Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang docx

Phổ ánh sáng “trắng” Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên gọi là sự tự phát huỳnh quang, hoặc

Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang

Khi các mẫu vật, sống hay không sống, hữu cơ hoặc vô cơ, hấp thụ rồi tái phát xạ ánh sáng, quá trình được gọi là hiện tượng phát sáng quang hóa Nếu sự phát xạ ánh sáng vẫn kéo dài tới vài giây sau khi năng lượng (ánh sáng) kích thích thôi tác dụng, thì hiện tượng được gọi là lân quang Còn hiện tượng huỳnh quang

mô tả sự phát xạ ánh sáng chỉ tiếp tục diễn ra khi đang hấp thụ ánh sáng kích thích Khoảng thời gian giữa lúc hấp thụ ánh sáng kích thích và lúc tái phát xạ ánh sáng trong hiện tượng huỳnh quang là cực kì ngắn, thường dưới một phần triệu giây

Hình 1 Quan sát của Stoke

Hiện tượng huỳnh quang được biết đến vào giữa thế kỉ 19 Nhà khoa học người Anh George G Stoke lần đầu tiên quan sát thấy khoáng vật fluorite biểu hiện huỳnh quang khi được rọi bằng ánh sáng tử ngoại, và ông đã đặt ra từ “huỳnh quang” Stoke nhận thấy ánh sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn ánh sáng kích thích, một hiện tượng trở nên nổi tiếng dưới cái tên sự lệch Stoke Trong hình 1, một photon bức xạ tử ngoại (màu tím) va chạm với một electron trong một nguyên

tử, kích thích và đưa electron lên mức năng lượng cao hơn Sau đó, electron kích thích rơi xuống mức thấp hơn và phát ra ánh sáng dưới dạng một photon năng lượng thấp hơn (màu đỏ) trong vùng ánh sáng khả kiến Hình 2 là biểu đồ biểu diễn vùng ánh sáng khả kiến của bức xạ điện từ, với bước sóng trải rộng từ xấp xỉ 400 đến 700 nanomét Bao quanh vùng khả kiến là ánh sáng tử ngoại có năng lượng cao hơn và ánh sáng hồng ngoại có năng lượng thấp hơn

Hình 2 Phổ ánh sáng “trắng”

Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên (gọi là sự tự phát huỳnh quang, hoặc huỳnh quang sơ cấp), hoặc sau khi xử lí với các hóa chất có khả năng huỳnh quang (gọi là huỳnh quang thứ cấp) Hiển vi huỳnh quang là sáng chế vào đầu thế kỉ 19 của August Kor, Carl Reichert, và Heinrich Lehmann, và nhiều người khác Tuy nhiên, tiềm năng của thiết bị này không được nhận ra trong nhiều thập kỉ,

và kính hiển vi huỳnh quang hiện nay là một công cụ quan trọng (có lẽ là không thể thiếu) trong ngành sinh học tế bào

Những nghiên cứu ban đầu cho thấy nhiều mẫu vật, gồm các vi khoáng vật, tinh thể, nhựa thông, thuốc thô, bơ, chất diệp lục, vitamin, và các hợp chất vô cơ, biểu hiện huỳnh quang tự phát khi được chiếu sáng bằng ánh sáng tử ngoại Tuy nhiên, mãi cho đến những năm 1930 thì nhà nghiên cứu người Áo Max Haitinger và các nhà khoa học khác mới phát triển được kĩ thuật huỳnh quang thứ cấp, sử dụng phẩm màu fluorochrome nhuộm các thành phần mô đặc biệt, vi khuẩn, và những mầm bệnh khác không thể phát huỳnh quang tự phát Các phẩm màu fluorochrome này, gắn với các mục tiêu hóa sinh đặc biệt, đã khích lệ việc sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Giá trị của thiết bị này được nâng cao đáng kể vào những năm 1950 khi Albert Coons và Nathan Kaplan chứng minh được sự định vị của kháng nguyên trong mô phản ứng với kháng thể gắn fluorescein

Công việc chính của hiển vi huỳnh quang là cho phép ánh sáng kích thích chiếu sáng mẫu vật, và rồi tách ánh sáng huỳnh quang phát xạ yếu hơn nhiều ra khỏi ánh sáng kích thích mạnh hơn Như vậy, chỉ có ánh sáng phát ra từ mẫu vật đi tới mắt hoặc một máy dò khác nào đó (thường là một camera kĩ thuật số hoặc camera phim thông thường) Những vùng huỳnh quang thu được chiếu sáng rực rỡ trên nền tối với độ tương phản đủ để phát hiện được Phông nền phía sau chất không huỳnh quang càng tối thì thiết bị càng có hiệu quả

