Tìm hiểu một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (lates calcarifer, bloch) sau khi tiêm chủng vi khuẩn streptococcus iniae đã được bất hoạt bằng formalin

1 MỞ ĐẦU  -Trong năm gần tỉnh Khánh Hòa, tôm sú dần vị dịch bệnh, nhiễm mơi trường đề tài nghiên cứu sinh sản cá chẽm (Lates calcarifer) thầy, cô Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang thực (2002-2006), thật tạo bước ngoặt lớn việc đưa đối tượng cá chẽm trở thành đối tượng ni có giá trị kinh tế cao nước ta Với ưu điểm như: khả kháng bệnh cao, sinh trưởng nhanh, tiêu thụ tốt giúp cá chẽm dần “lên ngôi” tiến hành nuôi thương phẩm nhiều địa phương nước như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu… [4] Tuy vậy, sản lượng hàng năm chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ nội địa phục vụ chương trình xuất qua thị trường Úc, châu Âu Mỹ Trước nhu cầu lớn vậy, với việc người dân tự động mở rộng diện tích ni cách thiếu quy hoạch; đồng thời chưa có phối hợp đồng với quan chức năng, không ý đảm bảo yếu tố môi trường điều kiện để dịch bệnh bùng phát, gây thiệt hại lớn đến sản lượng thu hoạch, nguồn thu kinh tế thủy sản đất nước Trong số bệnh thường gặp cá chẽm kể đến bệnh Streptococcosis gây thiệt hại đáng kể đến nghề nuôi cá chẽm giới, Việt Nam Và sử dụng kháng sinh để chữa trị, không ngun tắc để lại dư lượng, làm giảm giá trị sản phẩm Do đó, nhà khoa học ý đến việc sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá giải pháp tối ưu cho phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản nói chung nghề ni cá chẽm nói riêng Mặc dù, giới vaccine phịng bệnh ni trồng thủy sản bắt đầu nghiên cứu phát triển từ năm 1973 có thành tựu định, Việt Nam chưa có nhiều bước chuyển lĩnh vực này, đặc biệt vaccine phòng bệnh đối tượng cá chẽm [1] Với mục tiêu nâng cao sản lượng thu hoạch hạn chế dịch bệnh bùng phát, đến nay, việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis đối tượng cá chẽm nước ta quan tâm tiến hành thực Được định hướng tạo điều kiện thầy Trần Vĩ Hích, thực đồ án tốt nghiệp với tiêu đề “ Tìm hiểu số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt formalin” Nội dung thực hiện: Tìm hiểu biến động lysozyme huyết cá Tìm hiểu thay đổi hoạt tính thực bào số thực bào đại thực bào Tìm hiểu biến động kháng thể thể cá sau tiêm nhắc lại vi khuẩn bất hoạt Hi vọng kết có từ đề tài góp phần hỗ trợ vào nghiên cứu việc sử dụng vaccine phòng bệnh Streptococcosis gây đối tượng cá chẽm PHẦN 1: TỔNG QUAN  -1.1 Hệ thống phân loại cá chẽm Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Latidae Giống: Lates Hình 1.1 Cá chẽm (Lates calcarifer) Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790) Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [5] 1.2 Đặc điểm hình thái Cá chẽm có thân hình thon dài dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu Chiều dài thân 2.7 - 3.6 lần chiều cao, thường từ 19-25 cm [6] Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía lõm xuống lồi lưng Miệng rộng so le, hàm kéo dài đến phía sau hốc mắt Răng dạng nhung, khơng có nanh, nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có vi: vi trước có 7-9 gai cứng vi sau có 10-11 tia mềm Vi hậu mơn có gai cứng, vi trịn có hình quạt Vẩy dạng lược có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên Khi cá khoẻ, mặt lưng có màu nâu, mặt bên bụng có màu bạc sống môi trường nước biển, màu nâu vàng sống môi trường nước Khi cá giai đoạn trưởng thành có màu xanh lục hay vàng nhạt lưng màu vàng bạc mặt bụng.