CHƯƠNG III. KỸ THUẬT VI GHÉP – TẠO CÂY SẠCH BỆNH ppsx

Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  53  CHƯƠNG III. KỸ THUẬT VI GHÉP – TẠO CÂY SẠCH BỆNH Đối với các cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp được khả năng chống chịu của gốc cây hoang dại với ưu điểm năng suất và phẩm chất tốt của mắt ghép. Tuy nhiên khi ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thước mắt ghép khá lớn, nên bệnh virus có thể lây truyền. Để khắc phục những đặc điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng (shoot apex grafting) hay gọi tắt là vi ghép (micrografting) được nghiên cứu rất nhiều và đã đem lại một số kết quả rất khả quan. Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật vi ghép để loại trừ các bệnh do virus trên các lồi cây khác nhau đã được tiến hành. Từ đó đến nay kỹ thuật vi ghép đã được thực hiện trên nhiều lồi khác nhau, nhất là trên cây thân gỗ, cây ăn quả. 1. Ghép cành trong nhân giống truyền thống Kỹ thuật ghép hiện nay đã có nguồn gốc từ thời cổ đại. Các bằng chứng cho thấy rằng người Trung Quốc đã biết ghép cây từ rất sớm, khoảng 1000 năm trước cơng ngun. Aristotle (384 – 322 trước cơng ngun) cũng đã thảo luận về ghép cành trong những tác phẩm của ơng với sự hiểu biết khá rõ ràng. Sau đó, suốt khoảng thời gian thống trị của đế chế La Mã, ghép cành được ứng dụng rất phổ biến, kỹ thuật ghép được mơ tả tỉ mỉ trong những cuốn sách của thời đại đó. Vào thời kỳ Phục hưng (1350 – 1600), kỹ thuật ghép cây bắt đầu có những đổi mới. Một lượng lớn các lồi cây lạ được du nhập vào châu Âu, trồng trong vườn nhà, để duy trì các lồi cây ngoại lai này, những người làm vườn phải sử dụng phương pháp ghép cây. Vào khoảng thế kỷ thứ 16, phương pháp ghép chẻ được sử dụng rộng rãi ở Anh và mọi người nhận ra rằng để ghép thành cơng thì các vùng tượng tầng phải khớp với nhau, nhưng họ vẫn chưa hiểu rõ bản chất của mơ ở vùng tượng tầng. Sau đó, trong cuốn The Nursery Book, xuất bản năm 1891, Liberty Hyde Bailey đã mơ tả và minh hoạ những phương pháp ghép đang được sử dụng phổ biến ở châu Âu và Mỹ lúc bấy giờ. Những phương pháp ghép mà ngày nay chúng ta đang áp dụng chỉ khác biệt rất ít so với những phương pháp mà Bailey đã mơ tả. 1.1. Q trình tạo thành vết ghép Có nhiều nghiên cứu chi tiết đã được tiến hành tập trung về đề tài q trình hàn gắn của vết ghép, chủ yếu trên các đối tượng là cây thân gỗ. Các nghiên cứu cho thấy rằng q trình hàn gắn vết ghép cũng xảy ra tương tự như q trình hàn gắn một vết thương. Q trình hàn gắn vết ghép thường xảy ra theo các trình tự sự kiện như sau: 1.1.1. Các vùng tượng tầng tiếp xúc với nhau Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  54  Giai đoạn này hình thành sự tiếp xúc khởi đầu giữa vùng tượng tầng của cành ghép và gốc ghép dưới những điều kiện mơi trường thích hợp. Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng, cần thiết cho hoạt động của tế bào trong giai đoạn này. Thơng thường, nhiệt độ thích hợp cho tế bào tăng trưởng là vào khoảng 18 – 32 o C, tuỳ theo từng lồi. Các tế bào mơ sẹo tạo thành từ vùng tượng tầng là những tế bào mọng nước, có vách mỏng, rất dễ bị mất nước và chết. Vì vậy, cần phải bảo đảm độ ẩm cao cho mơi trường xung quanh vết ghép. Để cho q trình ghép cây thành cơng, điều kiện tiên quyết là vùng tượng tầng của gốc ghép và cành ghép phải khớp với nhau. Trong