Hình 3 biểu diễn một hình dung có tính hình học về sự kiện xảy ra khi một mẫu vật huỳnh quang được quan sát bằng một kính hiển vi huỳnh quang Ánh sáng

tử ngoại có bước sóng hoặc tập hợp bước sóng nhất định được tạo ra bằng cách cho ánh sáng phát ra từ nguồn phát tử ngoại đi qua bộ lọc kích thích Ánh sáng tử ngoại được lọc sẽ chiếu sáng mẫu vật, trong trường hợp này là tinh thể fluorite, chất sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang khi được rọi sáng bằng ánh sáng tử ngoại Ánh sáng khả kiến phát ra từ mẫu vật, có màu đỏ trong hình 3, sau đó được lọc qua một tấm lọc chắn không cho ánh sáng tử ngoại phản xạ đi qua Cần chú ý rằng đây là phương thức hiển vi duy nhất trong đó mẫu vật, sau khi bị kích thích, tạo ra ánh sáng riêng của nó Ánh sáng phát xạ tỏa ra theo mọi hướng (góc 360 độ), không cần biết đến hướng của ánh sáng kích thích

Hình 3 Nguyên lí kích thích và phát xạ

Hiển vi huỳnh quang là công cụ nghiên cứu vô giá và phổ biến nhanh chóng Lợi thế của nó dựa trên những thuộc tính mà các công nghệ hiển vi quang khác

không dễ gì có được Việc sử dụng fluorochrome khiến nó có thể nhận dạng được các tế bào và các thành phần tế bào hạ hiển vi và những thực thể khác có mức độ đặc trưng cao nằm giữa vật chất không huỳnh quang Hơn nữa, hiển vi huỳnh quang

có thể phát hiện sự có mặt của chất huỳnh quang với độ nhạy tinh vi Một số lượng rất nhỏ phân tử huỳnh quang (cỡ 500 phân tử trên micro mét khối) có thể được phát hiện Trong một mẫu vật cho trước, qua việc sử dụng phẩm nhuộm bội, các đầu dò khác nhau sẽ phát hiện sự có mặt của từng phân tử mục tiêu một Mặc dù kính hiển

vi huỳnh quang không cho độ phân giải không gian dưới giới hạn nhiễu xạ của mẫu vật tương ứng, nhưng sự có mặt của các phân tử huỳnh quang ở dưới giới hạn đó vẫn có thể nhìn thấy rõ rệt

Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang có thể áp dụng cho chất hữu cơ, chất sống (sinh vật) thuở xưa, hoặc cho các chất sống (với việc sử dụng huỳnh quang trong ống nghiệm hoặc trong cơ thể sống) hoặc cho chất vô cơ (đặc biệt trong việc nghiên cứu các chất gây ô nhiễm trong bánh xốp bán dẫn) Cũng có một số nghiên cứu đang tăng triển sử dụng đầu dò huỳnh quang để ghi lại sự thay đổi nhanh chóng sự tập trung ion sinh lí, như calcium và magnesium, và độ pH trong tế bào sống

Nhiều mô thực vật và động vật, cũng như các mẫu vật chất, vốn đã huỳnh quang khi bị rọi sáng bằng ánh sáng bước sóng ngắn (huỳnh quang tự phát hay sơ cấp) Sự huỳnh quang tự phát cũng tìm thấy ứng dụng trong nghiên cứu thực vật, hóa thạch than đá, thạch học đá trầm tích, và trong công nghiệp bán dẫn Trong nghiên cứu mô động vật hoặc mầm bệnh, huỳnh quang tự phát ít có tác dụng Có ích lợi nhiều hơn là các mẫu vật fluorochrome ngoại lai (còn gọi là fluorophore) được kích thích bằng cách rọi sáng, và lượng ánh sáng phát ra có cường độ mạnh hơn Sự huỳnh quanh như vậy gọi là huỳnh quang thứ cấp

Fluorochrome là phẩm màu, tự gắn chúng với vật chất hữu cơ nhìn thấy hoặc dưới ngưỡng nhìn thấy Các chất fluorochrome này, có khả năng hấp thụ và rồi tái phát xạ ánh sáng, thường có độ lợi lớn trong tỉ số hấp thụ - phát xạ (một khái niệm được gọi là độ lợi lượng tử) Điều này khiến cho fluorochrome cực kì có giá trị trong các ứng dụng sinh vật học Việc tăng cường sử dụng hiển vi huỳnh quang liên quan chặt chẽ với sự phát triển hàng trăm chất fluorochrome có đường cong cường

độ kích thích (hấp thụ) và phát xạ đã biết và các mục tiêu cấu trúc sinh học đã được hiểu rõ

Minh họa trong hình 4 là hai loại chất fluorochrome được sử dụng phổ biến nhất trong hiển vi huỳnh quang Acid nucleic nhuộm 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phân tử phía bên trái trong hình 4, là một dẫn xuất indole có hai nửa nucleophilic amidino cao, thường dùng đánh dấu huỳnh quang cho acid nucleic, và được sử dụng rộng rãi trong phép phân tích huỳnh quang nhằm nhận dạng nhanh mầm bệnh Ban đầu được tổng hợp dưới dạng chất chống trypanosomal tiềm năng, DAPI thường thích gắn nó với các vùng cặp bazơ adenosine và thymidine (A-T) trong DNA và được kích thích bằng ánh sáng tử ngoại với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 355nm Phẩm nhuộm này phát huỳnh quang trong vùng xanh lam của phổ ánh sáng khả kiến Phân tử DAPI phía bên phải (hình 4) là một loại fluorochrome khác, Texas Red, có tính chất huỳnh quang kết hợp đã được nghiên cứu kĩ lưỡng Loại fluorochrome này được phát triển cho việc đánh dấu kép trong một ứng dụng gọi là dòng cytometry, nhưng được dùng rộng rãi ở nơi có rhodamine (một loại chất fluorochrome khác) để dò tìm kháng thể trong hiển vi huỳnh quang

Trong nhiều trường hợp, Texas Red được dùng chung với DAPI và fluorescein isothiocyanate (FITC) để nhuộm các mẫu vật có thể quan sát được do

sự phát huỳnh quang đỏ, lam và lục của thuốc nhuộm Khi quyết định chọn loại nhãn sử dụng cho hiển vi huỳnh quang, cần phải ghi nhớ rằng fluorochrome được chọn phải rất có thể hấp thụ và kích thích ánh sáng và vẫn phải gắn với phân tử mục tiêu Fluorochrome cũng phải có khả năng cho lượng ánh sáng huỳnh quang phát xạ thỏa đáng

Hình 4 Các chất fluorofore phổ biến

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của hiển vi huỳnh quang là trong lĩnh vực huỳnh quang miễn dịch Một sinh vật sống tạo ra vô số kháng thể được sử dụng cùng với các tế bào bạch cầu để làm trung hòa các cá thể ngoại lai xâm nhập vào như virus, vi khuẩn, và các protein ngoại lai, chứa hoặc sinh ra kháng nguyên Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc trưng, thường có thể hình dung như mối quan hệ giữa chìa khóa và ổ khóa Huỳnh quang miễn dịch có sự thành công trong việc kết hợp hài hòa giữa độ nhạy của kính hiển vi quang học và mức độ đặc trưng cao biểu hiện bởi miễn dịch học

Trong kĩ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp, một kháng thể nào đó được đánh dấu bằng cách gắn hóa chất fluorochrome để tạo ra một cái gọi là một tiếp hợp, sau đó phết lên bản kính của kính hiển vi nghi ngờ có mặt một kháng nguyên nào đó, gọi là kích thích việc sản sinh kháng thể Nếu kháng nguyên có mặt, thì tiếp hợp kháng thể được đánh dấu sẽ kết hợp với kháng nguyên và vẫn gắn chặt trong mẫu vật sau khi rửa sạch Sự có mặt của tiếp hợp huỳnh quang được gắn bằng hóa chất và kháng nguyên được chứng minh khi fluorochrome bị kích thích tại cực đại kích thích của nó, và sau đó cường độ phát xạ ở các bước sóng khác nhau có thể quan sát được bằng mắt hoặc ghi lại bằng một hệ máy dò (camera kĩ thuật số hoặc camera truyền thống)

