Collagen thu nhận và ứng dụng

Collagen thu nhận và ứng dụng

MỤC LỤC Tổng quan collagen Các loại collagen cấu tạo chúng Thành phần acid amin có collagen Tính chất collagen 4.1 Tác dụng với nước 4.2 Tác dụng với acid, kiềm 10 4.3 Các tính chất khác collagen .11 4.3.1 Khả tạo nhũ tương 11 4.3.2 Khả hòa tan 11 4.3.3 Sự biến tính 11 4.3.4 Tính kị nước 12 4.3.5 Tính chất dung dịch keo 12 4.3.6 Tính chất điện ly lưỡng tính 12 Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen .12 Quy trình cơng nghệ trích ly collagen từ da cá tra 13 6.1 Phương pháp hóa học .13 6.2 Phương pháp dùng enzyme 16 Các ứng dụng collagen .18 7.1 Trong công nghiệp thực phẩm .18 7.2 Trong mỹ phẩm 19 7.3 Trong y học dược phẩm 19 Thành tựu 21 8.1 Nghiên cứu trích ly collagen enzyme collagenase kết hợp với acid .21 8.1.1 Mở đầu 21 8.1.2 Cách tiến hành 21 8.1.3 Kết 23 8.1.4 Kết luận 24 8.2 Nghiên cứu ứng dụng collagen lĩnh vực y khoa: Tổng hợp polymercollagen hydrogel để làm chất tải thuốc dùng công nghệ mô 25 8.2.1 Mở đầu 25 8.2.2 Giới thiệu 25 8.2.3 Tổng quan .26 8.2.4 Tổng hợp hydrogel 29 8.2.5 Kết 31 8.2.6 Bàn luận 42 8.2.7 Kết luận 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC HÌNH Hình 1-1: Cấu trúc lớp hạ bì da Hình 1-2: Các liên kết sợi collagen Hình 2-1: Cấu trúc phân tử collagen .7 Hình 2-2: Trật tự xếp acid amin collagen Hình 2-3: Từng bậc cấu trúc chuỗi collagen Hình 2-4: Tổ chức bó sợi collagen Hình 6-1: Quy trình chiết collagen acid acetic 14 Hình 6-2: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I da heo collagen da cá (Điện di 5% gel chứa urea 3,5M) (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu 15 Hình 6-3: Quy trình chiết collagen pepsin 16 Hình 7-1: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, trộn chung với đậu hủ hay natto dùng bữa ăn phụ nữ Nhật .18 Hình 7-2: Tóc bị hư tổn phục hồi sau sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate 19 Hình 7-3: Collagen áp dụng việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng trước sử dụng collagen, (b): sau ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng) .20 Hình 7-4: Collagen hydrolysate mảnh bọt biển sử dụng nha khoa .21 Hình 8-1: Cấu trúc polymer PEO-PPO-PEO 23 Hình 8-2: Quá trình tạo micelle .24 Hình 8-3: Lược đồ phương pháp chế tạo hydrogel tổng hợp 26 Hình 8-4: Mẫu hydrogel C-F108 (1%) vị trí khác .26 Hình 8-5: Hình ảnh SEM cấu trúc A) Collagen gel; B) C-L103 (1%); C) C-L103 (3%); D) C-L103 (5%); E) C-F108 (1%); F) C-F108 (3%); G) C-F108 (5%) nồng độ collagen 3,2 mg/ml (độ phóng đại: 2500) 29 Hình 8-6: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 30%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 15% 30 Hình 8-7: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 15% 30 Hình 8-8: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 30% 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10% 31 Hình 8-9: Tế bào K562 A) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) B) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) nồng độ khác đo cách bổ sung Alamar blue Giá trị trung bình sử dụng đồ thị Thanh sai số thể sai số chuẩn giá trị trung bình (n = 3) 31 Hình 8-10: A) Tế bào K562 ma trận hydrogel C-F108 (1%) sau tuần B) Hình ảnh SEM tế bào K562 C-F108 (1%) sau liên kết với glutaraldehyde (2%) (độ phóng đại 2500) .32 Hình 8-11: Hình ảnh điện di BSA tinh khiết BSA-PPG diglycidyl ether liên kết dọc môi trường thời điểm khác 32 Hình 8-12: Hình ảnh điện di collagen tinh khiết collagen diglycidyl ether môi trường thời điểm khác 33 Hình 8-13: Hình ảnh SEM collagne tinh khiết độ phóng đại khác .33 Hình 8-14: Hình ảnh SEM PG-COLc20 độ phóng đại khác 34 Hình 8-15: A) Đường cong TGA PPG diglycidyl