Collagen thu nhận và ứng dụng

Collagen thu nhận và ứng dụng

MỤC LỤC

1 Tổng quan về collagen 4

2 Các loại collagen và cấu tạo của chúng 6

3 Thành phần các acid amin có trong collagen 9

4 Tính chất của collagen 9

4.1 Tác dụng với nước 9

4.2 Tác dụng với acid, kiềm 10

4.3 Các tính chất khác của collagen 11

4.3.1 Khả năng tạo nhũ tương 11

4.3.2 Khả năng hòa tan 11

4.3.3 Sự biến tính 11

4.3.4 Tính kị nước 12

4.3.5 Tính chất của dung dịch keo 12

4.3.6 Tính chất điện ly lưỡng tính 12

5 Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen 12

6 Quy trình công nghệ của trích ly collagen từ da cá tra 13

6.1 Phương pháp hóa học 13

6.2 Phương pháp dùng enzyme 16

7 Các ứng dụng của collagen 18

7.1 Trong công nghiệp thực phẩm 18

7.2 Trong mỹ phẩm 19

7.3 Trong y học và dược phẩm 19

8 Thành tựu 21

8.1 Nghiên cứu trích ly collagen bằng enzyme collagenase kết hợp với acid 21

8.1.1 Mở đầu 21

8.1.2 Cách tiến hành 21

8.1.3 Kết quả 23

8.1.4 Kết luận 24

8.2 Nghiên cứu ứng dụng của collagen trong lĩnh vực y khoa: Tổng hợp polymer-collagen hydrogel để làm chất tải thuốc và dùng trong công nghệ mô 25

8.2.1 Mở đầu 25

8.2.2 Giới thiệu 25

8.2.3 Tổng quan 26

8.2.4 Tổng hợp hydrogel 29

8.2.5 Kết quả 31

8.2.6 Bàn luận 42

8.2.7 Kết luận 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC HÌNH Hình 1-1: Cấu trúc lớp hạ bì của da 5

Hình 1-2: Các liên kết sợi ở collagen 5

Hình 2-1: Cấu trúc phân tử collagen 7

Hình 2-2: Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen 7

Hình 2-3: Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen 8

Hình 2-4: Tổ chức bó sợi collagen 8

Hình 6-1: Quy trình chiết collagen bằng acid acetic 14

Hình 6-2: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá (Điện di trên 5% gel chứa urea 3,5M) (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu 15

Hình 6-3: Quy trình chiết collagen bằng pepsin 16

Hình 7-1: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, được trộn chung với đậu hủ hay natto dùng trong bữa ăn của các phụ nữ Nhật 18

Hình 7-2: Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate 19

Hình 7-3: Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng mới trước khi sử dụng collagen, (b): sau 3 ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng) 20

Hình 7-4: Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa 21

Hình 8-1: Cấu trúc của polymer PEO-PPO-PEO 23

Hình 8-2: Quá trình tạo micelle 24

Hình 8-3: Lược đồ phương pháp chế tạo hydrogel tổng hợp 26

Hình 8-4: Mẫu hydrogel C-F108 (1%) ở các vị trí khác nhau 26

Hình 8-5: Hình ảnh SEM cấu trúc của A) Collagen gel; B) C-L103 (1%); C) C-L103 (3%); D) C-L103 (5%); E) C-F108 (1%); F) C-F108 (3%); G) C-F108 (5%) khi nồng độ collagen là 3,2 mg/ml (độ phóng đại: 2500) 29

Hình 8-6: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 và 15% 30

Hình 8-7: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 và 15% 30

Hình 8-8: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30% và 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10% 31

Hình 8-9: Tế bào K562 trên A) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) B) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) ở những nồng độ khác nhau đo bằng cách bổ sung Alamar blue Giá trị trung bình được sử dụng trên đồ thị Thanh sai số thể hiện sai số chuẩn của giá trị trung bình (n = 3) 31

Hình 8-10: A) Tế bào K562 trên ma trận hydrogel C-F108 (1%) sau 1 tuần B) Hình ảnh SEM của tế bào K562 trên C-F108 (1%) sau khi liên kết với glutaraldehyde (2%) (độ phóng đại 2500)

32

Hình 8-11: Hình ảnh điện di của BSA tinh khiết và BSA-PPG diglycidyl ether liên kết dọc trong môi trường ở những thời điểm khác nhau 32

Hình 8-12: Hình ảnh điện di của collagen tinh khiết và collagen diglycidyl ether trong môi trường ở những thời điểm khác nhau 33

Hình 8-13: Hình ảnh SEM của collagne tinh khiết ở các độ phóng đại khác nhau 33

Hình 8-14: Hình ảnh SEM của PG-COLc20 ở các độ phóng đại khác nhau 34

Hình 8-15: A) Đường cong TGA của PPG diglycidyl ether tinh khiết; B) Đường cong TGA của gel tổng hợp 34

Hình 8-16: Đồ thị DSC của PPG diglycidyl ether tinh khiết; Tg = -76,7oC 34

Hình 8-17: Đường cong nhiệt của collagen tinh khiết,, PG-COLc5 và PG-COLc20 A) Quét lần 1 B) Quét lần 2 35

Hình 8-18: Đường NMR của A) PPG diglycidyl ether B) Collagen tinh khiết C) Gel tổng hợp .35

