Xây dựng kỹ thuật RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C đồng thời định genotype HCV bằng lai trên vạch dò đặc hiệu của thanh inoLIPA Hồng Hiếu Ngọc ( 1 ) , Phạm Hùng Vân ( 2 ) Tóm tắt Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C là một trong những ngun nhân gây xơ gan và ung thư gan (1-8 ) . Qui trình kỹ thuật RT – PCR nhằm phát hiện, xác định genotype HCV do chúng tơi xây dựng với mục đích giúp định hướng và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C. Mục tiêu: Xây dựng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện HCV đồng thời xác định kiểu gen của virus viêm gan C bằng kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu của thanh InoLipa của Bayers. Phương pháp nghiên cứu: Chúng tơi xây dựng kỹ thuật RT – PCR dùng mồi đặc hiệu cho vùng 5’ khơng mã hóa của bộ gen HCV có gắn biotin để phát hiện RNA HCV. Sau đó, những sản phẩm PCR này được định genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu INOLiPA do gắn sẵn chất đánh dấu biotin trước đó. 45 mẫu huyết thanh HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) đã xác định bằng kỹ thuật RT – PCR thơng thường, lấy trong thời gian từ 3/2005 đến 7/2005, được tiến hành thử nghiệm phát hiện RNA HCV bằng qui trình kỹ thuật mới cùng với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và kỹ thuật Nested PCR của Bayer. Những sản phẩm PCR có HCV (+) sẽ tiếp tục định genotype bằng phương pháp lai. Kết quả: Với mỗi qui trình PCR, chúng tơi đều thu được kết quả 45 mẫu HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) như ban đầu. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật PCR thơng thường khơng thể tiếp tục định genotype HCV vì khơng có chất đánh dấu biotin. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật do chúng tơi xây dựng đều xác định được genotype và cho kết quả genotype giống như nhau. Kết luận: Qui trình kỹ thuật RT – PCR phát hiện RNA HCV bằng mồi có gắn biotin và định genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch do chúng tơi xây dựng và thử nghiệm đã thành cơng, cho kết quả chính xác như đối với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và Nested PCR. Abstracts Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific inoLIPA strip. Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma. The new RT – PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following treatment of HCV. Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe. Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and detected RNA HCV by using RT – PCR. These PCR products then can be used to find HCV genotypes by hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes. 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR technique, ordinary RT - PCR and Nested PCR. Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV genotypes. Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before. Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes. Positive HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from them are the same. Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success. The results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR. Đặt vấn đề Hiện nay, viêm gan siêu vi C là một bệnh lý được nhiều nhà lâm sàng, dòch tễ học cũng như nghiên cứu y học đặc biệt quan tâm. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy có sự tương quan rõ rệt giữa bệnh gan mãn tính, xơ gan và ung thư tế bào gan với nhiễm HCV (1-8) – thậm chí có liên quan đến từng type HCV riêng biệt (9,10) . Ngoài ra, để có được chỉ đònh điều trò đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trò thì việc xác đònh kiểu gen HCV trong máu cũng rất quan trọng. Việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện những tác nhân vi sinh vật đã và đang được sử dụng ở Việt Nam. Bên cạnh nhiều giá trò lợi ích hơn so với các xét nghiệm huyết thanh chẩn đoán, vấn đề giá cả của kỹ thuật này lại là một yếu tố cần được quan tâm cân nhắc. Vì thế, chúng tôi tiến hành xây dựng một qui trình kỹ thuật RT – PCR nhằm phát hiện và xác đònh genotype 1 *Tác giả chính, 1 Bộ mơn Hóa sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM. 2 Bộ Mơn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM HCV với mong muốn tìm hiểu độ tin cậy và sự chính xác của kỹ thuật này trên những mẫu bệnh phẩm so với những qui trình khác hiện đang được sử dụng. Chúng tôi cũng đánh giá các lợi ích về mặt kinh tế của kỹ thuật này để có hướng đưa ra áp dụng trên thực tế hiện nay tại các phòng thí nghiệm có trang bò PCR. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Mẫu máu bệnh phẩm từ bệnh nhân đã được chẩn đoán nhiễm HCV sẽ được tách chiết huyết thanh. Mẫu huyết thanh không nhiễm HCV – là những mẫu lưu trữ ở -70 o C tại công ty Nam Khoa. Các mẫu này đã được xác đònh RNA – HCV (-) qua kỹ thuật RT – PCR phát hiện HCV thực hiện tại công ty Nam Khoa. Tiến hành ly trích RNA từ những mẫu huyết thanh bệnh nhân HCV (+) và HCV (-) dựa trên nguyên tắc dùng Guanidine 14M và urea với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính protein nhờ đó ly trích được RNA toàn phần ra khỏi DNA và protein. Thực hiện RT tổng hợp cDNA từ những mẫu RNA được ly trích với nguyên tắc phiên mã ngược toàn bộ RNA thành cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. Giai đoạn này dùng kit tổng hợp cDNA của công ty Nam Khoa với chu kỳ nhiệt như sau: 25 o C trong 5 phút; 42 o C trong 30 phút; 85 o C trong 5 phút; Thực hiện PCR: Chúng tôi thực hiện 3 qui trình đồng thời. (1) Qui trình PCR và mồi bình thường: Là qui trình PCR sử dụng bộ kit RT – PCR phát hiện HCV của công ty Nam Khoa sản xuất. Qui trình này sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn dài #244 bp trong vùng 5’ không mã hóa của bộ gen HCV. Sau đó, sản phẩm sẽ được điện di và đọc kết quả dưới ánh sáng tia cực tím. (2) Qui trình Nested PCR với mồi OP và NP của Bayer: Qui trình này dựa trên nguyên tắc dùng mồi OP khuếch đại một đoạn dài 300 bp. Sau đó dùng sản phẩm PCR khuếch đại bằng mồi OP này làm khuôn để chạy qui trình nested PCR với mồi NP để cho sản phẩm khuếch đại dài #240 bp, cuối cùng, sản phẩm được phát hiện qua chạy điện di trên thạch agarose. Sản phẩm nested PCR có một đầu gắn biotin do mồi NP có gắn biotin. Nhờ vậy, sản phẩm PCR này sẽ dùng để xác đònh genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu HCV – INOLiPA. Cả hai lần chạy chương trình PCR bằng máy iCycler của BioRad đều theo chu kỳ nhiệt như sau: 94 o C trong 1 phút; 94 o C trong 15 giây; 55 o C trong 30 giây; 72 o C trong 30 giây; Lập lại 40 chu kỳ; 72 o C trong 5 phút. (3) Qui trình PCR với mồi gắn biotin: Đây là qui trình PCR do chúng tôi nghiên cứu trong đó chúng tôi dùng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn dài #244 bp tại đầu 5’ không mã hóa của bộ gen HCV. Một trong hai đầu được chúng tôi gắn chất đánh dấu biotin. Sản phẩm được chạy PCR để khuếch đại, sau đó, có thể dùng để xác đònh được genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu của HCV – INOLiPA. Chạy chương trình PCR bằng máy iCycler của hãng BioRad như sau: 1 chu kỳ 40 o C trong 10 phút; 1 chu kỳ 95 o C trong 5 phút; 40 chu kỳ 94 o C trong 30 giây; 60 o C trong 30 giây; 72 o C trong 1 phút; 1 chu kỳ72 o C trong 10 phút; Tổng thời gian thực hiện phản ứng là 2 giờ 10 phút. Phát hiện genotype HCV: Phát hiện genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu cho genotype của thanh HCV - INOLiPA. Nguyên tắc kỹ thuật là: sản phẩm khuếch đại được biến tính thành những chuỗi DNA đơn. Đầu 5’ của sản phẩm khuếch đại HCV có gắn với biotin được lai với những đoạn mồi ngắn. Đoạn mồi ngắn này một đầu được gắn cố đònh trên giấy nitrocellulose, đầu còn lại tự do, có trình tự nucleotid bổ sung với trình tự nucleotid của đầu 5’ không dòch mã đặc hiệu cho từng genotype HCV. Biotin của đầu 5’sẽ gắn với phức hợp streptavidine – alkalin phosphatase. Cuối cùng, sản phẩm lai được phát hiện bằng sự xuất hiện màu do phức hợp streptavidine – alkalin phosphatse tương tác với chất nền BCIP/NBT chromogen. Kết quả Với những mẫu huyết thanh HCV (+) và (-) ban đầu, chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời 3 qui trình PCR nói trên trong đó phương pháp PCR có mồi gắn biotin là của nhóm nghiên cứu: Với 45 mẫu HCV (+) ban đầu, sau khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết quả đều (+). Với 15 mẫu HCV (-) ban đầu, sau khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết quả đều (-). 