thực tế, để ghép cho hai vùng tượng tầng khớp với nhau hồn tồn là việc khơng thể thực hiện, mà chỉ cần ghép sao cho khoảng cách giữa các vùng tượng tầng đủ gần để các tế bào mơ sẹo trên cành ghép và gốc ghép có thể kết hợp với nhau. Yếu tố cần thiết cho việc hàn gắn vết ghép xảy ra thành cơng khơng phải là vùng tượng tầng, mà có thể là bất cứ vùng mơ phân sinh nào có khả năng tạo thành mơ sẹo, để từ đó, hình thành được sự liên kết giữa gốc ghép và cành ghép. 1.1.2. Đáp ứng hàn gắn vết thương Đáp ứng hàn gắn vết thương thực chất là việc hình thành những vật chất hoại tử từ các thành phần tế bào và vách tế bào của những tế bào bị tổn thương trên gốc ghép và cành ghép. Trong giai đoạn chuẩn bị tạo thành vết ghép, trên bề mặt vết cắt của cả cành ghép và gốc ghép sẽ có ít nhất là một lớp tế bào bị chết, tạo thành những vật chất hoại tử. Những vật chất hoại tử này sau đó có thể mất đi một phần, hoặc có thể vẫn tiếp tục tồn tại, chứa trong các túi nằm giữa các tế bào nhu mơ sẽ được tạo thành sau đó. 1.1.3. Hình thành cầu nối mơ sẹo Bên dưới lớp tế bào chết là những tế bào sống có tế bào chất đang hoạt động rất mạnh, tích luỹ một lượng lớn các thể lưới của bộ máy Golgi dọc theo bề mặt vết ghép. Những thể lưới này có vai trò bài tiết các chất vào trong khoảng khơng gian giữa các tế bào, giúp làm cho các tế bào nhu mơ gắn chặt với nhau trên bề mặt ghép. Từ các tế bào sống này, trong khoảng từ 1 – 7 ngày sau khi ghép, các tế bào nhu mơ mới (mơ sẹo) bắt đầu sinh sơi nảy nở trên cả cành ghép và gốc ghép, từ nhu mơ của mạch libe và những phần chưa trưởng thành của mạch mộc. Vùng tượng tầng thật ra có vai trò rất nhỏ trong giai đoạn phát triển đầu tiên này của mơ sẹo. Trong q trình hình thành cầu nối mơ sẹo, phần lớn mơ sẹo đều do gốc ghép tạo ra. Các tế bào nhu mơ này có chứa các mơ sẹo xốp, sẽ xâm nhập vào trong lớp hoại tử mỏng khoảng 2 – 3 ngày, sau đó sẽ dần lấp đầy khoảng trống Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  55  giữa gốc ghép và cành ghép, tạo thành một mối liên kết chặt chẽ, cho phép trao đổi nước và chất dinh dưỡng giữa gốc ghép và cành ghép. Trong một thời gian ngắn sau đó, giữa các mơ sẹo do gốc ghép và cành ghép sẽ xuất hiện một lớp màu nâu chứa vật liệu hoại tử của các tế bào chết và tổn thương. Tuy nhiên sau đó, các vật liệu hoại tử này sẽ dần dần được tái hấp thu và biến mất. 1.1.4. Hình thành vùng tượng tầng mới Tại vùng xung quanh mơ sẹo mới hình thành, q trình biệt hố thành các tế bào tượng tầng mới sẽ bắt đầu vào khoảng 2 – 3 tuần sau khi ghép, khởi phát từ các tế bào nhu mơ tiếp giáp với các tế bào tượng tầng của gốc ghép và cành ghép. Q trình hình thành tượng tầng này sẽ tiếp tục tiến sâu vào bên trong khối mơ sẹo, xun qua cầu nối mơ sẹo, đến khi tạo thành vùng tượng tầng kết nối gốc ghép và cành ghép. 1.1.5. Hình thành mơ mạch mới Lớp tượng tầng mới được hình thành này sẽ bắt đầu các hoạt tính đặc trưng của nó là hình thành các mơ mạch mới, mạch mộc ở phía bên trong và mạch libe ở phía bên ngồi. Trong q trình hình thành mơ mạch mới dọc theo lớp tượng tầng, dường như các tế bào của gốc ghép tiếp giáp vùng tượng tầng sẽ tác động lên sự biệt hố của các tế bào mơ sẹo ở hai bên vùng tượng tầng. Ví dụ như, các tế bào mạch mộc sẽ hình thành ở nơi mà tượng tầng tiếp xúc với mạch mộc của gốc ghép. Lá phát triển trên cành ghép, khơng phải trên gốc ghép, có tác dụng kích thích mạnh mẽ khả năng biệt hố thành mơ mạch dọc theo bề mặt ghép. Q trình hình thành mạch mộc và mạch libe mới giúp tạo thành các mạch liên kết giữa cành ghép và gốc ghép. Q trình này phải được hồn tất trước khi có nhiều lá mới phát triển trên chồi của cành ghép. Nếu khơng, diện tích bề mặt lá rộng sẽ làm mất nước trên cành ghép và cành ghép sẽ nhanh chóng bị héo hoặc chết. 