Hình 8-19: Đồ thị thể hiện liên hệ của nồng độ amin với độ hấp thu tia UV 36

Hình 8-20: Độ độc của collagen-PPG gel lên nguyên bào sợi, đo bằng phần trăm tế bào sống, 72 giờ sau khi cấy 37

Hình 8-21: Nguyên bào sợi (mũi tên) trong A) PG-COLc20 b) blank glass coverslip C) bottom well plastic ở ngày 1 dưới kính hiển vi quang học, Độ phóng đại × 10 38

Hình 8-22: Hình ảnh SEM của nguyên bào sợi trên A) glass coverslip và B) PG-COLc20 ở các độ phóng đại khác nhau 38

Hình 8-23: Minh họa sự tạo liên kết dọc của collagen với diglycidyl ether 40

Hình 8-24: Cơ chế phản ứng của nhóm epoxy với nhóm-amino của lysine ở pH12 41

Hình 8-25: A) Bề mặt của collagen-PPG diglycidyl B) Bề mặt của collagen tinh khiết 43

Hình 8-26: Hình ảnh điện di của mẫu collagen từ da cá hồi trong điều kiện khử và không khử Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất bằng acid acetic, collagenase từ CNA1 và CNL3 trong điều kiện khử 46

DANH MỤC BẢNG Bảng 3-1: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 9

Bảng 8-1: Các loại polymer dùng để tổng hợp hydrogel 23

Bảng 8-2: Phương pháp chuẩn bị mẫu hydrogel 27

Bảng 8-3: Vật liệ sử dụng để sản xuất hydrogel tổng hợp bằng phương pháp thủy phân 27

Bảng 8-4: A) Tỉ lệ của BSA & PPG trong các môi trường có pH khác nhau B) Tỉ lệ của Vitrogen 100 & PPG trong NaOH ở các pH khác nhau 27

Bảng 8-5: Tỉ lệ tế bào sống trên hydrogel C-F108 ở các nồng độ polymer khác nhau 32

Bảng 8-6: Độ hấp thu tia UV của hỗn hợp BSA ở các nồng độ khác nhau 36

Bảng 8-7: Số lượng nhóm amin tự do trên dung dịch tổng hợp ở các tỉ lệ polymer khác nhau .36

Bảng 8-8: Phần trăm phát triển tế bào trên gel tổng hợp so với mẫu chuẩn 37

Bảng 8-9: Số lượng tế bào sống sót sau 24 giờ trên các chất mang khác nhau 37

Bảng 8-10: Góc tiếp xúc với nước của mẫu chuẩn và lớp màng kết hợp, độ lặp lại n=4 43

Bảng 8-11: Lượng collagen chiết xuất bằng acid và collagenase 46

1 Tổng quan về collagen Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật Nó được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng Collagen là một loại protein chiếm tới 25% lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau Ví dụ như các sợi collagen chiếm chủ yếu trong sợi dây chằng, ảnh hưởng đến khả năng nén ở các khớp sụn và tính linh động của mạch máu và da Nó được coi như là một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể con người thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có collagen cơ thể người chỉ là các phần rời rạc Chỉ riêng điều này cũng đủ chỉ ra tầm quan trọng của collagen với sự sống của con người Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm

Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá vỡ Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da (hình 1-1) Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy sệ Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng

Hình 1-1: Cấu trúc lớp hạ bì của da

Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc

3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc (hình 1-2) Trong cấu

trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kịnước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen

Hình 1-2: Các liên kết sợi ở collagen

Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vếtthương, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch Thêm vào đó sựphát triển của một số bệnh di truyền được xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen củacollagen Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều được ghi lại như

là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường vàung thư cũng như những bệnh có liên quan đến sự lão hoá Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyênliệu giàu collagen dùng để sản xuất ra gelatine, chất có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khácnhau

2 Các loại collagen và cấu tạo của chúng

 Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể Đã có 29 loại collagen được tìm thấy vàcông bố trong các tài liệu khoa học Trên 90% collagen trong cơ thể là loại I, II, III và IV

 Collagen loại I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính củaxương)

 Collagen loại II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn)

 Collagen loại III: có trong bắp (thành phần chính của bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I

 Collagen loại IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào

 Collagen loại V: có trong dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô

 Collagen loại VI: có trong gan, thận, màng sụn

 Collagen loại VII: có trong sự nối liền của da và biểu bì

 Collagen loại VIII: có trong tế bào màng trong

 Collagen loại IX: có trong sụn

 Collagen loại X: có trong sụn bị khoáng hóa và phình to

 Collagen loại XI: có trong sụn

 Collagen loại XII: có trong dây chằng, sợi liên kết collagen

 Collagen loại XIII: có trong biểu bì, nang tóc, tế bào gốc của móng

 Collagen loại XIV: có trong sợi liên kết collagen

 Collagen loại XV: có trong nhiều mô khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII

 Collagen loại XVI: còn đang được nghiên cứu

 Collagen loại XVII: có trong da

 Collagen loại XVIII: có trong gan

 Collagen loại XIX: có trong mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu phát triển

 Collagen loại XX-XXIX: còn đang được nghiên cứu

Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân.Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổicủa động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 - 10% Những loạicolagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt

Về cấu trúc của phân tử collagen, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là một cấutrúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm Mỗi sợi collagen này được

cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (alpha peptide) nối với nhau bằng các liên kết hydro và xoắn lại

với nhau giống như sợi dây thừng (hình 2-1) Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3,3 gốc amino

acid, chiều cao là 2,9 A0 Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn ống từ trái sang phải Ba chuỗi này xoắnlại với nhau hình thành một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix

Hình 2-3: Cấu trúc phân tử collagen

Mỗi một chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự,

thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X – Hyp (hình 2-2) Trong đó, X, Y là những đơn vị

amino acid khác Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếmkhoảng 1/3 chuỗi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm 1/2 chuỗicollagen Các amino acid còn lại chiếm 1/2 Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trongcấu trúc sợi siêu xoắn của collagen

Hình 2-4: Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợimảnh nhỏ Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hìnhthành nên bộ ba tropocollagen Sau đó tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôihình thành collagen fibril Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu

cáp – collagen fiber (hình 2-3, 2-4).