[8] 1.3 Đặc điểm phân bố 1.3.1 Trên giới Cá chẽm loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương Ấn Độ Dương[8] Khu vực sinh sống địa vùng Bắc Đơng Australia tới eo biển Torres New Guinea Nhưng nuôi nhiều nơi giới Malaysia, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Vương quốc Anh, Hoa Kỳ Hà Lan [6] 1.3.2 Việt Nam Tại Việt Nam, cá chẽm tìm thấy vịnh bắc bộ, vùng biển Nam Bộ Hiện nay, đối tượng nuôi rộng rãi nhiều địa phương nước từ Bắc vào Nam 1.4 Tình hình bệnh Streptococcosis cá 1.4.1 Trên giới Streptococcosis bệnh truyền nhiễm xảy không cá nước ngọt, cá nước mặn trang trại ni mà cịn thấy ngồi tự nhiên Theo thống kê có 27 loài cá nước nước mặn nhiễm bệnh Các đối tượng nuôi nước mặn báo cáo thấy xuất bệnh như: yellowtail (Kitao 1982), cá chẽm (lates calcarifer), Angullla japonica, Menhaden (Brevoortia patronus) (Plumb et al 1974, Cook & Lofton 1975), striped mullet (Mugi1 cephalus), bluefish (Pomatomus saltatrix), striped bass (Morone saxatilis) (Baya et al 1990) [16] hybrid striped bass (Evans et al, 2000) [2] Bệnh xảy số lồi cá nước như: cá rơ phi (Press et al, 1998), cá hồi (Eldar & Ghittino 1999), cá ba sa (Pangasius bocourti), cá chép (Cyprinus carpio) [2] Các chủng Streptococci gây bệnh động vật thủy sản là: Lactococcus garvieae, S iniae S parauberis [3] Các nhà khoa học phát bệnh Streptococosis xảy châu Á vào năm 1957 cá hồi vân Nhật Bản (Hoshina et al, 1958) bắt gặp lần đầu châu Âu vào năm 1993.[26] Hiện nay, bệnh thấy xuất nhiều quốc gia giới: Nhật, Israel, Mỹ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan… Bệnh Streptococosis gây vấn đề nghiêm trọng cho kinh tế thủy sản Nam Phi Nhật Bản Ngoài phát Streptococcus sp nước dày- ruột số cá cảnh nhập vào Bắc Mỹ từ quốc gia khu vực Đông Nam Á (Trust & Bartlett 1974, Shotts et al 1975) (Nguồn: Aquatic Animal Health) Hình 1.2 Sự phân bố bệnh Streptococcosis khu vực Châu Á- Thái Bình Dương Những loài cá khác bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus xuất số dấu hiệu chung, bao gồm: Màu sắc đen tối, bơi lội khơng bình thường, mắt cá lồi đục, xuất huyết vây xương nắp mang Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, vết loét thường nông bệnh có lở loét khác Cá bị bệnh vận động khó khăn, khơng định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận lách tăng lên thể tích phù nề Sự thương tổn nội quan lý gây chết Tuy vậy, bệnh xảy thể nhẹ (mãn tính), có vài nốt xuất huyết thân mà khơng có tượng thương tổn nội tạng Nhưng bệnh dạng cấp tính, tỷ lệ gây chết cao [2] Từ mẫu cá nhiễm bệnh, người ta phân lập ba nhóm Streptococci: alpha- hemolytic, beta- hemolytic (Boomker et al 1979, Kitao et al 1981) non-hemolytic (Plumb et al 1974, Rasheed et al 1985, Baya et al 1990) Vi khuẩn Streptococcus iniae gây thiệt hại lớn đối tượng cá Bơn nhiều quốc gia (Kitao, 1993) [25] Đi sâu tìm hiểu bệnh