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình hàn gắn của vết ghép Khi tiến hành ghép, các kết quả thường khơng giống nhau, trong một số trường hợp, tỉ lệ ghép thành cơng rất cao, trong khi trong các trường hợp khác lại thất bại. Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến q trình hàn gắn vết ghép: 1.2.1. Tính khơng tương hợp Một trong những triệu chứng của tính khơng tương hợp giữa các cây ghép có họ hàng xa với nhau là cây ghép phát triển khơng hồn chỉnh hoặc tỉ lệ ghép thành cơng rất thấp. Tuy nhiên, các cây bị xem là khơng tương hợp với nhau, đơi Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  56  khi ban đầu cũng có thể tạo thành vết ghép, nhưng sau đó, vết ghép sẽ dần dần bị tách rời, cây ghép khơng thể phát triển và chết. 1.2.2. Loại cây Một số cây khó ghép hơn nhiều so với những loại cây khác, ngay cả khi khơng có hiện tượng khơng tương hợp, ví dụ như các cây hồ đào, cây sồi. Tuy nhiên, một khi ghép thành cơng các cây này thì vết ghép sẽ kết nối rất tốt và cây sẽ tăng trưởng rất nhanh. Một trường hợp rất lạ, khi ghép cây đào lên một số cây khác như cây mận và cây hạnh nhân thì kết quả thành cơng lại cao hơn khi ghép trở lại trên lên chính cây đào. Các cây dễ ghép như cây táo, sẽ tạo thành một loại keo vết thương phủ kín các mơ mạch mộc khi tiến hành ghép, vì thế bảo vệ các mơ khỏi bị mất nước q nhiều và chết. Ngược lại, đối với một số cây khó ghép như cây hồ đào, q trình tạo thành keo vết thương diễn ra rất chậm và sẽ làm các mơ ở vùng ghép bị mất nước và chết. Sự khác biệt về khả năng ghép của các lồi cây này có thể liên quan đến khả năng tạo thành mơ sẹo, một yếu tố vốn rất cần thiết cho q trình hàn gắn vết ghép. 1.2.3. Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và oxy trong và sau khi ghép Nhiệt độ Nhiệt độ có tác động rõ ràng lên q trình tạo thành mơ sẹo. Ở các cây táo ghép, khơng có hoặc có rất ít mơ sẹo hình thành khi nhiệt độ thấp hơn 0°C hoặc cao hơn 40°C. Ở nhiệt độ vào khoảng 4°C, mơ sẹo phát triển rất yếu và khi nhiệt độ trên 32°C, q trình hình thành mơ sẹo diễn ra rất chậm. Khi nhiệt độ tăng lên, các tế bào sẽ bị tổn thương ngày càng nghiêm trọng và cuối cùng tế bào sẽ chết khi nhiệt độ lên đến 40°C. Tuy nhiên, trong khoảng 4 – 32°C, tốc độ tạo mơ sẹo gia tăng rất nhanh, tuyến tính với nhiệt độ. Khi tiến hành ghép ở cây nho, nhiệt độ tối ưu là trong khoảng 24 – 27°C, khi nhiệt độ trên 29°C sẽ kích thích hình thành nhiều mơ sẹo dạng mềm, dễ bị tổn thương trong q trình trồng. Ở nhiệt độ dưới 20°C, q trình hình thành mơ sẹo sẽ xảy ra chậm lại và khi ở dưới 15°C thì hầu như sẽ ngừng hẳn lại. Độ ẩm Các tế bào nhu mơ, trong đó có chứa các mơ sẹo, là những tế bào có vách mỏng, yếu ớt, khơng có khả năng chống lại sự mất nước, vì thế, nếu ở trong điều kiện độ ẩm khơng khí thấp q lâu thì chắc chắn các tế bào này sẽ chết. Độ ẩm khơng khí thấp sẽ ức chế q trình hình thành mơ sẹo, tỉ lệ tế bào bị mất nước sẽ gia tăng khi độ ẩm khơng khí hạ thấp. Trên thực tế, chỉ cần một lớp nước mỏng Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  57  trên bề mặt mơ sẹo sẽ có lợi cho q trình hình thành mơ sẹo hơn là ln duy trì độ ẩm tương đối của khơng khí ở mức 100%. Nếu các mơ ở vết ghép khơng được đảm bảo đủ độ ẩm thì rất khó ghép thành cơng. Hầu hết các cây, khi tiến hành ghép đều cần phủ một lớp sáp che kín vết ghép để duy trì độ ẩm tự nhiên của mơ. Gốc ghép khơng cần phủ sáp, mà chỉ cần bọc trong than bùn hoặc mạt cưa ẩm để giữ đủ độ ẩm và độ thống khí trong suốt thời gian hình thành mơ sẹo. Oxy Oxy cũng là một yếu tố cần thiết cho q trình hình thành mơ sẹo. Các tế bào tăng trưởng và phân chia nhanh thì hoạt động hơ hấp sẽ diễn ra mạnh, mà q trình hơ hấp lại cần có oxy. Một số cây chỉ cần hàm lượng oxy thấp cũng đủ cung cấp cho q trình tăng trưởng tế bào, ngược lại cũng có một số cây cần nhiều oxy cho q trình tạo mơ sẹo. Đối với các cây này, khơng nên phủ sáp che kín vết ghép, mà chỉ cần đặt trong mơi trường có độ ẩm cao. Phủ sáp sẽ ngăn cản sự trao đổi khơng khí, khơng cung cấp đủ lượng oxy cần thiết, ức chế q trình hình thành mơ sẹo. Trường hợp này có thể thấy ở cây nho, thơng thường khi ghép nho khơng nên sử dụng sáp hoặc các vật liệu khơng thống khí để bao phủ vết ghép trong suốt khoảng thời gian mơ sẹo hình thành. 1.2.4. Kỹ thuật ghép Đơi khi kỹ thuật ghép tiến hành khơng tốt, chỉ có một phần nhỏ vùng tượng tầng của cành ghép và gốc ghép tiếp xúc với nhau. Q trình hàn gắn vết ghép vẫn xảy ra, cành ghép bắt đầu tăng trưởng. Tuy nhiên, khi diện tích bề mặt lá gia tăng, hoạt động hơ hấp sẽ tăng mạnh hơn, cành ghép sẽ khơng được cung cấp đủ nước và cành ghép sẽ chết. Một số sai sót khác khi ghép như phủ sáp khơng kín, vết cắt khơng phẳng, hoặc dùng các chồi bị khơ, mất nước cũng làm cho q trình ghép bị thất bại. 1.3. Những hạn chế khi ghép Một trong những u cầu cần thiết để tạo thành vết ghép hồn chỉnh là các mơ tạo thành mơ sẹo ở gần vùng tượng tầng phải khớp với nhau, chính vì vậy, ghép cây thường chỉ được ứng dụng hạn chế cho các cây hai lá mầm thuộc ngành hạt kín và các cây hạt trần. Cả hai loại thực vật này đều có vùng tượng tầng nằm giữa mạch libe và mạch mộc. Đối với các cây một lá mầm thuộc ngành hạt kín, vốn khơng có vùng tượng tầng, việc ghép cây rất khó, với tỉ lệ thành cơng rất thấp. Trước khi tiến hành ghép, cần xác định xem các cây có khả năng kết hợp với nhau, tạo thành một cây hồn chỉnh vĩnh viễn hay khơng. Khơng có một quy luật rõ ràng nào giúp xác định chính xác kết quả ghép, ngoại trừ ngun tắc: “các Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  58  cây có mối liên hệ về mặt thực vật học càng gần thì cơ hội ghép thành cơng càng cao”. Ghép cùng một giống: Cành ghép có thể ghép được trở lại trên cây mà chúng ta đã thu nhận nó và chồi lấy từ cây của một giống có thể ghép thành cơng lên cây khác của cùng giống đó. Ví dụ, chồi lấy từ cây đào „Elberta‟ có thể ghép thành cơng lên bất kỳ cây đào „Elberta‟ nào khác trên thế giới. Ghép giữa các giống của cùng một lồi: Những giống cây ăn trái và cây quả hạch khác nhau thuộc cùng một lồi hầu như ln ln ghép được với nhau mà khơng gặp khó khăn gì, và có thể tạo thành một cây hồn chỉnh. Tuy nhiên, đối với một số lồi cây lá kim, đặc biệt là Pseudotsuga menziesii, nảy sinh vấn đề về tính khơng tương hợp