Dấu vân tay DNA pot

Dấu vân tay DNA 1. DNA DNA (Deoxyribonucleic acid) là chất hoá học góp phần chính tạo nên nhiễm sắc thể. Một phần nhất định của nhiễm sắc thể quy định cho một tính trạng được gọi là một gen. Về mặt cấu trúc DNA là một chuỗi xoắn kép bao gồm hai sợi đơn xoắn quanh nhau. Mỗi sợi chứa một trình tự các base (còn được gọi là nucleotide). Có bốn loại base là Adenin, Guanin, Cytosine và Thymin. Hai sợi DNA liên kết với nhau qua từng base. Mỗi base chỉ với một base nhất định khác: Adenin (A) chỉ liên kết với Thymine (T) còn Guanin (G) chỉ liên kết với Cytosine (C). Giả sử có một sợi đơn như sau: A-A-C-T-G-A-T-A-G-G-T-C-T-A-G Sợi liên kết với nó sẽ có trình tự: T-T-G-A-C-T-A-T-C-C-A-G-A-T-C Sợi kép DNA sẽ là: T-T-G-A-C-T-A-T-C-C-A-G-A-T-C A-A-C-T-G-A-T-A-G-G-T-C-T-A-G Trình tự DNA được đọc theo một chiều cố định, từ phía đầu (gọi là đầu 5’) tới phía cuối (gọi là đầu 3’). Trong một chuỗi kép hai sợi đơn có chiều ngược nhau . 5' T-T-G-A-C-T-A-T-C-C-A-G-A-T-C 3' 3' A-A-C-T-G-A-T-A-G-G-T-C-T-A-G 5' Cấu trúc hoá học của DNA được minh họa ở hình sau: 2. DNA Fingerprinting là gì? DNA của tất cả mọi sinh vật đều giống nhau. Sự khác nhau duy nhấtgiữa các cá thể trong cùng một loài là trình tự các cặp base. Có hàng tỉ cặp base trong DNA của mỗi cá nhân, do đó trình tự base ở mọi người là khác nhau. Mọi cá thể có thể được nhận dạng duy nhất dựa trên trình tự các cặp base của họ. Tuy nhiên, do có hàng tỷ cặp base nên công việc sẽ vô cùng khó khăn. Thay vào đó các nhà khoa học có thể sử dụng một phương pháp ngắn hơn, đơn giản hơn nhiều dựa vào các mô hình lặp lại trong DNA. Các mô hình lặp lại không biểu diễn “dấu vân tay” của một cá thể nhưng chúng có thể khẳng định được rằng liệu hai mẫu DNA là từ một người, từ hai người có liên quan huyết thống hay từ hai người không có quan hệ gì. Các nhà khoa học sử dụng một số lượng nhỏ các trình tự DNA có sựbiến đổi giữa các cá thể để phân tích những khả năng liên hệ có thể có. 3. DNA Fingerprinting được tiến hành như thế nào ? 3.1. Southern Blot Southern Blot là một phương pháp phân tích các mô hình di truyền trong DNA của mỗi cá nhân. Các bước thực hiện Southern Blot bao gồm: 3.1.1 Tách chiết DNA cần làm rõ từ mẫu như mô, máu, huyết thanh Công việc này có thể tiến hành hoặc theo phương pháp hoá học hoặc theo các biện pháp sử dụng máy móc. 3.1.2 Cắt DNA thành các đoạn nhỏ với kích thước khác nhau bằng cách sử dụng một hay nhiều Enzymgiới hạn. 3.1.3 Sắp xếp các đoạn theo kích thước. Quá trình trong đó các kích thước khác nhau được phân tách gọi là điện di trên gel (thạch). DNA được rót vào các giếng trong gel, sau đó bản gel được đặt vào một điện trường sao cho các giếng có chứa DNA nằm ở phía cực âm. Vì DNA tích điện âm nên khi đặt vào điện trường các đoạn DNA sẽ di chuyển về phía cực dương. Đoạn DNA càng nhỏ thì sẽ di chuyển càng nhanh và do đó sau cùng một thời gian di chuyển thì sẽ đi được một quãng đường xa hơn so với những đoạn lớn hơn. Như vật trên điện di đồ người ta có thể phân tách được các trình tự DNA theo kích thước. 