Hình 2-5: Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen

Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợicollagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng Vì thếcollagen rất chắc, dai và bền.

3 Thành phần các acid amin có trong collagen

Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline,hydroxyproline Collagen không chứa tryptophan, và là một trong số ít các protein chứahydroxylysine Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố nhưsau:

Bảng 3-1: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

Trong đó I là amino acid (proline và hydroxyproline), X là các amino acid khác Glycinechiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của

nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau tạo thành một đường xoắn ốc vớikhoảng trống nhỏ ở phần lõi Trong collagen không chứa tryptophan, cystine như các loại proteinkhác, còn tyrosin, histidin, và các acid amin chứa lưu huỳnh mỗi loại hiện diện không quá 1%,điều này làm các cầu nối disulfur (-S-S) trong cấu trúc collagen xuất hiện ít và là nguyên nhâncho tính mềm dẻo của nó so với keratin, nhưng chứa rất nhiều hydroxyproline Hydroxyprolinenày là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có Trong collagenchứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine

4 Tính chất của collagen

4.1 Tác dụng với nước

Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g Collagen khô có thểhút được khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần

Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagen làm giảmtính vững chắc của sợi gelatin từ 3 – 4 lần Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạchpolypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptidetương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 650C collagen hút nước bị phân giải

Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao Khi nguyên liệu đãkhử hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải sẽ giảm xuống.

4.2 Tác dụng với acid, kiềm

Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc carboxyl vàamin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trong điều kiện có acid tồn tại, ion của nó tácdụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp).Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+

Trong điều kiện có nước, nước có thể tác dụng với nhóm gốc có mang điện trong kết cấuprotide và những ion Na+ và Cl- làm tăng tính hấp phụ nước của collagen do đó trong môi trườngacid và kiềm thì tính trương nở của collagen được tăng lên

Ngoài ra acid và kiềm còn gây ra 1 số biến đổi là :

Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+ và COO-) làm đứt mạch peptide trong mạch chínhLàm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO, NH- của mạch xung quanh nó

Làm acid amin bị phân hủy giải phóng ra ammoniac

Cùng với biển đổi đó điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, acid và kiềm đều có thểphân hủy collagen tuy nhiên theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thì vôi cũng làm tăng tỷ lệphân hủy của collagen

Trong điều kiện thường, thời gian dài có thể làm cho collagen bị phân giải( mức độ phân giảithấp) khi nhiệt độ tăng thì độ phân giải cũng tăng lên nhanh chóng

Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng

sẽ tiến hành như sau:

Nếu xử lý trong điều kiện nhiệt độ cao và có nước thì keo dễ tiếp tục biến đổi thành

Do đó nếu muốn sản xuất gelatin thì ta phải khống chế nhiệt độ thích hợp cho chất lượng củagelatin được đảm bảo

4.3 Các tính chất khác của collagen

4.3.1 Khả năng tạo nhũ tương

- Là một protein không tan, collagen có thể có ít dấu hiệu cho thấy là một chất nhũ hóa Tuynhiên, thực ra collagen có nguồn gốc từ da sống được xử lý và biến tính ở mức độ khác nhau cóthể là một chất nhũ hóa tốt hơn sữa gầy

4.3.2 Khả năng hòa tan

Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước lạnh Collagen cũng

đã được phân chia thành bốn lớp trên cơ sở tính hòa tan trong các dung dịch đệm khác nhau: tantrong muối trung tính, tan trong acid, tan trong kiềm, và không tan trong kiềm

Các phần tan trong acid thường bao gồm hai tập hợp khác nhau bên cạnh một tiểu phân tửchuỗi α Một có tên là β2 hoặc β11 bao gồm hai chuỗi α1, và thứ hai β1 hoặc β12 bao gồm mộtchuỗi α1 và một chuỗi α2 liên kết bởi liên kết cộng hóa trị kiểu este Collgagen hòa tan trongmuối được tìm thấy bao gồm 90% chuỗi của một chuỗi α và một số dạng β (l0%), trong khicollagen hòa tan trong acid là khoảng 10% chuỗi α và 90% ở dạng β Chỉ có 50% nhóm ion trongacid hòa tan có trong collagen hòa tan trong muối Các nhóm còn lại có thể tham gia vào mốiliên kết chéo Mặt khác, phần tan trong kiềm và không hòa tan trong kiềm đại diện cho collagentrưởng thành

4.3.3 S ự bi ế n tính

Dưới tác dụng của các chất hóa học như acid, base, muối, các dung môi alcohol, và các tácnhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn củaprotein bị biến đổi làm cho các liên kết hydro, các cầu nối disunfit, các liên kết ion bị phá vởnhưng không phá vỡ liên kết peptide, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên, protein sẽ thay đổitính chất so với ban đầu Đó là hiện tượng biến tính protein Sau khi bị biến tính, protein thường

có các tính chất sau:

 Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kị nước vốn ở bên trong phân tử protein Tức là khiprotein chưa biến tính, các acid amin có các nhóm kị nước nằm bên trong phân tử protein.Khi bị biến tính, phân tử protein lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các acid amin mạch thẳng,làm cho các nhóm kị nước lộ ra ngoài cho nên độ hòa tan giảm Khả năng giữ nước giảm

Cấu trúc bậc bốn giúp cho protein có khả năng hydrat hóa tạo thành màng hydrat baoquanh Khi biến tính làm mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn Vìthế protein giữ nước kém.