khi ghép lên một cây khác thuộc cùng một lồi, như trường hợp ghép các giống khác nhau của P. menziesii lên gốc ghép P. menziesii. Ghép giữa các lồi của cùng một chi: Các cây khác lồi, nhưng thuộc cùng một chi, có thể ghép thành cơng trong nhiều trường hợp, nhưng cũng có trường hợp ghép khơng thành cơng. Ví dụ khi ghép giữa các lồi thuộc chi Citrus, hầu hết các trường hợp đều thành cơng và được ứng dụng rộng rãi trong thương mại. Cây hạnh nhân (Prunus amygdalus), cây mơ (Prunus armeniaca), cây mận châu Âu (Prunus domestica) và cây mận Nhật Bản (Prunus salicina) là những thực vật khác lồi, đều có thể ghép thành cơng lên gốc ghép là cây đào (Prunus persica), cũng là một cây khác lồi. Tuy nhiên, cây hạnh nhân và cây mơ thuộc cùng một chi nhưng lại khơng thể ghép với nhau thành cơng. Vì vậy, tính tương hợp giữa các lồi khác nhau trong cùng một chi phụ thuộc vào khả năng kết hợp kiểu di truyền của từng cặp gốc ghép và cành ghép riêng biệt. Ghép xi giữa các lồi khác nhau thành cơng khơng có nghĩa là ghép ngược lại lúc nào cũng thành cơng. Ví dụ như trường hợp ghép cây mận „Marianna‟ (Prunus cerasifera × P. munsoniana) lên gốc ghép cây đào (Prunus persica) sẽ tạo thành một cây ghép phát triển hồn chỉnh. Nhưng nếu ghép ngược lại, chồi cây mận „Marianna‟ lên gốc cây đào thì cây có thể bị chết, hoặc nếu sống thì cây ghép cũng khơng phát triển bình thường. Ghép giữa các chi của cùng một họ: Khi các cây thuộc cùng một họ nhưng khác chi thì cơ hội ghép thành cơng sẽ khó hơn. Có những trường hợp ghép thành cơng và có thể được ứng dụng rộng rãi, nhưng hầu hết các trường hợp ghép khác chi thường cho kết quả khơng thành cơng. Cây cam ba lá (Poncirus trifoliata) được sử dụng rộng rãi làm gốc ghép cho cây cam (Citrus sinensis), là một cây khác chi. Cây mộc lê (Cydinia oblonga) đã được sử dụng từ lâu làm gốc ghép cho cây lê (Pyrus communis). Tuy nhiên, nếu ghép ngược lại, cành mộc lê lên gốc ghép cây lê thì kết quả sẽ khơng thành cơng. Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  59  Ghép giữa các họ: Ghép giữa các cây khác họ thường được xem là một việc khơng khả thi, nhưng vẫn có một số trường hợp thành cơng được cơng bố. Cây cỏ ba lá Melilotus alba (Leguminosae) có thể ghép thành cơng lên cây hoa hướng dương Helianthus annuus (Compositae) bằng cách dùng phương pháp ghép chẻ, cành ghép được chèn vào bên trong nhu mơ lõi của gốc ghép. Cành ghép vẫn tiếp tục phát triển bình thường trong hơn 5 tháng sau đó. Tuy có một số trường hợp có thể ghép thành cơng các cây gỗ khác họ với nhau, nhưng sau đó, cây ghép thường khơng thể tiếp tục phát triển bình thường. 1.4. Tính khơng tương hợp (incompatibility) Khả năng mà 2 cây có thể ghép với nhau tạo thành một cây phát triển bình thường gọi là tính tương hợp (compatibility). Trường hợp ngược lại gọi là tính khơng tương hợp. Khi cành ghép và gốc ghép có họ hàng gần với nhau thì có thể ghép với nhau dễ dàng và sẽ tăng trưởng như là một cây. Ngược lại, khi cành ghép và gốc ghép khơng có họ hàng với nhau thì hầu như khơng thể kết nối với nhau thành cơng. Các cây ghép khơng tương hợp với nhau sẽ tạo nên những dị tật ở vết ghép. Các dị tật này có thể xác định dễ dàng thơng qua một số triệu chứng bất thường bên ngồi:  Khơng thể ghép thành cơng, hoặc chỉ thành cơng ở tỉ lệ rất thấp.  Xuất hiện hiện tượng vàng lá, khơng lâu sau đó, các lá này sẽ rụng đi. Cây tăng trưởng chậm và yếu ớt.  