3.1.4 Biến tính DNA làm cho các phân tử DNA từ dạng mạch kép trở thành dạng mạch đơn. Quá trình này có thể thực hiện hoặc bằng nhiệt độ hoặc bằng các hoá chất. 3.1.5 Thấm DNA (Blotting the DNA). Bản gel, trên đó có DNA đã được phân tách theo kích thước, được áp vào màng nitrocellulose rồi nén chặt cho DNA dính lên màng. Lúc này DNA đã sẵn sàng để được phân tích. Để phân tích Southern Blot người ta sử dụng các mồi đánh dấu phóng xạ trong phản ứng lai với DNA nghi vấn. Sau khi mẫu dò đã lai với DNA mạch đơn trên màng nitrocellulose người ta chiếu tia X và khi đó chỉ có những vùng có mẫu dò bám vào mới hiển thị trên phim. Điều này giúp các nhà nghiên cứu nhận diện mô hình di truyền của từng cá nhân. 3.2. Tạo các mẫu dò phóng xạ 3.2.1 Dùng enzym DNA polymerase để tổng hợp mẫu dò phóng xạ. Đầu tiên cho DNA dùng để làm mẫu dò vào ống. 3.2.2 Tạo ra các "vết khía", hay nói cách khác là các chỗ đứt dọc theo chiều dài của DNA cần tạo mẫu dò. Tiếp theo bổ xung các nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, chẳng hạn nucleotide C, đã được đánh dấu phóng xạ. 3.2.3 Cho DNA polymerase vào ống và ngay lập tức chúng bám vào các vết cắt. 3.2.4 DNA polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5' - 3'. Enzym này phá huỷ các liên kết phía trước nó (hoạt tính exonuclease 5' - 3') và thay bằng các nucleotide mới (hoạt tính DNA polymerase). Khi các nucleotide C đánh dấu phóng xạ liên kết với các nucleotide G trên. Kết quả là DNA ban đầu trở thành DNA đánh dấu phóng xạ. 3.2.5 DNA này sau đó được bằng nhiệt độ làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn. Trong hai sợi đơn sẽ có một sợi được đánh dấu phóng xạ còn sợi kia thì không. Sợi đánh dấu phóng xạ lúc này được gọi là mẫu dò và đã sẵn sàng cho công việc tiếp theo. 3.3. Phản ứng lai phân tử 3.3.1 Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. 3.3.2 Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới. 3.3.3 Khi các DNA đã được biến tính, các mẫu dò mà bản chất là các đoạn DNA sợi đơn đánh dấu phóng xạ có thể được sử dụng để xem liệu trên đoạn DNA đó có chứa trình tự bổ xung với trình tự của mẫu dò hay không. DNA và mẫu dò được trộn với nhau trong một túi nhựa cùng dung dịch muối phù hợp. Túi nhựa được lắc trên máy lắc để tạo điều kiện tốt cho các trình tự chuyển động và gặp nhau. Khi các mẫu dò tìm được trình tự phù hợp chúng sẽ liên kết với trình tự đó. 3.3.4 Sự tương hợp giữa mẫu dò và DNA trên thực tế không nhất thiết phải hoàn toàn chính xác. Các trình tự mẫu dò ở những độ sai khác nhất định vẫn có thể bám vào DNA cho dù sự tương hợp không cao. Lẽ dĩ nhiên, độ tương hợp càng thấp thì càng có ít mối liên kết hydro giữa mẫu dò và DNA mạch đơn. Người ta có thể tính toán được khả năng các mẫu dò có độ tương hợp thấp bám vào DNA bằng cách thay đổi nhiệt độ của phản ứng lai hay thay đổi lượng muối trong dung dịch đệm. 4. VNTRs (Các trình tự lặp lại đa dạng về số lượng) Tất cả các sợi DNA đều có những đoạn chứa thông tin di truyền của sinh vật được gọi là các exon và những đoạn dường như không chứa thông tin di truyền gọi là các intron. Mặc dù các intron có vẻ như vô dụng nhưng chúng có chứa các trình tự base lặp lại. Những trình tự này, được gọi là Các trình tự lặp lại đa dạng về số lượng (VNTRs), có thể xuất hiện ở mọi chỗ với kích thước trong khoảng từ 20 đến 100 cặp base. Mỗi người đều có một số lượng các VNTR. Để xác định dạng VNTR đặc trưng của mỗi cá thể người ta tiến hành phản ứng Southern Blot, sau đó sản phẩm từ Southern Blot được đem lai với các mẫu dò trong phản ứng lai phân tử. Mẫu dò được sử dụng là