ether tinh khiết; B) Đường cong TGA gel tổng hợp 34 Hình 8-16: Đồ thị DSC PPG diglycidyl ether tinh khiết; Tg = -76,7oC 34 Hình 8-17: Đường cong nhiệt collagen tinh khiết,, PG-COLc5 PG-COLc20 A) Quét lần B) Quét lần .35 Hình 8-18: Đường NMR A) PPG diglycidyl ether B) Collagen tinh khiết C) Gel tổng hợp .35 Hình 8-19: Đồ thị thể liên hệ nồng độ amin với độ hấp thu tia UV 36 Hình 8-20: Độ độc collagen-PPG gel lên nguyên bào sợi, đo phần trăm tế bào sống, 72 sau cấy 37 Hình 8-21: Nguyên bào sợi (mũi tên) A) PG-COLc20 b) blank glass coverslip C) bottom well plastic ngày kính hiển vi quang học, Độ phóng đại × 10 38 Hình 8-22: Hình ảnh SEM nguyên bào sợi A) glass coverslip B) PG-COLc20 độ phóng đại khác 38 Hình 8-23: Minh họa tạo liên kết dọc collagen với diglycidyl ether 40 Hình 8-24: Cơ chế phản ứng nhóm epoxy với nhóm-amino lysine pH12 41 Hình 8-25: A) Bề mặt collagen-PPG diglycidyl B) Bề mặt collagen tinh khiết .43 Hình 8-26: Hình ảnh điện di mẫu collagen từ da cá hồi điều kiện khử không khử Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất acid acetic, collagenase từ CNA1 CNL3 điều kiện khử .46 DANH MỤC BẢNG Bảng 3-1: Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide Bảng 8-1: Các loại polymer dùng để tổng hợp hydrogel .23 Bảng 8-2: Phương pháp chuẩn bị mẫu hydrogel 27 Bảng 8-3: Vật liệ sử dụng để sản xuất hydrogel tổng hợp phương pháp thủy phân .27 Bảng 8-4: A) Tỉ lệ BSA & PPG mơi trường có pH khác B) Tỉ lệ Vitrogen 100 & PPG NaOH pH khác 27 Bảng 8-5: Tỉ lệ tế bào sống hydrogel C-F108 nồng độ polymer khác 32 Bảng 8-6: Độ hấp thu tia UV hỗn hợp BSA nồng độ khác 36 Bảng 8-7: Số lượng nhóm amin tự dung dịch tổng hợp tỉ lệ polymer khác .36 Bảng 8-8: Phần trăm phát triển tế bào gel tổng hợp so với mẫu chuẩn 37 Bảng 8-9: Số lượng tế bào sống sót sau 24 chất mang khác .37 Bảng 8-10: Góc tiếp xúc với nước mẫu chuẩn lớp màng kết hợp, độ lặp lại n=4 43 Bảng 8-11: Lượng collagen chiết xuất acid collagenase 46 Tổng quan collagen Collagen loại protein cấu trúc thể động vật Nó phân bố phận da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương Collagen loại protein chiếm tới 25% lượng protein thể người, có chức kết nối mơ thể lại với Ví dụ sợi collagen chiếm chủ yếu sợi dây chằng, ảnh hưởng đến khả nén khớp sụn tính linh động mạch máu da Nó coi chất keo dính phận thể người thành khối hồn chỉnh, khơng có collagen thể người phần rời rạc Chỉ riêng điều đủ tầm quan trọng collagen với sống người Trong thành phần da, lớp bì chứa nhiều collagen tạo hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho đặc tính học da sức căng, độ đàn hồi, trì độ ẩm Tùy theo độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da bị lão hóa tổn thương, sợi collagen dần tính đàn hồi săn cấu trúc collagen bị phá vỡ Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da phân bố chủ yếu lớp hạ bì da (hình 1-1) Nó đóng vai trị kết nối tế bào, kích thích q trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm số lượng chất lượng collagen dẫn đến hậu lão hóa thể mà thay đổi da, khuôn mặt dấu hiệu dễ nhận biết nhất: da bị khô, nhăn nheo đường nhăn mảnh khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, đường nét khuôn mặt bị chùng nhão chảy sệ Chính mà collagen đóng vai trò chất quan trọng hàng đầu ngành thẩm mỹ, đặc biệt chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng Hình 1- 1: Cấu trúc lớp hạ bì da Collagen protein có cấu trúc bậc điển hình, đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc tổ hợp theo hướng dọc ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc (hình 1-2) Trong cấu trúc phân tử collagen, tương tác mạch polypeptide làm cho phân tử có vùng kị nước vùng phân cực mang điện