Streptococosis xảy cá chẽm (Lates calcarifer) thấy: Australia quốc gia thông báo phát thấy bệnh Streptococosis đối tượng với dấu hiệu tương tự bệnh xảy đối tượng khác thơng báo trước [10] Kết thử nghiệm cảm nhiễm chủng Streptococcus iniae cá chẽm cho thấy tỉ lệ tử vong cao: 40% sau 48h thử nghiệm [10] Tiếp theo đó, vào năm 1985, có báo cáo bệnh xảy đối tượng cá chẽm Singapore (Foo et al, 1985) Trung Quốc vào năm 1990 Chủng vi khuẩn gây bệnh xác định Streptococcus iniae, với tỉ lệ tử vong 16,7%- 32,6% (Huang et al, 1990) [10] Ngồi cịn có báo cáo bệnh xảy cá chẽm Port Hurt, đảo Bathhurst (2005) với dấu hiệu đặc trưng nêu 1.4.2 Tại Việt Nam Chưa có nhiều nghiên cứu sâu bệnh Streptococcosis xảy đối tượng thủy sản, thấy có báo cáo phân lập Streptococcus ininae gây bệnh xuất huyết cá rô phi nuôi thâm canh [2] 1.5 Khái quát đặc điểm hệ thống miễn dịch cá xương Sơ lược cơng trình nghiên cứu có liên quan đến đáp ứng Miễn dịch đặc hiệu cá Hệ thống miễn dịch cá xương ví “tấm chắn” hồn hảo, tạo dựng từ hai mảnh ghép lớn: Miễn dịch không đặc hiệu (MDKĐH) Miễn dịch đặc hiệu (MDĐH), nhằm mục đích bảo vệ thể trước xâm nhập tác nhân lạ Có thể nói MDKĐH MDĐH có mối liên hệ mật thiết với tạo thành hệ thống phòng thủ vững bảo vệ thể Chẳng hạn, đại thực bào bắt nuốt tế bào vi khuẩn, khả tăng lên lớn tế bào vi khuẩn bị bao phủ kháng thể Mặt khác, kháng nguyên cần phải xử lý đại thực bào hệ thống lympho đáp ứng theo phương thức đặc hiệu Tổng thể nhân tố phịng vệ hình thành nên tính miễn dịch bệnh cụ thể mối quan hệ tương hỗ phức tạp chế đặc hiệu chế không đặc hiệu [2] Sự khác hai hệ thống đáp ứng là: Đáp ứng MDKĐH mang tính bẩm sinh- cá thể sinh có; cịn đáp ứng MDĐH có sau cá thể tiếp xúc với kháng nguyên (vi sinh vật gây bệnh) Giai đoạn mẫn cảm (đáp ứng MDKĐH) bước đệm quan trọng cho đáp ứng MDĐH sau đạt hiệu cao Trước tiên, tìm hiểu hệ thống đáp ứng MDKĐH cá xương Bao gồm đáp ứng miễn dịch khơng có trí nhớ, nghĩa đáp ứng (về cường độ quy mô) yếu tố xâm nhiễm nhau, xâm nhiễm lần đầu hay lần sau Đặc điểm khác biệt hệ thống MDKĐH so với hệ thống MDĐH tính bền vững hơn, ổn định, sai sót khuyết tật truyền từ hệ sang hệ khác Một đặc điểm khác tế bào miễn dịch nhận số loại kháng nguyên đặc trưng cho vi khuẩn [3] Còn hệ thống đáp ứng MDĐH thấy: tế bào đáp ứng hệ lympho bào, gồm hai loại lớn T B Chúng phát triển tự nhiên lympho trung ương như: thận, lách, tuyến ức (không cần có mặt kháng nguyên); sau phân bố quan lympho địa phương địi hỏi kích thích kháng nguyên để phát triển thành tế bào hành động Hình 1.3 Mối liên quan miễn dịch không đặc hiệu miễn dịch đặc hiệu MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU Phân tử gây viêm Thực bào Bổ thể Tiểu thực bào C3b Đường cổ điển Tc Fc (Kháng nguyên) Kích thích Tế bào T Đại thực bào Tế bào B Trình KN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU Từ trước đến nay, có nhiều báo cáo nghiên cứu sâu hệ thống miễn dịch cá xương, đặc biệt hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Theo Thompson (1995) đáp ứng MDĐH hình thành cá thể cách 400 triệu năm tồn hầu hết cá, động vật lưỡng cư, bò sát, chim động vật có vú Đã có báo cáo đáp ứng miễn dịch loài cá khác