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của mộtprotein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khi các cấu trúc nàymất đi, protein chỉ là các polypeptide, và không có hoạt tính sinh học

 Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kếtpeptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

 Tăng độ nhớt nội tại

 Mất khả năng kết tinh Protein có khả năng kết tinh trong các môi trường muối, hoặc cồn

Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch protein không bền và kết tủa, được gọi là pHđẳng điện Khi bị biến tính, điểm đẳng điện của protein không còn, và chúng khó thể kếttinh

4.3.4 Tính kị nướ c

Do các gốc kị nước của các acid amin trong chuỗi polypeptide của protein hướng ra ngoài,các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kị nước Độ kị nước có thể giải thích là do các acidamin có chứa các gốc R- không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước Tính kịnước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein

4.3.5 Tính ch ấ t c ủ a dung d ị ch keo

Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm Hai yếu tố đảmbảo độ bền của dung dịch keo là:

 Sự tích điện cùng dấu của các protein

 Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

Khi dung dịch keo không bền, chúng sẽ kết tủa, có hai dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch vàkhông thuận nghịch:

 Kết tủa không thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein

không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

 Kết tủa thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có

thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

4.3.6 Tính ch ất điện ly lưỡ ng tính

Protein có tính chất lưỡng tính vì trong acid amin có chứa cả gốc acid (COO-) và gốc base(NH2-) Cả acid amin và protein đều có tính chất lưỡng tính

5 Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen

Collagen chứa trong hầu hết các bộ phận của cơ thể như mô, gân, xương, tủy, da… của cácloại động vật như cá nước ngọt, cá nước mặn, ếch, cá xấu, lợn, bò , trâu… tuy nhiên do ở nước talượng xuất khẩu cá tra, cá basa là rất lớn do đó lượng phế phẩm là da cá là rất lớn, lúc trước nóchỉ dùng làm thức ăn chăn nuôi nên giá trị của nó là không cao do đó trích ly collagen từ da cátra là 1 hướng đi mới và đầy tiềm năng

So sánh collagen giữa da cá tra và gia súc: Collagen từ cá có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việcứng dụng trong y học và mỹ phẩm Mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rấtchậm trên da người Để giải quyết vấn đề này người ta sử dụng biện pháp tiêm collagen vào da,tuy nhiên những bất lợi của phương pháp này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi

ro Do đó việc trích ly collagen từ cá được đưa vào nghiên cứu và sử dụng Khác với những loạicollagen thu được theo các phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên

da người Cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khácnhau, do đó collagen trích ly từ cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học.Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là cótốc độ hấp thụ vào máu nhanh gấp 1,5 lần so với collagen từ da heo

6 Quy trình công nghệ của trích ly collagen từ da cá tra

Hiện nay có nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu về vấn đề này với nhiều phương pháp khácnhau tuy nhiên phổ biến hiện này là dùng 2 phương pháp là phương pháp hóa học và phươngpháp dùng enzyme

6.1 Phương pháp hóa học

Thường dùng là tách chiết bằng acid acetic tuy nhiên cũng có thể tách chiếc bằng acid kháctuy từng loại nguyên liệu

Quy trình công nghệ:

Hình 6-7: Quy trình chiết collagen bằng acid acetic

Chỉ nói về phần da cá, trước tiên là bước tiền xử lý bằng NaOH 1% để loại các chất phicollagen (chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh) Da tiếp tục được xử lý với butyl alcohol 10%

để loại tiếp tạp chất Sau đó là quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0,5M trong 3 ngày

Ly tâm lấy phần dịch, còn phần bã đem chiết lần 2 cũng với acid acetic 0,5M trong 2 ngày nữa

Ly tâm lấy phần dịch Cả hai phần dịch chiết thu được là dịch lỏng, hơi sánh, gọi là acid-solublecollagen Để kết tủa collagen, cho NaCl rắn vào phần dịch chiết này đến nồng độ 0,9M Đến đâycollagen thô đã được kết tủa Để thu được collagen sạch, tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tanvào acid acetic 0,5M Thẩm tách thu được collagen sạch Collagen sạch được làm lạnh khô vàcất trữ ở nhiệt độ lạnh Trong bài báo này, tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SDS-PAGEtheo phương pháp của Weber và Osborn (1969) để xác định các chuỗi collagen Trong đó, mẫucollagen được hoà tan vào sodium phosphate 0,02M (pH 7,2) chứa 1% sodium dodecyl sulfate(SDS) và 3,5 Murea Điện di được tiến hành trên 3,5% gel với đệm phosphate 0,1M (pH 7,2)chứa 1% SDS Và tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của collagen bằng cách đo độ nhớt của hổnhợp collagen 0,03% hòa tan vào acid acetic 0,1M tại một số nhiệt độ Nhiệt độ biến tính được

xác định là nhiệt độ tại đó độ nhớt giảm đi phân nửa Các kết quả mà tác giả đạt được trong quátrình nghiên cứu:

 Về hiệu suất tách chiết: đạt được hiếu suất tương đối cao 51,4% (cá pecca Nhật Bản),49,8% (cá thu), 50,1% (cá mập) tính trên trọng lượng khô

 Về phân tích cấu trúc chuỗi collagen (hình 6-1):

Hình 6-8: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá (Điện di trên

5% gel chứa urea 3,5M) (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu

 Bằng phương pháp điện di như đã nói trên, hình 6-2 cho thấy collagen da của cá pecca và

cá mập gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1 và α2 Trong đó, α2 có hàm lượng rất nhỏ Nếu

có α3 tồn tại thì cũng không thể tách khỏi α1 trong điều kiện điện di này Còn đối với cáthu, collagen dạng α chỉ gồm chuỗi α1 mà hoàn toàn không có α2 Trong hình 6-2, chúng

ta cũng thấy có sự tồn tại của chuỗi β ở cả 3 loài cá

 Về nhiệt độ biến tính nhiệt độ biến tính collagen da cá rất thấp, 26,5oC (cá pecca), 25,6(cá thu), 25 (cá mập) thấp hơn khoảng 10oC so với collagen da heo (37oC) và cá trakhoảng 380C

*Nhận xét: Nhìn chung, tác giả đã đưa ra phương pháp tách chiết đơn giản, dễ thực hiện, chỉ

là tách chiết dựa trên các hoá chất thông dụng, không quá đắt tiền, các thiết bị cũng thông dụngtrong phòng thí nghiệm

6.2 Phương pháp dùng enzyme

Hình 6-9: Quy trình chiết collagen bằng pepsin

Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vôtrùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt Cách thức hoạt độngcủa emzyme pepsin: Điểm đẳng điện của pepsin khoảng pH 1, pepsin thuỷ phân mạnh các liênkết peptide nối mạch do các nhóm amin của các acid amin thơm trong phân tử protein và peptidetạo thành, sản phẩm được tách ra là các peptide và các acid amin tự do Hoạt động trong môitrường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này pepsinkhông bền do có sự tiêu hủy enzyme Pepsin có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạtlực của pepsin thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease Dung dịch pepsin trongnước ở dạng pepsinogen và được hoạt hoá bởi H+ với pH = 1,5 - 2,0 Chúng phân giải gần 30%mạch peptide và biến protein thành polypeptide

PEPSINOGEN H+ → PEPSINPROTEIN Pepsin→ POLYPEPTIDE

Trong quy trình này ta cần quan tâm tới vấn đề tinh sạch collagen

Phương pháp tinh sạch

Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loạichúng phải sử dụng nhiều biện pháp khác nhau Để loại muối khoáng thường dùng phương phápthẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex Đểloại bỏ các protein tạp có phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dungmôi hữu cơ, các phương pháp sắc kí trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp thẩm tích: Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn

không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấmđối với các dung dịch các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp ).Các tinh thể có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch cónồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion và các chấtphân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn Trong quá trìnhtách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch proteinvào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túicellophan Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm đượcpha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M) Vì màng cellophane là màng bánthấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua vào các dung dịchđệm loãng Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng (di chuyển theohướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứaprotein Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi.Bằng cách thay thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein Có thể làmgiảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khidung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từdung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch Phương pháp này thườngđòi hỏi có thiết bị đặc biệt Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủaprotein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi) Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảoquản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng) Buộc túi vào một que thủytinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu Cho vòi nước chảy nhẹ liêntục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên Muối hòa tan trong nước và bị loại dần Có thểtăng tốc độ thẩm tích bằng cách khuấy trộn dung dịch rửa Khi thẩm tích các protein thườngngười ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh

Sắc ký gel: Trong sắc kí gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng, các lỗ rỗng này được phủđầy bởi dung môi làm pha động Kích thước của lỗ rỗng phải đồng nhất, bởi vì kỹ thuật sắc kígel dùng để tách các chất theo trọng lượng phân tử Các phân tử có kích thước lớn hơn kíchthước lỗ rỗng sẽ không lọt vào bên trong lỗ rỗng và sẽ bị dòng chảy của dung môi đuổi ra khỏicột Còn phân tử nào có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào nằm bên trong lỗ nên

bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn Sắc kí gel được ứng dụng trong việc tách một hổn hợp thành cácnhóm chất riệng rẽ, ứng dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất có trọnglượng phân tử lớn, và ứng dụng để loại muối ra khỏi một hợp chất

*Nhận xét: việc tách chiết collagen bằng phương pháp sử dụng enzyme Da cá không tanhoàn toàn trong acid acetic nhưng tan hoàn toàn trong enzyme pepsin proteolysis Hiệu suất chiết

bằng enzyme (44,7%) cao hơn chiết bằng acid acetic (10,7%) Có thể cho rằng việc bổ sungenzyme giúp cho sự phá vỡ các màng tế bào nhanh hơn và mạnh hơn Vì thế collagen càng dễdàng được tách ra và cho hiệu suất tách chiết cao.

7 Các ứng dụng của collagen

Trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, cũng như y học, dược phẩm, collagenthường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân Collagen thủy phân gọi là collagenhydrolysate Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có các ứng dụng khác nhau

7.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một sốloại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng (hình 7-1)

Hình 7-10: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, được trộn chung với đậu hủ hay natto

dùng trong bữa ăn của các phụ nữ Nhật.