Hiện tượng chết sớm của cây, cây chỉ sống được một thời gian ngắn sau khi ghép.  Tốc độ tăng trưởng của cành ghép và gốc ghép có sự khác biệt rõ ràng.  Có hiện tượng tăng trưởng vượt mức ở phía trên, phía dưới hoặc ngay tại vị trí ghép.  Gốc ghép và cành ghép khơng kết nối với nhau tại vị trí ghép. Một số trường hợp, xuất hiện một vài triệu chứng trong số các triệu chứng trên, nhưng khơng phải là do 2 cây khơng tương hợp với nhau. Một số triệu chứng có thể xuất hiện do các điều kiện mơi trường khơng thích hợp, như thiếu nước hoặc các chất dinh dưỡng thiết yếu, do cây bị bệnh, bị cơn trùng tấn cơng hoặc do phương pháp ghép khơng tốt. 2. Vi ghép in vitro 2.1. Khái niệm vi ghép Về ngun tắc, vi ghép là kỹ thuật phối hợp giữa ghép và ni cấy đỉnh sinh trưởng nhưng thơng qua sự dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép. Mắt ghép là đỉnh sinh trưởng có kích thước nhỏ 0,2 – 0,5mm được tách ra từ các chồi non tạo Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  60  thành trong ni cấy in vitro từ cành cây mẹ trưởng thành. Gốc ghép thường là những cây con mới nảy mầm, nhưng cũng có thể sử dụng các cành giâm có rễ hoặc các đoạn chồi thu được nhờ vi nhân giống. Khi tiến hành kỹ thuật vi ghép, trên gốc ghép và đỉnh sinh trưởng mắt ghép, người ta tạo vết ghép tại vùng tượng tầng, là nơi tế bào phân chia mạnh, để khi tiến hành ghép, áp 2 phần này lại với nhau sẽ có sự tiếp hợp và tạo ra cây ghép. Tồn bộ cây ghép được ni trong điều kiện vơ trùng, những cây ghép thu được bằng phương pháp này hồn tồn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép; đồng thời tận dụng các đặc tính của gốc ghép hoang dại như tính kháng bệnh và khả năng thích ứng với mơi trường địa phương. Kỹ thuật vi ghép sẽ góp phần tạo ra một số lượng lớn cây giống hồn tồn sạch bệnh dùng làm ngun liệu cho sản xuất đại trà. Ngồi ra, vi ghép còn được dùng để nghiên cứu tính khơng tương hợp giữa chồi ghép và gốc ghép, và các khía cạnh về mơ học và sinh lý học của kỹ thuật ghép. 2.2. Q trình hình thành vết ghép Esrtrada-Luna và cộng sự (2002) đã tiến hành nghiên cứu về mặt giải phẫu hình thái của q trình hình thành vết ghép ở cây xương rồng (Opuntia spp.). Ơng nhận thấy rằng về mặt mơ học, q trình hình thành vết ghép khi tiến hành vi ghép cũng diễn ra tương tự như tất cả các q trình hàn gắn vết ghép bình thường. Kết quả quan sát của ơng cho thấy q trình hình thành vết ghép phát triển qua 5 giai đoạn:  Q trình phát triển của lớp hoại tử  Q trình nhân nhanh của cầu nối mơ sẹo tại bề mặt ghép  Q trình biệt hố tạo thành mơ tượng tầng mới  Q trình phục hồi lại các mơ mạch mới  Q trình phục hồi tính liên tục của biểu bì tại vị trí vết ghép Trong suốt những giờ đầu tiên sau khi gốc ghép và chồi ghép tiếp xúc với nhau, khơng có bằng chứng nào cho thấy tượng tầng có hoạt động. Tuy nhiên, sau khi ghép 24 giờ, quan sát thấy có sự hình thành của lớp hoại tử trên cả gốc ghép và chồi ghép. Lớp hoại tử này là một lớp khác biệt tạo thành từ những tế bào chết và có màu sậm. Bằng chứng đầu tiên về sự phân chia tế bào chính là sự phát triển của cầu nối mơ sẹo tại bề mặt tiếp xúc giữa chồi ghép và gốc ghép, đây là q trình khởi phát của giai đoạn thứ hai hình thành vết ghép. Q trình này quan sát thấy ở tất cả các cây ghép trong khoảng thời gian từ ngày thứ nhất