nhau, bao gồm cá chép (Van Diepen et al, 1994), cá hồi cầu vồng (Panigrahi et al, 2005), hybrid striped bass (Hrubec et al, 2004) sea bass (Breuil et al, 1997) [25] Nhiều thông tin liên quan đến chế việc sản sinh kháng thể cá công bố Các thông tin bao gồm chứng tham gia đại thực bào việc xử lý trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho liên quan đến kháng nguyên phức hợp hồ hợp mơ chủ yếu (MHC antigens) pha cảm ứng trình sản sinh kháng thể (Vallejo et al 1992), tương tác tế bào “B” “T” (Miller et al 1987), tham gia cytokine (Secombes et al 1996) Những số liệu cho thấy chế tương tự trình sản xuất kháng thể quan sát thấy động vật có vú [2] Đã có nghiên cứu đáp ứng dịch thể, đáp ứng tế bào cá, bao gồm: hoạt động đại thực bào (Gang et al, 1995; Solem et al, 1995), hoạt động tế bào B (Rijkers et al, 1980; Sánchez et al, 1995; Boesen et al, 1997) hoạt động tế bào T (Feng & Woo, 1996; Marsdenet al, 1996) Vào năm 1994, Manning tập trung nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá Trematomus bernacchii, nhằm cải thiện sức khỏe đối tượng Nuôi trồng Thủy sản Tiếp theo, xin sơ lược số cơng trình nghiên cứu có liên quan đến đáp ứng MDĐH cá sau tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh: a Đối với kí sinh trùng gây bệnh: Trong nhiều thập kỷ, người ta nghĩ cá khơng có chế đáp ứng miễn dịch chống lại Myxosporea, kết cơng trình nghiên cứu khơng phát có mặt kháng thể đặc hiệu (Pauley, 1974; Halliday, 1974; Siau, 1980; Bartholomew cộng sự, 1989) Tuy nhiên gần đây, diện kháng thể đặc hiệu trường hợp cá nhiễm bệnh Myxosporeans chứng minh rõ ràng, kể đến đáp ứng miễn dịch với lồi kí sinh trùng sau: Myxobolus cerebralis (Hedrick et al., 1998), Myxobolus artus (Furuta cộng sự, 1993.), Tetracapsuloides bryosalmonae (Saulnier & Kinkelin, 1996), Ceratomyxa Shasta (Bartholomew, 2001) Enteromyxum scophthalmi (Sitjà-Bobadilla et al, 2004.), tốc độ sản xuất kháng thể tương đối thấp Ví dụ, cá hồi cầu vồng nhiễm M cerebralis, sau 12 tuần chưa thấy xuất kháng thể để chống lại kí sinh trùng (Ryce, 2003) Trong đó, trường hợp cá bơn cảm nhiễm E scophthalmi, sau 48 ngày thấy có mặt kháng thể đặc hiệu trước cá tiếp xúc với loài (SitjàBobadilla cộng sự, 2007).[20] Một nghiên cứu khác Chaves, tìm hiểu số nhân tố đáp ứng MDĐH cá chim vây vàng (Trachinotus marginatus) ni phía nam Đại Tây Dương với lồi sán đơn chủ Bicotylophora trachinoti, có kết sau: Sau 15 ngày thử nghiệm, tổng số bạch cầu nhóm cá nhiễm kí sinh trùng ngồi tự nhiên cảm nhiễm bắt đầu thực nghiệm tăng cao đáng kể so với lô đối chứng Cịn sau 30 ngày thử nghiệm thấy tổng số bạch cầu nhóm cảm nhiễm thực nghiệm tăng cao đáng kể so với nhóm khác [12] Bên cạnh đó, sau 15 ngày tiến hành điều trị trường hợp cá bị nhiễm Bicotylophora trachinoti, thấy đại thực bào phân lập nhóm cảm nhiễm bắt đầu thực nghiệm cao nhóm bị nhiễm kí sinh trùng ngồi tự nhiên Điều chứng tỏ, thể cá chim vây vàng có chế đáp ứng MDĐH bị nhiễm kí sinh trùng b Đối với vi khuẩn: Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss) với Yersinia ruckeri ( Unal Ispir, 2008) có kết sau: Trong tất nhóm thử nghiệm, số miễn dịch tăng đáng kể có khác biệt nhóm thử nghiệm đối chứng (p