúp hiểu được tầm quan trọng của enzyme Bromelain trong cuộc sống

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu

Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở

Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những

vùng này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang

dại

Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu

hết ở các nước trừ ở Châu Âu Các nơi trồng nhiều như

là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta,

dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượngkhoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam Các tỉnh trồng dứa nhiều ởmiền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, TuyênQuang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam…

Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó

có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish

- Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng80% diện tích Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, LâmĐồng Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông Thịt quả kémvàng, nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen

- Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây Đây là nhóm dứatrồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ởphía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông CửuLong (còn gọi là khóm hoặc thơm) Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắtlồi Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu Nhóm này có chấtlượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi

- Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta Nhóm này được trồng ởThailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu Thịt quảvàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa Dứa nhómnày chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên khôngđược phát triển

1.2 Enzyme

- Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sựtrao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại Quá trình trao đổi củamột chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp Enzyme là hợpchất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặchiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo mộtchiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

- Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tácnhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tácsinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

- Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quátrình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọngtrong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phântích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứngdụng sản xuất dược phẩm

1.2.1 Phân loại

- Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên

gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:

Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử.

Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) nào

đó từ chất này sang chất khác

Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có

sự tham gia của nước)

Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra

khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước

Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồngphân này sang dạng đồng phân khác

Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng

ATP và các chất tương tự

1.3 Enzyme Bromelain

- Bromelain là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quảchuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từgiữa thế kỷ 20 Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970

- Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận

từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa Ở mỗi bộ phận khác nhau thìbromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau

- Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả.Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân

tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide [5]

- Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giảiprotein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của

bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro [1]

1.3.1 Cấu tạo hoá học

- Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác

như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose [1]

- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –

NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu–NH2 là alanine [1]

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

CH OH 2

CH OH 2

CH OH 2

OH OH

Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain

1.3.2 Cấu trúc không gian

- Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cáchsắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp

Gly – Cys – Lys

Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợipolypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S - Phân tử có dạng hình cầu do cócách sắp xếp phức tạp.

- Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếutrong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra,trong phân tử còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không giancủa enzyme

1.3.4 Hoạt tính của bromelain

a Hoạt tính phân giải

- Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ởbromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung[1]

- Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain

Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)

Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín

Casein 7.4 4.0 3.0

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơntrong quả xanh và quả chín

- Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain

Cơ chất Bromelain thânHoạt tính phân giải BAA ( UI/mg)Bromelain quả xanh Bromelian quả chín

- Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao

hơn bromelain thân và quả chín

- Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các

yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinhkhiết

- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúctác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tốkhác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của cácchất hoạt hóa…

tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt

độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ:Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH4)2SO4 thì enzyme cóhoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4 Bromelain đã được tinh sạchmột phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6với nhiệt độ 63ºC Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳthuộc vào cơ chất

tính khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelainmạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương

tự như papain Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide),BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếuhơn papain

 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ : nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều

yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt tínhcủa enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme Ví dụ: Ở dịch chiết quả dứa(pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60ºC thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng nếutăng cao quá thì bromelain sẽ mất hoạt tính Ở 5ºC, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ hoạttính tối đa trên casein trong 24h Ở 55ºC, pH = 6.1 thì enzyme mất 50% hoạt tínhtrong vòng 20 phút

enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Chẳng hạn muốithuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãmtuỳ thuộc vào nồng độ của muối

CHƯƠNG 2

NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN

- Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triểnmạnh mẽ trên qui mô công nghiệp Thực tế đã có hàng ngàn chế phẩm enzyme bántrên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độtinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biếnnhư amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…

- Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứngdụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may,thuộc da…

2.1 Ứng dụng trong y dược

- Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học Đặc biệt là các phương phápđịnh lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩnđoán Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoánenzyme, có nhiệm vụ:

 Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗtrợ của enzyme

 Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật

 Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu

- Ngoài ra còn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn timmạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêuhóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…

- Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng

để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người tacòn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữabệnh

2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang

- Ở Đức, trẻ em bị viêm xoang thường được chữa trị bằng bromelain chiết xuất

từ dứa, và thấy cho kết quả tốt, nó làm giảm thời gian trị bệnh (từ 8 ngày xuống còn

6 ngày)

- Bromelain còn được dùng làm thuốc tấy giun, một loại giun nhỏ thường gặp ở

trẻ em Qua nghiên cứu của Hordegen.P thì bromelain cũng cho kết quả tốt nhưpyratel

2.1.2 Bromelain làm liền sẹo

Enzyme Bromelain có tác dụng làm mau lành các vết thương ở da hay các vếtphỏng Một số thí nghiệm cho thấy, ở chuột bị phỏng, chất chiết xuất bromelain từdứa giúp tiến trình làm sạch một vết thương chỉ sau 4h, lấy đi các vật lạ và mô chết

để không còn trở ngại nào cho quá trình làm lành vết thương

2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp

- Ở Đức, trên thị trường có một sản phẩm chứa 90mg bromelain, 48mg trysin(enzyme nguồn động vật) và 100mg rutin (một flavonoid bảo vệ mao mạch)

- Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm này trong 6 tuần trên 90 người bị hưkhớp háng với diclofenac (100mg/ngày) Và kết quả điều trị tốt như diclofenac vềđau nhức do hư khớp, không có tác dụng phụ

2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch

Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư (phổi, bàng quang,

vú, buồng trứng…) giảm được hiện tượng di căn Đồng thời bromelain còn ức chếquá trình viêm, làm giảm hiện tượng phù nề và tụ huyết, cũng như giảm đau nhức

Do đó, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm giảm đau, khángviêm và kháng sưng Hiệu quả của bromelain là làm giảm lượng prostaglandin trong

cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua mô bằng cáchngăn cản những tiền chất gây viêm

2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn

Bromelain phối hợp với các thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễmkhuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen(theophyllin, ephedrin ) làm tăng tác dụng chống hen Mới đây, một số nghiên cứuđăng trên tạp chí y học Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học

đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen

2.1.6 Bromelain và HIV

Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus gây hội chứng suygiảm miễn dịch (HIV) cần một enzyme hoạt hóa protease (protein-digestingenzymes) để sao chép ngược để cô đọng nhân protein để nhân bội virus Thuốc điềutrị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein-digesting enzymes này gọi là proteaseinhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắc tiền và cũng gây nhiều phảnứng phụ Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khảnăng ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương

tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và cóthể ăn, uống để điều trị HIV/AIDS