Trong các sản phẩm phomat, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằmngăn chặn sự mất nước Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trongviệc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loạithực phẩm này

Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo,dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa 0,5 ÷1% hàm lượng collagen hydrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy

Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel,chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng

Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội… Collagen hydrolysate chiếm từ 1 ÷ 5% giúpgiữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hìnhsản phẩm dễ dàng hơn

Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate sử dụng làm chấtlàm trong với tỉ lệ 0,002 ÷ 0,15% Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óngánh

Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5 ÷ 10 lần thể tích của nó nên được sử dụng trongcông nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước

7.2 Trong mỹ phẩm

Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đànhồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩmtối ưu cho tế bào Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da Sự suy giảm vềchất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô, mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quátrình lão hóa của cơ thể Collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thíchquá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương

Chính vì vậy mà collagen được dùng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: kemdưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm…

Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da chúng kết hợp vớicác tinh chất trong mật ong, dầu oliu , tinh dầu hoa hồng… có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạolàn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại, khói bụi, hóa chất… Vì thế da được trẻhóa, tươi tắn

Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc… tóc dễ bị tổnthương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bóng mượt Trong các sản phẩm chăm sóc tóc thường có bổ sung

một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn (hình 7-2).

Hình 7-11: Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen

hydrolysate.

Collagen còn được dùng điều trị phục hồi: thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổnthương hay trong giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu da thừasau khi giảm béo

7.3 Trong y học và dược phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học cũngnhư khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau, là một loại vật liệusinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học Màng collagen được sử dụng cho hàngloạt những ứng dụng như làm chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối vớinhững mô cấy Collagen được sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốcbao gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng… Collagen được sử dụngrộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị phỏng, tái tạoxương và nhiều mục đích khác thuộc nha khoa, phẫu thuật, chỉnh hình Collagen còn được dùng

trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng (hình 7-3)

(a) (b) (c) Hình 7-12: Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng mới trước khi sử dụng

collagen, (b): sau 3 ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng)

Đôi khi chúng được sử dụng kết hợp với silicone, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, cáctác nhân tăng trưởng và các hợp chất khác Collagen cũng được bán trên thị trường như một chất

bổ sung, cải thiện tính linh hoạt của khớp Ngoài ra, collagen còn là phần nền giúp tích tụcalcium trong xương Nếu hàm lượng collagen giảm đáng kể, calcium không thể tích tụ làm choxương giòn và dễ gãy, sụn dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau ở khớp gối và hông Như vậy, đểxương cứng cáp hơn, ngoài calcium ta cần bổ sung một lượng lớn collagen

Collagen là một polyme tự nhiên, nó được dùng trong phẫu thuật tạo hình như bơm môi, căng

da mặt…

Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết rạch trong phẫu thuật.Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làm những sản phẩm y học chogân và dây chằng Những ống collagen được sử dụng thay thế cho các cấu trúc như thực quản,dây thần kinh ngoại biên, niệu quản Nó cũng được sử dụng trong việc nuôi cấy tế bào

Collagen dạng màng và lớp mỏng được sử dụng để giữ cố định các vật chất sinh học chẳnghạn như nhân tố XI 11 trong máu, dùng trong sự tái tạo các mô, nối kết lại võng mạc, làm màngthẩm tích máu, làm vật thay thế lớp màng cứng của não Nó còn được dùng cho việc tái tạo dâythần kinh, khôi phục màng nhĩ, sụn và xương, kiểm soát sự chảy máu cục bộ, khôi phục tổnthương của gan, là lớp màng chắn bảo vệ não, có tác dụng phục hồi các vết thương

Dung dịch và huyền phù collagen được sử dụng dưới dạng có thể tiêm được làm thông sự tắcnghẽn động mạch, chữa gãy xương, tái tạo tủy sống, trị đái dầm, phục hồi chức năng trượt củagân

Sự phát triển của tế bào với sự hỗ trợ của collagen trong việc nuôi cấy tế bào vừa đượcnghiên cứu gần đây Việc sử dụng chất nền collagen cho sự phát triển của tế bào da đã được công

bố một cách rộng rãi Những tế bào nuôi cấy trên collagen được kích thích, làm vết thương maulành Những nghiên cứu rộng rãi về sự phát triển của tế bào da tự sinh và khác loại trên nềncollagen chứng minh tính khả thi để tạo ra nhiều chủng loại mô và các cơ quan trong quá trìnhnuôi cấy Sử dụng nguồn nguyên liệu tế bào nuôi cấy thuộc nhiều chủng loại khác nhau có tácđộng to lớn đến việc điều trị cho những bệnh nhân bị tổn thương về mô hoặc các cơ quan

Collagen còn được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng và mềm Nó có tác dụng bảo

vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi Thành phần chính của vỏ bao làcollagen và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màucho phép, hương liệu

Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho bệnh nhân có thể nuốt viên thuốc một cách dễdàng.