Một kĩ thuật cũng được sử dụng phổ biến nữa gọi là huỳnh quang miễn dịch gián tiếp, trong đó huyết thanh có khả năng chứa kháng thể chưa đánh dấu và kháng nguyên liên quan của nó, nhưng chưa rõ, ủ chung với nhau Cho fluorochrome tiếp hợp với kháng thể chống lại cơ thể người (nếu sử dụng mẫu vật của con người) rồi đặt lên bản kính chứa kháng thể - kháng nguyên chưa được đánh dấu Nếu thực là như vậy thì sẽ có phản ứng kháng nguyên – khảng thể, kháng thể chống lại cơ thể người được đánh dấu bằng fluorochrome tự gắn nó với phức hợp hình thành bởi kháng nguyên và kháng thể Sau đó, sự tạo nhóm của kháng nguyên, kháng thể đánh dấu, và kháng thể chống lại cơ thể người được đánh dấu fluorochrome được kích thích ở bước sóng cực đại sao cho fluorochrome và bất cứ sự phát xạ nào cũng đều quan sát được Kĩ thuật huỳnh quang miễn dịch gián tiếp làm giảm nhu cầu phải

giữ trong kho dự trữ một số lượng lớn kháng thể đánh dấu, và cũng thường thu được cường độ huỳnh quang mạnh hơn

Một lĩnh vực nghiên cứu huỳnh quang quan trọng nữa có liên quan tới việc nhuộm mô hóa học và hóa học tế bào Fluorochrome được dùng để nhận dạng nhiễm sắc thể, DNA, protein, cấu trúc tế bào, hóocmôn và vitamin Hiển vi huỳnh quang là công cụ mạnh mẽ trong những nghiên cứu đó do độ nhạy tinh vi của chất fluorochrome được chọn và nét đặc trưng của chúng đối với những đại lượng cực kì ngắn trong mẫu vật Thật vậy, mặc dù kính hiển vi huỳnh quang bị giới hạn độ phân giải trong không gian của nó theo các quy luật thông thường chi phối bởi giới hạn nhiễu xạ và khẩu độ, nhưng các đầu dò huỳnh quang có thể, thông qua ánh sáng phát xạ, phát hiện sự có mặt của chất huỳnh quang bằng cách làm cho những chất

đó trở nên nhìn thấy được thậm chí cả khi chúng chỉ có mặt dưới độ phân giải của kính (chẳng hạn chỉ vài ba phân tử)

Một nhóm ứng dụng đang được triển khai của kĩ thuật hiển vi huỳnh quang

là việc sử dụng các đầu dò huỳnh quang (fluorochrome) đối với vật chất sống, cả trong ống nghiệm và trong cơ thể sống Khó khăn nhân lên đối với các đầu dò này

là do chúng có thể có tính độc Ngoài ra cũng phải chú ý nhiều đến các khoảng thời gian trôi qua do bản chất thay đổi không ngừng của các quá trình sống và sự di chuyển cấu trúc nội bào Nghiên cứu huỳnh quang được ứng dụng làm thay đổi sự tập trung ion, liên kết và không liên kết, đối với các ion sinh học quan trọng như hydrogen (pH), calcium và magnesium

Nổi tiếng nhất là các nghiên cứu về calcium nội bào sử dụng đầu dò huỳnh quang phổ biến Fura-2 Đối với phẩm nhuộm này, sự kích thích kép ở bước sóng khoảng 340 và 380 nanomét (bằng công tắc ánh sáng và bộ lọc kích thích kép) có thể ghi lại ở một bước sóng phát xạ, bước sóng này được đo độc lập đối với mỗi dải kích thích Một máy tính chủ điều khiển kính hiển vi được dùng để tính toán tỉ lệ giới hạn calcium nội bào tự do qua sự thay đổi cường độ phát xạ huỳnh quang Lợi thế của phương pháp tỉ lệ nằm ở chỗ là về cơ bản tất cả các yếu tố được giữ không đổi, trừ khi các bước sóng kích thích kép tử ngoại gần, mỗi bước sóng tạo ra sự phát

xạ trong phần lục của phổ ánh sáng khả kiến Một loại chụp ảnh tỉ số tương tự được thực hiện với đầu dò có tên là Indo-1 Đối với chất fluorochrome này, cũng dùng để xác định calcium liên kết hoặc không liên kết nội bào, người ta sử dụng một bước sóng kích thích, nhưng sự phát xạ đo được có hai bước sóng phân biệt calcium liên kết và calcium không liên kết

Tác giả: Mortimer Abramowitz, Michael W Davidson

(davidson@magnet.fsu.edu)

hiepkhachquay dịch