một phiên bản đánh dấu phóng xạ của trình tự lặp lại (VNTR) nghi vấn. Mô hình di truyền có được sau quá trình như vậy thường được gọi là Ỏ Dấu vân tay DNA Õ. Mỗi mô hình VNTR của một cá thể xác định lại được bắt nguồn từ thông tin di truyền nhận được từ bố mẹ của cá thể đó. Có thể là của bố, của mẹ hay là một sự kết hợp từ cả hai nguồn nhưng không bao giờ có trường hợp cá thể không nhận được VNTR của cả bố cũng như mẹ. Hình dưới minh họa các mô hình VNTR của một gia đình. Các băng mầu xanh là của người mẹ còn các băng mầu vàng là của người bố. Mẫu D1 là con gái của hai vợ chồng, mẫu D2 là con của bà Nguyễn và người chồng cũ, mẫu S1 là con trai của hai vợ chồng còn mẫu S2 là con nuôi của họ. Ta thấy ở mẫu D1 và S1 nhận được các băng xanh và vàng với kích thước tương ứng với một số băng của bố và mẹ, mẫu D2 có các băng mầu xanh của người mẹ còn mẫu S2 không có băng nào như vậy. Do các mô hình VNTR được di truyền nên mô hình này ở mỗi người đều ít nhiều mang tính duy nhất. Càng nhiều mẫu dò được sử dụng để phân tích trong phản ứng lai phân tử thì mô hình VNTR (dấu vân tay DNA) càng có tính riêng biệt cũng như càng được cá nhân hoá. 5. Các ứng dụng của DNA Fingerprinting 5.1 Xác định mối quan hệ huyết thống. Bởi vì mỗi người thừa hưởng mô hình VNTR từ bố mẹ nên VNTR có thể được sử dụng để xem xét mối quan hệ huyết thống. Các mô hình này cũng đủ đặc hiệu để có thể tái xây dựng VNTR của bố mẹ nếu biết các mô hình VNTR của con cái. Dĩ nhiên càng có nhiều “Dấu vân tay DNA” của con cái thì càng thuận lợi trong việc xây dựng VNTR của bố mẹ cũng như mức độ tin cậy của mô hình VNTR được xây dựng càng cao. Việc phân tích các mô hình VNTR giữa bố mẹ – con cái đã được áp dụng trong thực tế để giải quyết các trường hợp xác định huyết thống thông thường cũng như các trường hợp phức tạp hơn như xác định quốc tịch, con rơi. 5.2 Nhận dạng tội phạm và khoa học hình sự DNA thu được từ các tế bào máu, tóc, da hay những bằng chứng di truyền khác mà tội phạm bỏ lại ở hiện trường được đem so sánh với các mẫu VNTR từ DNA của những người bị tình nghi, từ đó xác định được người đó phạm tội hay vô can. Các mô hình VNTR cũng rất hữu ích trong việc xác định thân phận nạn nhân trong các trường hợp giết người, hoặc từ DNA bằng chứng được tìm thấy hoặc từ chính cơ thể nạn nhân. 5.3 Xác định đặc trưng cá thể Khái niệm về việc sử dụng Dấu vân tay DNA như một loại mã di truyền có tính pháp lý để nhận nhận dạng các cá nhân đã được thảo luận nhiều, tuy nhiên trong một tương lai dự đoán được thì điều này khó trở thành hiện thực. Công nghệ này đòi hỏi việc tách chiết DNA, lưu giữ trong file và sau đó phân tích hàng triệu mô hình VNTR. Làm như vậy vừa tốn kém vừa phi thực tế. Các phương án khác như chứng minh nhân dân, ảnh, dấu vân tay có nhiều ưu điểm hơn và trên thực tế việc dùng chúng để xác định cá thể là sự lựa chọn hợp lý hơn. 6. Những vấn đề thường gặp Cũng giống như nhiều vấn đề khác trong thế giới khoa học, các khía cạnh của DNA Fingerprinting cũng không được bảo đảm 100%. Thuật ngữ DNA Fingerprinting (Dấu vân tay DNA) nếu chỉ xét theo nghĩa ngôn ngữ là không chính xác. Nếu dùng thuật ngữ này tức là giống như dấu vân tay các mô hình VNTR của một cá thể phải là duy nhất của cá thể đó. Thực ra tất cả những gì mà một mô hình VNTR có thể đưa ra chỉ là khả năng một cá thể nghi vấn có đúng là cá thể (một đứa trẻ, một dấu vết của tội phạm ) đã cung cấp mô hình VNTR hay không. 