đến ngày thứ tư sau khi ghép. Những vùng tế bào nhu mơ mềm nằm cạnh lớp hoại tử bắt đầu phân chia tại nhiều vị trí khác nhau dọc theo bề mặt bên trong của mơ bị tổn thương, trên cả gốc ghép và chồi ghép. Tại một số vùng, q trình nhân mơ Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  61  sẹo xảy ra dựa trên q trình phân chia tế bào, tuy nhiên, cũng có thể quan sát thấy có những khối tế bào vơ tổ chức. Sau vài ngày, các tế bào nhu mơ mềm của phần vỏ và phần lõi sẽ phân chia để tạo thành một khối mơ sẹo nhiều lớp ở phía trên và phía dưới vùng hoại tử, tạo thành một cầu nối vật lý liên kết giữa chồi ghép và gốc ghép. Trong suốt giai đoạn sớm của q trình hình thành cầu nối mơ sẹo, các tế bào phân chia thường dài và tương đối nhỏ so với các tế bào nhu mơ đặc trưng ở các mơ gốc ghép và chồi ghép. Tuy nhiên, vào khoảng ngày thứ 28, khi mơ sẹo phân chia lấp đầy các khoảng trống trên vùng ghép, các tế bào này tăng trưởng và có hình thái giống với các tế bào nhu mơ bình thường. Vào khoảng ngày thứ 12, tế bào hoạt động rất mạnh mẽ trên bề mặt ghép của cả gốc ghép và chồi ghép, thể hiện ở q trình nhân mơ sẹo dọc theo vết ghép. Trong q trình tăng trưởng, các tế bào mơ sẹo này sẽ tái hấp thu các vật chất hoại tử, sau đó, vùng hoại tử này sẽ biến mất. Q trình hàn gắn vết thương của mơ tượng tầng dọc theo cầu nối mơ sẹo (giai đoạn thứ ba) cũng bắt đầu sau ngày thứ 12. Q trình biệt hố tế bào sẽ bắt đầu ở các tế bào nhu mơ nằm gần các mơ mạch bị tổn thương. Các tế bào đã tạo thành trước đó bắt đầu kéo dài, hướng về phía cầu nối mơ sẹo. Ở giai đoạn này có thể quan sát thấy các tế bào với vách thứ cấp dày, các tế bào này đều tăng trưởng định hướng theo chiều dọc trên cả gốc ghép và chồi ghép. Khoảng 28 ngày sau khi ghép có thể xác định được khả năng tương hợp hay khơng tương hợp của chồi ghép và gốc ghép, đồng thời, có thể nhận thấy chức năng của vết ghép vì lúc này chồi ghép bắt đầu tăng trưởng mạnh mẽ. Các yếu tố mạch mới, gồm có các ống mạch và các tế bào ống, bắt đầu kết hợp với nhau dọc theo bề mặt ghép. Trong một số trường hợp, các mạch mộc và mạch libe mới hình thành có thể sẽ tái định hướng theo chiều dọc, nhưng q trình này khơng làm ảnh hưởng vết ghép vì mơ mạch đã đạt được tính liên tục. Ở giai đoạn này, lớp hoại tử chỉ còn là một lớp rất mỏng dọc theo vết ghép. Lớp biểu bì của chồi ghép và gốc ghép sẽ bao phủ hồn tồn vùng ghép trong khoảng 40 ngày sau khi ghép. 2.3. Nghiên cứu về vi ghép Lần đầu tiên, Murashige và cộng sự (1972) đã vi ghép thành cơng đỉnh sinh trưởng có 4 – 6 phát thể lá trên cây mầm từ hạt dùng làm gốc ghép. Tỉ lệ thành cơng ghi nhận được là từ 5 – 40% và tạo được cây con sạch virus Exocortis. Navarro và cộng sự (1975) ghép chồi ngọn nhỏ hơn với 3 sơ khởi lá của giống Temple tanger lên gốc ghép là cây Troyer cistrange đạt tỉ lệ thành cơng từ 30 – 50%. Sau đó các cây ghép được đưa ra mơi trường đất, tỉ lệ cây sống đạt đến 95%. Trên thân cây mầm dùng làm gốc ghép, ơng cắt rễ còn dài 4 – 6 cm, thân Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  62  được cắt ngang cách lá mầm 1,5 cm. Sau đó ơng rạch trên thân cây vết cắt hình chữ T, chồi ghép được ni trong điều kiện vơ trùng có chiều dài từ 0,1 – 0,2 mm được đưa vào vị trí ghép. Navarro đã thử nghiệm những vị trí ghép khác nhau và theo các kết quả thí nghiệm của ơng, vị trí “e” (Hình 6.1) là