tích tạo nên khả háo nước làm trương nở collagen Hình 1-2: Các liên kết sợi collagen Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng phát triển, hàn gắn vết thương, thành phần hoạt hoá tiểu cầu máu hình thành mạch Thêm vào phát triển số bệnh di truyền xác định đột biến cấu trúc gen collagen Những rối loạn trình tổng hợp phân giải collagen ghi lại nguyên nhân nhiều bệnh phức tạp chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường ung thư bệnh có liên quan đến lão hoá Xét mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất gelatine, chất có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác Các loại collagen cấu tạo chúng Collagen tồn nhiều phận thể Đã có 29 loại collagen tìm thấy cơng bố tài liệu khoa học Trên 90% collagen thể loại I, II, III IV  Collagen loại I: có da, gân, mạch máu, quan, xương (thành phần xương)  Collagen loại II: có sụn xương (thành phần sụn)  Collagen loại III: có bắp (thành phần bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I  Collagen loại IV: thành phần cấu tạo màng tế bào  Collagen loại V: có dây chằng, giác mạc, kẽ hở mơ  Collagen loại VI: có gan, thận, màng sụn  Collagen loại VII: có nối liền da biểu bì  Collagen loại VIII: có tế bào màng  Collagen loại IX: có sụn  Collagen loại X: có sụn bị khống hóa phình to  Collagen loại XI: có sụn  Collagen loại XII: có dây chằng, sợi liên kết collagen  Collagen loại XIII: có biểu bì, nang tóc, tế bào gốc móng  Collagen loại XIV: có sợi liên kết collagen  Collagen loại XV: có nhiều mô khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII  Collagen loại XVI: nghiên cứu  Collagen loại XVII: có da  Collagen loại XVIII: có gan  Collagen loại XIX: có mắt, não, tinh hồn, mơ thời kỳ đầu phát triển  Collagen loại XX-XXIX: nghiên cứu Collagen loại I phổ biến thường mô liên kết da, xương, gân Collagen loại II tồn mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc lớn vào độ tuổi động vật, da heo trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ giảm - 10% Những loại colagen khác diện với lượng nhỏ vài quan đặc biệt Về cấu trúc phân tử collagen, phân tử collagen hay gọi tropocollagen cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm Mỗi sợi collagen  cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (alpha peptide) nối với liên kết hydro xoắn lại với giống sợi dây thừng (hình 2-1) Mỗi vịng xoắn có độ dài 3,3 gốc amino acid, chiều cao 2,9 A0 Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn ống từ trái sang phải Ba chuỗi xoắn lại với hình thành cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi triple helix Hình 2- 3: Cấu trúc phân tử collagen Mỗi chuỗi polypeptide collagen cấu tạo từ amino acid theo trật tự, thông thường Gly - Pro - Y, Gly - X – Hyp (hình 2-2) Trong đó, X, Y đơn vị amino acid khác Proline (Pro) hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi Tổng cộng riêng proline, hydroxyproline, glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen Các amino acid cịn lại chiếm 1/2 Glycine đóng vai trò quan trọng cấu trúc sợi siêu xoắn collagen Hình 2-4: Trật tự xếp acid amin collagen Phần lớn collagen mạng lưới ngoại bào tìm thấy dạng sợi, bao gồm sợi mảnh nhỏ Đầu tiên ba sợi collagen xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh sợi hình thành nên ba tropocollagen Sau tropocollagen liên kết với theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril Các collagen fibril bó lại với hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber (hình 2-3, 2-4) Hình 2-5: Từng bậc cấu trúc chuỗi collagen Hình 2- 6: Tổ chức bó sợi collagen Các chuỗi collagen xếp song song theo chiều dọc liên kết với liên kết ngang tạo thành sợi theo chu kỳ định Chúng xếp so