45 mẫu HCV [+] này đều được tiến hành xác đònh kiểu gen bằng phương pháp lai trên vạch với bộ thuốc thử do hãng 2 BioRad cung cấp và kết quả được đọc theo thang chuẩn của hãng này Các kết quả genotype được ghi lại như sau: Kiểu gen 1b chiếm tỉ lệ cao nhất 22 trường hợp (52,38%). Tỉ lệ nhiễm type 1 thấp nhất 1 trường hợp (2,4%). Có 7 trường hợp đồng nhiễm 2 type (1 trường hợp nhiễm 1a/1b, 6 trường hợp nhiễm 2a/2c) và 1 trường hợp đồng nhiễm 3 type (2a/2c/1b). Kết luận Với những kết quả thử nghiệm do phương pháp 1 mang lại, chúng tôi không thể tiếp tục thực hiện xác đònh genotype HCV bằng kỹ thuật lai trên vạch vì trong thành phần của sản phẩm không có biotin – một chất dùng để phát hiện sản phẩm bằng cách hiện màu. Thử nghiệm đònh genotype từ phương pháp Nested PCR của Bayer và phương pháp PCR có mồi gắn biotin của chúng tôi cho kết quả như nhau vì sản phẩm PCR thu được từ hai phương pháp đều có gắn biotin ở đầu 5’. Do đó đều có thể được phát hiện bằng chất hiện màu. Kết quả phát hiện RNA HCV và đònh genotype giữa phương pháp Nested PCR và phương pháp của chúng tôi đã được trình bày ở phần trên càng xác đònh độ tin cậy của qui trình PCR có mồi gắn biotin mới được xây dựng so với hai qui trình còn lại. Như vậy, qui trình kỹ thuật của chúng tôi vừa có khả năng phát hiện RNA HCV vừa tạo ra được những sản phẩm PCR có thể tiến hành đònh genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch. Với cùng kết quả như trên, qui trình kỹ thuật do chúng tôi thiết kế chỉ cần sử dụng 1 cặp mồi để phát hiện RNA – HCV so với Bayer phải sử dụng 2 cặp mồi. Ngoài ra, trong thành phần genotype HCV PCR mix của chúng tôi có dUTP và UNG để chống ngoại nhiễm còn trong bộ PCR master mix của Bayer thì không. Như vậy, trong mục tiêu này, điểm lớn nhất mà chúng tôi đạt được là không hề bò ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nên kết quả xác đònh genotype luôn rõ ràng, không có các vạch màu tạp nhiễm khiến việc đọc kết quả khó khăn. Để thực hiện đònh genotype HCV dựa trên qui trình kỹ thuật HCV – INOLiPA của Bayer, kinh phí sẽ là 300.000 VNĐ cho phát hiện HCV – RNA, 300.000 VNĐ cho PCR trước khi đònh type với mồi OP và NP, 1.300.000 VNĐ cho lai trên vạch dò đặc hiệu. Do đó tổng giá thành là 1.900.000 VNĐ. Để đònh genotype HCV với qui trình của chúng tôi thì giá thành sẽ là 300.000 VNĐ PCR phát hiện và đònh genotype, 1.300.000 VNĐ cho lai trên vạch dò đặc hiệu. Tổng giá thành sẽ là 1.600.000, tiết kiệm được 300.000 VNĐ so với cách làm của Bayers. Tài liệu tham khảo. 1. DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON. Hepatitis. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles & Practice of Infectious diseases. Gerald L.Mandell, John E.Bennett. Raphael Dolin. 2000;143:1736 – 1760. 2. DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK KG. et al. Long-terms clinical and histopathological follow-up of chronic posttransfusion hepatitis. Hepatology. 1991;14:969 - 974. 3. HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al. Long-term follow-up of posttransfusion and sporadic chronic hepatitis non-A. non-B and frequency of circulating antibodies to hepatitis C virus (HCV). J Hepatol. 1990;10:69 - 76. 3 HCV 244 bp HCV 240 bp HCV 244 bp Hình 1: Kết quả HCV [+] trên thạch điện di, với 3 phương pháp; A: phương pháp PCR với mồi bình thường, B: Phương pháp PCR với mồi OP và NP, C: Phương pháp PCR mồi gắn biotin A B C 2,4% 11,9% 52,38% 2,4% 14,29% 14,29% 2,4% 0 5 10 15 20 25 Số trường hợp 1 1b 2a/2c 2a/2c/1b Kiểu gen Biểu đồ 1: Tỉ lệ phân bố kiểu gen. 4. KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al. Non-A. non-B post-transfusion hepatitis. Looking back in the second decade. Ann intern Med. 1993:119:110 - 115. 5. MATTSSON L. SONNERBORG A, WEILAND O. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B hepatitis: A 13-year follow-up study of hepatitis C virus markers. Liver.1993;13:274 - 278. 6. SEEFF LB. Natural history of hepatitis C. Hepatology. l997;26:21S – 28S. 7. TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et al. Clinical outcomes after transfusion associated hepatitis C. N Engl J Med. 1995;332:1463 – 1466. 8. TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A, et al. Long-term follow-up of non-A non-B (type C) post-transfuston hepatitis. J Hepatol. 1992;16:273 - 281. 9. BRUNO S. SILINI E, CROSIGNANI A., et al. Hepatitis C virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A prospective study. Hepatology. 1997;25:734 – 758. 10. MAHANEY. K, TEDESCHI. V., MAERTENS. G., et al. Genotypic analysis of hepatitis C virus in American patients. Hepatology. 1994;20 :1405. 4 . do chúng t i xây dựng và thử nghiệm đã thành c ng, cho k t quả chính x c như đối với kỹ thu t RT – PCR thơng thường và Nested PCR. Abstracts Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis. hướng và theo dõi điều trị vi m gan siêu vi C. M c tiêu: Xây dựng kỹ thu t RT – PCR để ph t hiện HCV đồng thời x c định kiểu gen c a virus vi m gan C bằng kỹ thu t lai trên vạch dò đ c hiệu c a thanh. ban đầu. C c mẫu HCV (+) t kỹ thu t PCR thơng thường khơng thể tiếp t c định genotype HCV vì khơng c ch t đánh dấu biotin. C c mẫu HCV (+) t kỹ thu t Nested PCR và kỹ thu t do chúng t i xây dựng