6.1 Độ tin cậy Khả năng một dấu vân tay DNA thuộc về một cá thể xác định đặc biệt cần độ chính xác cao trong các trường hợp tội phạm, lĩnh vực mà một sai sót nhỏ có thể huỷ hoại cuộc đời của một con người. Việc sử dụng các mô hình VNTR hiếm gặp hay kết hợp nhiều mô hình VNTR để tạo ra một mô hình VNTR cần thiết sẽ làm tăng độ tin cậy trong việc kết luận hai mẫu DNA phù hợp thực sự (tức là loại bỏ được nhiều trường hợp hai mẫu DNA có vẻ giống nhau nhưng thực ra chúng không phải là của một người) hay có mối liên quan (trong các trường hợp xác định huyết thống). 6.2 Di truyền học quần thể Bởi vì các VNTR là kết quả của sự kế thừa di truyền nên chúng không được phân bố chéo qua tất cả các quần thể người. MộtVNTR nhất định do đó không thể có một xác suất xuất hiện ổn định mà nó sẽ thay đổi phụ thuộc vào nền tảng di truyền của mỗi cá thể. Sự khác nhau trong các xác suất xuất hiện của một VNTR nhất định tỏ ra đặc biệt rõ ràng giữa các chủng tộc. Một vài VNTR xuất hiện thường xuyên ở chủng người Tây Ban Nha lại rất hiếm khi xuất hiện ở chủng người Cáp ca hay chủng người Phi-Mỹ. Hiện nay người ta vẫn chưa biết đủ về tần số phân bố VNTR giữa các dân tộc để khẳng định một cách chính xác những nét riêng biệt của chúng. Thành phần di truyền hỗn tạp của một số lượng lớn các cá thể lai tạo ra một bộ các câu hỏi hoàn toàn mới. Các thí nghiệm xa hơn trong lĩnh vực di truyền học quần thể đã và đang bị cản trở rất nhiều do những tranh cãi, những cuộc bút chiến xung quanh ý kiến về việc nhận dạng cá thể dựa vào những bất thường di truyền. 6.3 Những khó khăn về ký thuật Xác suất xảy ra những sai sót trong các quá trình lai phân tử cũng như bắt cặp với mẫu dò cần phải được làm sáng tỏ. Lẽ dĩ nhiên các sai sót không được chấp nhận. Tất cả mọi người đều cho rằng một người vô tội không thể bị tống vào tù, một tên tội phạm không được phép nhởn nhơ trên đường phố hay một người mẹ phải được quyền nuôi nấng đứa con của mình. Tất cả những điều như vậy lại phụ thuộc vào người kỹ thuật viên. Nếu anh ta tiến hành thí nghiệm một cách cẩn thận thì mọi việc sẽ tốt đẹp và ngược lại. Giả sử như khi chỉ có một lượng DNA mẫu rất nhỏ thì người kỹ thuật viên phải làm thật thận trọng, hay như trong thí nghiệm có phản ứng nhân gen nếu gen được nhân lên là gen từ tế bào da của người làm thí nghiệm rơi vào thì kết qủa sẽ hoàn toàn sai. Cho đến nay các tiêu chuẩn để khẳng định sự trùng hợp của dấu vân tay DNA, dùng trong phòng thí nghiệm để làm giảm các sai sót, vẫn chưa được soạn thảo nghiêm ngặt và toàn thể. Chính vì điều này nên dấu vân tay DNA cho đến nay vẫn ít nhiều bị xã hội phản đối. . sự trùng hợp của dấu vân tay DNA, dùng trong phòng thí nghiệm để làm giảm các sai sót, vẫn chưa được soạn thảo nghiêm ngặt và toàn thể. Chính vì điều này nên dấu vân tay DNA cho đến nay vẫn. nucleotide mới (hoạt tính DNA polymerase). Khi các nucleotide C đánh dấu phóng xạ liên kết với các nucleotide G trên. Kết quả là DNA ban đầu trở thành DNA đánh dấu phóng xạ. 3.2.5 DNA này sau đó được. khác trong thế giới khoa học, các khía cạnh của DNA Fingerprinting cũng không được bảo đảm 100%. Thuật ngữ DNA Fingerprinting (Dấu vân tay DNA) nếu chỉ xét theo nghĩa ngôn ngữ là không chính