vị trí tốt nhất cho sự phát triển của mắt ghép, cũng như dễ dàng cho việc quan sát sự phát triển của mắt ghép. Có thể dùng 1 vòng kiềng để giữ mắt ghép dính trên gốc ghép hoặc dùng mơi trường agar làm chất kết dính tạm thời bằng cách dùng mũi dao lấy một ít mơi trường ni cấy để phết lên vị trí ghép. Sau khi ghép, cây được đưa vào mơi trường ni cấy trong ống nghiệm 25  150 mm chứa 25ml dung dịch mơi trường MS lỏng bổ sung 2 mg/l BA. Dùng một tờ giấy thấm đục lỗ ở giữa để giữ gốc ghép khơng chạm vào thành ống nghiệm, giữ ở 27 0 C, 2000 lux/16h/1ngày. Sau 1 – 2 ngày, nếu mắt ghép còn xanh là tốt. Tiếp tục theo dõi trong 1 tuần, nếu thấy vết ghép liền và đỉnh sinh trưởng vẫn xanh, có dấu hiệu phát triển là ghép đã đạt u cầu. Cây vi ghép sau 6 tuần có thể chuyển ra vườn ươm, đạt tỉ lệ sống sót 95%. Mneney và Mantell (2001) vi ghép chồi đỉnh của các cây điều (Anacardium occidentale L.) trồng trong nhà kính và trồng trong vườn lên gốc ghép là cây con in vitro theo 2 phương pháp: ghép bên và ghép trên đỉnh. Ơng nhận thấy các phương pháp ghép khác nhau có tác động đến tỉ lệ ghép thành cơng, phương pháp ghép bên cho tỉ lệ thành cơng cao hơn. Các vị trí ghép khác nhau trên gốc ghép cũng được khảo sát. Kết quả cho thấy vị trí ghép khơng ảnh hưởng nhiều đến tỉ lệ ghép thành cơng, nhưng sau đó, tốc độ tăng trưởng của chồi ghép có sự khác biệt đáng kể. Ghép trên trục hạ diệp chồi ghép sẽ tăng trưởng khoẻ hơn, sau 7 tuần, chiều cao của chồi lớn gấp đơi so với ghép trên trục thượng diệp. Kết quả khảo sát tác động của các loại chồi ghép Hình 6.1. Các vị trí có thể đưa đỉnh sinh trưởng vào gốc ghép. [...]...Công nghệ sinh học thực vật Chương 6 Kỹ thuật vi ghép cho thấy vị trí ban đầu của chồi ghép trên cây mẹ (chồi bên hoặc chồi đỉnh) khơng có tác động lớn đến tỉ lệ ghép thành cơng Onay và cộng sự (2003) đã khảo sát các phương pháp vi ghép in vitro khác nhau ở cây hồ trăn Gốc ghép là các phơi hợp tử được cho nảy mầm in vitro, chồi ghép là các chồi đỉnh thu nhận từ cây hồ trăn trưởng thành Ơng đã xem... của nhiều yếu tố khác nhau lên tỉ lệ ghép thành cơng như kích thước chồi ghép, phương pháp ghép, mơi trường ni cấy và thời gian lấy mẫu Kết quả cho thấy phương pháp ghép chẻ có tỉ lệ ghép thành cơng cao nhất và dễ tiến hành nhất Khi khảo sát ảnh hưởng của kích thước chồi ghép, ơng nhận thấy tỉ lệ ghép thành cơng cao khi dùng chồi ghép có chiều dài 2 – 4 mm và 4 – 6 mm, tái sinh từ chồi đỉnh Khi ni... từ chồi đỉnh Khi ni cấy trên mơi trường khơng bổ sung chất điều hồ sinh trưởng, chồi phát triển chậm và các chồi nách khơng phát triển Tỉ lệ ghép thành cơng cao nhất trên mơi trường gieo hạt, có bổ sung 2,22 M BA, 200 mg/l Lascorbic acid Các cây con vi ghép in vitro phát triển khoẻ và khơng gặp vấn đề gì khi đưa ra vườn ươm  63  . Công nghệ sinh học thực vật Chương 6. Kỹ thuật vi ghép  53  CHƯƠNG III. KỸ THUẬT VI GHÉP – TẠO CÂY SẠCH BỆNH Đối với các cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu. thiết yếu, do cây bị bệnh, bị cơn trùng tấn cơng hoặc do phương pháp ghép khơng tốt. 2. Vi ghép in vitro 2.1. Khái niệm vi ghép Về ngun tắc, vi ghép là kỹ thuật phối hợp giữa ghép và ni cấy. dụng kỹ thuật vi ghép để loại trừ các bệnh do virus trên các lồi cây khác nhau đã được tiến hành. Từ đó đến nay kỹ thuật vi ghép đã được thực hiện trên nhiều lồi khác nhau, nhất là trên cây