Collagen còn được sử dụng để làm ra các gạc vô trùng sử dụng trong giải phẩu…

Trong phẫu thuật nội soi, collagen hydrolysate được ứng dụng để bôi vào các ống nội soi, cótác dụng bôi trơn, vì thế các bác sĩ dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gâyđau Sau thời gian từ 40 ÷ 60 phút, collagen sẽ tan hủy trong cơ thể bệnh nhân mà không gây hạigì

Trong nha khoa, collagen được chế tạo thành các mảnh bọt biển (sponges), chúng là một tácnhân cầm máu Những mảnh bọt biển này có khả năng hấp thụ một lượng chất lỏng gấp 50 lần

khối lượng của chúng, vì thế chúng có khả năng cầm máu nhanh chóng (hình 7-4) Một ứng dụng

khá hay trong nha khoa là các bác sĩ tạo ra một lớp men răng nhân tạo bằng collagen hysrlysate

có chứa các ion calcium, phosphate, fluoride áp lên bề mặt răng thật , vì thế răng được bảo vệkhỏi các tác nhân gây sâu răng

Hình 7-13: Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa

8 Thành tựu

8.1 Nghiên cứu trích ly collagen bằng enzyme collagenase kết hợp với acid

8.1.1 Mở đầu

Hai vi khuẩn sản xuất collagenolytic protease (collagenase), một Gram dương Bacillus

cereus và CNA1 một Gram âm Klebsiella pneumoniae CNL3, đã được cô lập tương ứng trong

điều kiện kiềm và acid Việc sản xuất collagenase của hai loại vi khuẩn đã được tối ưu Glycerol

là nguồn carbon phù hợp để sản xuất collagenase cho cả hai chủng Các giá trị pH ban đầu tối ưucho collagenase sản xuất bởi CNA1 và CNL3 tương ứng là 7,5 và 6,0, và nhiệt độ tối ưu là 37oCcho cả hai chủng Hoạt tính tối đa của collagenase tinh chế một phần từ CNA1 là ở pH 7,0 và

45oC Sự ổn định của pH và nhiệt trong khoảng 6-8 và dưới 40oC Hoạt tính tối đa củacollagenase tinh chế một phần từ CNL3 là ở pH 6,0 và 40oC Sự ổn định của pH và nhiệt trongkhoảng 5-7 và dưới 37oC Các collagenase từ CNL3 ổn định ở pH thấp hơn so với từ CNA1.Collagenases từ cả hai giống được sử dụng để chiết xuất collagen từ da cá hồi Việc sử dụngcollagenases từ CNA1 và CNL3 kết hợp với xử lý acid mang lại lượng collagen cao, 54,6% và53,0% trọng lượng khô da cá, tương ứng

8.1.2 Cách tiến hành

8.1.2.1 Chuẩn bị da cá cho khai thác collagen

Da cá được chuẩn bị theo phương pháp của Jongjareonrak và cộng sự với một sửa đổi chút ít.Tất cả các thủ tục chuẩn bị được thực hiện tại 4oC và khuấy liên tục Để loại bỏ protein khôngcollagen, da lần đầu tiên được trộn với dung dịch NaOH 0,1 N với tỉ lệ mẫu/dung dịch kiềm

(w/v) là 1:10 Hỗn hợp được khuấy trong 24 giờ Dung dịch kiềm đã được thay đổi mỗi sáu giờ.Sau đó, các mẫu đã loại bỏ protein được rửa sạch bằng nước lạnh cho đến khi nước rửa được đạt

pH trung tính hoặc base yếu Da bị khử protein được khử chất béo bằng butyl alcohol 10%với tỉ

lệ rắn/dung môi (w/v) là 1:10 trong 24 giờ, dung môi được thay đổi mỗi sáu giờ

Các chất chiết xuất kết hợp được kết tủa bằng cách cho thêm NaCl để đạt nồng độ cuối cùng2,6 M trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) Các kết tủa được thu thập bằng ly tâm 8000 vòng/phúttrong 30 phút ở 4oC và sau đó hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M Dung dịch thu đượcđược thẩm tách với 10 thể tích acid acetic 0,1 M trong một màng thẩm tách với phân tử trọnglượng cho qua là 8000 Da trong 12 giờ ở với sự thay đổi dung dịch mỗi bốn giờ Sau đó, dungdịch đã được thẩm tách với 10 thể tích nước cất và thường xuyên thay đổi nước cho đến khi đạt

pH trung tính Các trích xuất đã thẩm tách được đông khô và được gọi là collagen acid hòa tan(ASC – Acid Soluble Collagen)

8.1.2.3 Chiết xuất collagen bằng collagenases

Da cá khử protein và khử chất béo và bã không tan thu được sau khi xử lý acid được rửa sạchtriệt để với nước cất, hòa trong 2 thể tích dung dịch 0,1 M của loại đệm pH thích hợp và xử lývới collagenase (CNA1 và CNL3) 100 U/mg chất khô trong 48 giờ ở 4oC và khuấy nhẹ nhàng.Dung dịch nhớt được ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC Để chấm dứt các phản ứngenzyme, chất gạn thu được đã được thẩm tách với đệm phosphate natri 0,02 M (pH 7,2) trongmột màng thẩm tách với trọng lượng phân tử cho qua là 8000 Da trong 24 giờ ở 4oC với sự thayđổi dung dịch sau mỗi bốn giờ Dung dịch thẩm tách thu được đã được ly tâm 8000 vòng/phúttrong 30 phút Các viên thu được đã được hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M Dung dịchsau đó được kết tủa bằng cách cho thêm NaCl để nồng độ cuối cùng là 2,6 M trong Tris-HCl0,05 M (pH 7,5) Kết tủa được thu thập bằng cách ly tâm tại 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC

và tái hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M Dung dịch này được thẩm tách với nước cất vàđông khô theo cách tương tự như đối với chuẩn bị ASC