le khoảng 67nm có khoảng trống 40nm phân tử liền kề Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có chuỗi xoắn ốc chuyển sang sợi collagen, cung cấp cho mô độ cứng, độ đàn hồi đặc tính học riêng Vì collagen chắc, dai bền Thành phần acid amin có collagen Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline Collagen khơng chứa tryptophan, số protein chứa hydroxylysine Các amino acid xếp chuỗi xoắn ốc theo dãy với phân bố sau: Bảng 3- 1: Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide Trong I amino acid (proline hydroxyproline), X amino acid khác Glycine chiếm gần 1/3 tổng số amino acid phân bố cách đặn vị trí 1/3 xuyên suốt phân tử collagen Do glycine có nhánh phụ nhỏ nên lặp lại cho phép chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với tạo thành đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ phần lõi Trong collagen không chứa tryptophan, cystine loại protein khác, tyrosin, histidin, acid amin chứa lưu huỳnh loại diện không 1%, điều làm cầu nối disulfur (-S-S) cấu trúc collagen xuất ngun nhân cho tính mềm dẻo so với keratin, chứa nhiều hydroxyproline Hydroxyproline acid amin đặc trưng collagen mà loại protein khác khơng có Trong collagen chứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine Tính chất collagen 4.1 Tác dụng với nước Collagen khơng hịa tan nước mà hút nước để nở ra, 100g Collagen khơ hút khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở nước, độ dày tăng lên chừng 25% độ dài tăng lên khơng đáng kể, tổng thể tích phân tử collagen tăng lên – lần Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro liên kết phối trí collagen làm giảm tính vững sợi gelatin từ – lần Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu bắt đầu đứt thành mạch polypeptide tương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên khoảng 60 – 650C collagen hút nước bị phân giải Nhiệt độ phân giải collagen nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao Khi nguyên liệu khử hết chất khống, nhiệt độ phân giải giảm xuống 4.2 Tác dụng với acid, kiềm Collagen tác dụng với acid kiềm, mạch collagen có gốc carboxyl amin Hai gốc định hai tính chất Trong điều kiện có acid tồn tại, ion tác dụng với gốc amin, điện tích carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+ Trong điều kiện có nước, nước tác dụng với nhóm gốc có mang điện kết cấu protide ion Na+ Cl- làm tăng tính hấp phụ nước collagen mơi trường acid kiềm tính trương nở collagen tăng lên Ngồi acid kiềm cịn gây số biến đổi : Cắt đứt mạch muối (liên kết –NH3+ COO-) làm đứt mạch peptide mạch Làm đứt liên kết hydrogen gốc –CO, NH- mạch xung quanh Làm acid amin bị phân hủy giải phóng ammoniac Cùng với biển đổi điểm đẳng điện collagen hạ xuống thấp, acid kiềm phân hủy collagen nhiên theo nghiên cứu nhiều nhà khoa học vơi làm tăng tỷ lệ phân hủy collagen Trong điều kiện thường, thời gian dài làm cho collagen bị phân giải( mức độ phân giải thấp) nhiệt độ tăng độ phân giải tăng lên nhanh chóng Collagen phân giải biến thành gelatin, vào giả thuyết Hofmeister phản ứng tiến hành sau: ... collagen, cho NaCl rắn vào phần dịch chiết đến nồng độ 0,9M Đến collagen thô kết tủa Để thu collagen sạch, tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tan vào acid acetic 0,5M Thẩm tách thu collagen Collagen... học Màng collagen sử dụng cho hàng loạt ứng dụng làm chất bịt kín sinh học cải thiện tính đáp ứng sinh học mơ cấy Collagen sử dụng hệ thống phân hủy sinh học cho loại thu? ??c bao gồm thu? ??c tránh... mạnh Vì collagen dễ dàng tách cho hiệu suất tách chiết cao Các ứng dụng collagen Trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, dược phẩm, collagen thường sử dụng dạng collagen thủy phân Collagen