8.1.2.4 Phân tích điện di của các chiết xuất collagen

Dạng protein của collagen được phân tích bằng cách sử dụng gel điện di sodium dodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli Mẫu collagen đông khô bịhòa tan trong đệm natri phosphate 0,02 M (pH 7,2) có chứa 1% (w/v) SDS và ure 3,5 M Hỗnhợp mẫu được khuấy nhẹ nhàng ở 4oC trong 12 giờ Chất gạn được thu thập sau khi ly tâm3000g trong 3 phút ở 4oC Mẫu collagen hòa tan được trộn lẫn với mẫu đệm (Tris-HCl 0,5 M,

pH 6,8 có chứa 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol) có và không có 10% (v/v) β-mercaptoethanol(β-ME), sử dụng tỉ lệ mẫu/mẫu đệm (v/v) là 1:1 Mẫu được nạp vào gel đúc sẵn PAGEL-Compact (5% gel) và bị điện di với dòng điện không đổi 20 mA/gel sử dụng thiết bị Compact

PAGE Sau khi điện di, gel được nhuộm màu với 0,05% (w/v) Coomassie xanh R-250 trong 15%(v/v) methanol và 5% (v/v) acid acetic và tẩy màu với 30% (v/v) methanol và 10% (v/v) acidacetic Đánh dấu phân tử khối lượng lớn được được sử dụng để ước tính trọng lượng phân tử củaprotein Collagen tan trong acid loại I từ da bê đã được sử dụng làm collagen chuẩn

8.1.3 Kết quả

Collagen được chiết xuất trực tiếp từ da cá đã khử protein và khử chất béo của cá hồi bằngcollagenases từ CNA1 và CNL3 (bảng 2) Sản lượng của collagen tương ứng chiết xuất được rấtthấp ở 3,7% và 2,3% (theo khối lượng chất khô) Tuy nhiên, khi collagenase được áp dụng chocác cặn không tan thu được sau khi xử lý acid, sản lượng của collagen trích xuất bởi collagenase

từ CNA1 và CNL3 tương ứng là 18,1% và 16,5% (theo khối lượng chất khô) Vì vậy, sự kết hợpcủa collagenase từ CNA1 và CNL3 với acid tạo ra năng suất collagen cao hơn (54,6% và 53,0%tương ứng) so với chỉ sử dụng acid (36,5%)

Các mẫu điện di của collagen được chiết xuất từ da cá hồi của collagenases từ CNA1 vàCNL3 được phân tích trong β-ME và không có β-ME (hình 8-26) Không có sự khác biệt về kích

cỡ của collagen chiết xuất của acid acetic và collagenase Từ hình 8-26, ta thấy chuỗi α1 và α2 làcác thành phần chính của collagen trích xuất bởi cả hai collagenases Phần có khối lượng phân tửcao (có MW cao), bao gồm thành phần β và  cũng như các phân tử liên kết ngang của chúng,cũng đã được quan sát thấy trong cả hai phần Phân tử liên kết ngang có MW cao trong collagentăng với tuổi động vật và cá đói có nhiều collagen liên kết ngang hơn so với cá được ăn no Dạngcủa chuỗi α1 và α2 tương tự với những loại collagen chuẩn loại I từ da bê (lane 2) Collagen loại

I có thành phần chính gồm hai chuỗi α1 và một chuỗi α2 ([α1]2α2) Người ta cho rằng collagenloại I là collagen chính trong collagen chiết xuất bởi cả hai collagenases từ CNA1 và CNL3.Quan sát này tương đồng với các kết quả báo cáo cho collagen của da cá rô sông Nile, cáblackdrum, cá sheephead seabream và cá bigeye snapper Vì chuỗi α3 có khối lượng phân tửkhông thể phân biệt với α1 và vì nó không thể tách khỏi α1 bằng điện di, các sự hiện diện đồngthời của α3 với α1 cũng có thể là có thể

Hình 8-14: Hình ảnh điện di của mẫu collagen từ da cá hồi trong điều kiện khử và không khử Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất bằng acid acetic, collagenase từ CNA1 và CNL3 trong điều kiện khử

Bảng 8-2: Lượng collagen chiết xuất bằng acid và collagenase

8.1.4 Kết luận

Hai vi khuẩn sản xuất collagenase, Gram dương B cereus CNA1 và Gram âm K.

pneumoniae CNL3, được phân lập tại tương ứng pH kiềm 7,5 và pH acid 4,8 Các collagenases

từ hai chủng cho thấy sự khác nhau về pH và nhiệt độ tối ưu Các collagenase từ CNL3 đã đượcphân lập tại pH acid đã cho thấy sự ổn định cao hơn ở pH thấp so với CNA1 mà được phân lậptại pH kiềm Collagenases từ cả hai giống được sử dụng để chiết xuất collagen từ da cá hồi Sựkết hợp của các collagenase từ CNA1 và CNL3 với xử lý acid mang lại sự thu hồi collagen từcác chế phẩm da cá cao hơn, đó là 54,6% và 53,0% tương ứng so với sử dụng acid một mình.Ngoài ra, nghiên cứu về collagen cho thấy chiết xuất collagen từ da cá hồi bao gồm hai chuỗikhác nhau (α1 và α2), được mô tả như là loại collagen tôi không có liên kết disulfur