Luận văn : NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƯỞI (Citrus grandis) part 4 ppsx

18 A : Gốc ghép đƣợc cắt chữ T B : Lấy mắt ghép từ cành ghép C : Mắt ghép đã sẵn sàng để ghép D : Mắt ghép đƣợc ghép vào vết cắt E : Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.17: Cách ghép chữ T Mắt Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây  Ghép mắt Ngƣời ta bóc lấy một mắt ở nách lá trên một cành bánh tẻ của cây mẹ và một mảnh vỏ trên gốc ghép. Áp mắt ghép vào chỗ đã bóc vỏ trên gốc ghép rồi buột lại. Khi mắt ghép nảy mầm sẽ tạo một cây ghép. Ghép mắt có ƣu điểm là hiệu suất lao động cao, thao tác đơn giản. Ghép mắt gồm các phƣơng pháp ghép chủ yếu sau:  Ghép cửa sổ    Ghép chữ T B C D A: Gốc ghép B: Gốc ghép đƣợc tạo “cửa sổ” C: Mắt ghép đƣợc đặt vào “cửa sổ” D: Dùng dây buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ A 19 A B C A : Gốc ghép đƣợc lấy một mảnh cả vỏ và thân B : Mắt ghép cũng đƣợc lấy một mảnh tƣơng tự C : Áp mắt ghép vào gốc ghép và buộc dây Hình 2.18: Cách ghép mắt dạng mảnh  Ghép mắt dạng mảnh Ƣu điểm nhất của phƣơng pháp này là thao tác đơn giản, không cần bóc vỏ cành ghép và gốc ghép, nhƣng nếu cây chuyển nhựa tốt thì tỷ lệ sống cao hơn. Dùng dao cắt hai lát trên gốc ghép lấy đi một mảnh cả gỗ và vỏ thêm hai lát ở cành ghép để lấy mắt có cả cuống lá, lắp vừa khít vào gốc ghép, buộc chặt bằng dây. Sau một thời gian nhất định ta có thể mở dây ra và cắt ngọn gốc ghép [12, 15]. 2.3.2 Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô Trong trƣờng hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp đƣợc khả năng chống chịu của gốc hoang dã với mắt ghép có ƣu điểm năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thƣớc mắt ghép khá lớn nên bệnh virus có thể truyền lây. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trƣởng gọi tắt là vi ghép đƣợc thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng qua dinh dƣỡng của gốc ghép. Đỉnh sinh trƣởng làm mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,5 mm, đƣợc tách từ búp non đang sinh trƣởng mạnh của cây mẹ trƣởng thành, gốc ghép là cây mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Những cây ghép thu đƣợc 20 bằng phƣơng pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép [14]. 2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép  Chất điều hòa sinh trƣởng Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép đƣợc đặt nuôi cấy trong môi trƣờng MS có chứa chất điều hòa sinh trƣởng. Jonal và ctv (1983) đã chứng minh, thêm Cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 – 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh chóng của gốc ghép và chồi ghép. Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi chồi ghép trong môi trƣờng nuôi cấy có chất điều hòa sinh trƣởng trong một thời gian ngắn trƣớc khi ghép 5 – 10 phút trong môi trƣờng 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi (Edriss và Burger, 1984). Starratino và Caruso (1998), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng chồi ghép và mặt cắt gốc ghép vào môi trƣờng có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút trƣớc khi cả hai ghép lại với nhau.  Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép. Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật. Để ngăn cản quá trình này, Piego Alfaro và Murashige (1987) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trƣờng dinh dƣỡng có agar để liên kết nơi ghép. Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất dinh dƣỡng từ khối agar đƣợc tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu. Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm, có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của gốc ghép ngay trƣớc khi ghép chồi lên. Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất chống oxy hóa. Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao hơn rất nhiều so với môi trƣờng không có NAA (10,43%) Hơn nữa khi có NAA thì không cần thƣờng xuyên khử chồi phụ so với khi không có NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành 21 và phát triển của các chồi phụ nhƣng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát triển rất tốt. Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát triển tốt, sau 3 tuần kích thƣớc chồi đạt 8 mm. Tuy nhiên gốc có hiện tƣợng hình thành mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trƣờng không có chất điều hoà sinh trƣởng sau 2 tuần. Với 3 mg/l Adenin cây ghép có tác dụng ngƣợc lại. Hiện tƣợng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép  Tuổi của gốc ghép Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhƣng ngƣợc lại do vỏ dầy cứng nên giữ đƣợc mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi ghép. Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn thƣơng cành ghép. Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm. Các tác giả đã chứng minh rằng: Gốc ghép non, mắt ghép dễ bị mô sẹo hóa, khả năng nảy chồi thấp. Gốc già, mắt ghép khó liền, tỷ lệ mắt ghép nâu đen cao. Thích hợp nhất là từ 14 – 16 ngày tuổi của gốc ghép sau khi hạt nảy mầm. Kết quả cụ thể tính theo % ghép thành công là: 15,2; 16,6; 40,0; 37,1; 36,6; và 14,3% với tuổi gốc ghép tƣơng ứng là 10; 12; 14; 16; 18 và 20 ngày (17).  Độ lớn của mắt ghép Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trƣớc khi ghép. Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trƣởng độc lập cho đến khi chúng có kích thƣớc lớn hơn trƣớc khi chúng đƣợc ghép (17, 1). Khi thử với gốc ghép có độ tuổi thích hợp là 14 ngày, mắt ghép gồm 3 kích thƣớc tƣơng ứng với tỷ lệ thành công: 0,10 – 0,15 mm (2 mầm lá): 20% 0,20 – 0,30 mm (4 mầm lá): 30% 0,40 – 0,60 mm (6 mầm lá): 55% Nhƣ vậy, ghép mắt lớn dễ thành công nhƣng để đảm bảo tính sạch bệnh virus không nên dùng mắt ghép lớn hơn 0.5 mm. 22  Khử chồi phụ Trong nách lá mầm của gốc ghép có mắt ngủ, bình thƣờng thì bị ƣu thế ngọn ức chế. Khi ghép, chồi ngọn bị khử nên chúng phát sinh rất nhanh, gây ức chế phát triển của mắt ghép. Để tránh tình trạng này cần khử mắt chồi ngủ bằng cách khoét vào thân khi cắt bỏ hai lá mầm để loại chồi ngủ. Chồi ngủ cũng có thể phát sinh từ tƣợng tầng của mặt cắt trên gốc ghép, cần phải loại bỏ chúng ngay khi phát hiện để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh. 2.3.2.2 Chuyển cây ra vƣờn ƣơm Cây ghép trong ống nghiệm có bộ rễ tự nhiên rất khoẻ, vì vậy khi đƣa ra ngoài đất dễ sống. Cần lƣu ý rửa sạch môi trƣờng dinh dƣỡng để bộ rễ không bị nấm bệnh. Đất phân làm bầu nên khử trùng để tránh gây nhiễm bệnh và trồng ở khu vực cách ly tốt. 2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà thực vật học ngƣời đức Schleiden và Schwann đã đề xƣớng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều tế bào tạo thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, tế bào là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt là ngƣời đầu tiên đƣa các giả thuyết của Schlieden và Schwann vào thực nghiệm. Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt là Robbins đã lập lại thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo. Trong môi trƣờng lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trƣởng khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật, khi White nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopercium esculentum L.) với môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng, glucose và nƣớc chiết nấm men. Sau đó ít lâu White chứng minh là có thể thay thế nƣớc chiết nấm men bằng ba loại hỗn hợp vitamine nhóm B: Thiamine (B1), Pyridoxine (B6), và Nicotinic acid. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã đƣợc tiến hành ở nhiều loại cây khác nhau. Cũng trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tƣợng tầng một số cây gỗ. Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hoà sinh trƣởng (hormone) đầu tiên, acid – indol acetic (IAA) và đã kết tinh đƣợc chất này. 23 Năm 1939, Gautheret đã thành công trong duy trì sự sinh trƣởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trƣờng bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6 tuần 1 lần. Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trƣởng của nƣớc dừa trong nuôi cấy mô họ cà (Datura). Sau đó vào năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nƣớc dừa lên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã đƣợc nghiên cứu và tổng hợp thành công. Chất napthyl acetic acid (NAA) và chất 2,4 – dichloro phenoxy acitic acid (2,4 – D) đƣợc bắt đầu sử dụng để trừ cỏ lá rộng trong nông nghịêp. Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nƣớc dừa, 2,4 – D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào ở nhiều đối tƣợng thực vật trƣớc đó rất khó nuôi cấy. Năm 1954, Skoog tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã đƣợc để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trƣờng nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trƣởng trở nên rất rõ rệt. Năm 1955, chất này đƣợc xác nhận là 6-furfurylaminopurine và đƣợc Skoog đặt tên là kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, ngƣời ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hoá học tƣơng tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên đƣợc tách từ thực vật bậc cao là zeatin từ mầm ngô. Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại thì khi tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hƣớng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều loại cây trồng khác nhau và đóng góp rất lớn vào quá trình điều khiển sinh trƣởng phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật là nhân giống cây trồng. 2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật  Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Nuôi cấy mô sẹo  Nuôi cấy tế bào đơn và protoplast (tế bào trần)  Nuôi cấy hạt phấn 24  Nuôi cấy mô phân sinh  Nuôi cấy tế bào lát mỏng  Nuôi cấy hạt 2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về kỹ thuật vi ghép 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc Lê Trần Bình (1993), thực hiện thành công vi ghép trong nhân giống cam chanh. Đoàn Thị Ái Thuyền và Nguyễn Văn Uyển (1999), vi ghép thành công cây cam quýt. Kết quả đạt đƣợc qua 2 nghiên cứu trên nhƣ sau:  Cách ghép chữ T ngƣợc cho kết quả tốt nhất trong thực hiện vi ghép  Tuổi cây ghép từ 10 – 20 ngày sau khi nảy mầm là tuổi gốc ghép cho kết quả tốt nhất.  Mắt ghép càng lớn sẽ cho khả năng sống của cây ghép càng cao, mắt ghép có kích thƣớc từ 0,1 – 0,15 mm cho tỷ lệ thành công của cây ghép là 20%; mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,3 mm cho tỷ lệ thành công 30%; mắt ghép có kích thƣớc từ 0,4 – 0,6 mm cho tỷ lệ cây sống 55%.  Trong một tuần mắt ghép đã đạt kích thƣớc 1,2 – 2 mm và sau 4 tuần chồi ghép đã có kích thƣớc 15 x 20 mm, rễ của gốc cũng mọc thêm nhiều rễ phụ. Cây ghép có thể trồng ra đất đƣợc. Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam (1995) đã tiến hành vi ghép thành công cây thuộc họ citrus và tiến hành trồng thử nghiệm ở 6 tỉnh khác nhau. Gốc ghép thứ nhất là cây Troyer và đỉnh sinh trƣởng đƣợc ghép lên là các loại cây ăn quả có giá trị kinh tế. Cây ghép đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS lỏng với 7,5% đƣờng sau 40 – 60 ngày nuôi cây thì cây có từ 2 – 3 lá tuỳ theo giống, với cách ghép hình tam giác và đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,1 – 0,16 mm. Gốc ghép lần hai là gốc Volkameriana đƣợc gieo trên giá thể đất. Cây ghép lần hai đƣợc nuôi trong thời gian từ 4 – 6 tháng thì có thể đem trồng ra vƣờn đƣợc. Lê Thị Thu Hồng (1997) đã tiến hành vi ghép trên cây thuộc họ cam quýt và kiểm tra tính chất sạch bệnh của cây vi ghép, kết quả cho thấy 52/53 cây đem kiểm tra đều sạch bệnh. Từ nguồn vật liệu ban đầu đến năm 1998 đã sản xuất 5.755 cây sạch 25 bệnh trên gốc Volkameriana gồm 960 cây quýt Đƣờng, 880 cây quýt Tiều, 240 cây Cam ngọt và 525 cây bƣởi Năm Roi. 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc Năm 1952, Morel và Martin đã thành công khi tạo đƣợc cây sạch virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng từ chồi nhiễm virus. Roistacher, 1972 đã xử lý cành ghép ở 50 0 C bằng hơi nuớc nóng và loại bỏ đƣợc virus gây bệnh “nổ lá”, đồng thời ông cũng chứng minh đƣợc rằng có thể xử lý nhiệt để loại bỏ bệnh lùn cây không rõ nguyên nhân ở cam. Huang và Millikan, 1980; Ke và ctv 1993; Mantel và ctv, 1997; Navarro va Juarez, 1997; Perrin và ctv, 1994 đã ứng dụng thành công kỹ thuật vi ghép trên cây táo để tái sinh cây mới và tạo đƣợc cây sạch virus. Năm 1991, Navarro và ctv chứng minh rằng bệnh loét, bệnh greening và các dòng độc của virus tristeza đều có thể loại bỏ bằng kỹ thuật vi ghép. Năm 1992, Duran và cộng tác viên đã thành công khi tiến hành vi nhân giống và nuôi cấy mô cây cam ngọt. Năm 1995, Bowman đã thành công khi vi nhân giống gốc của cây citrus. Năm 1997, Turbull và ctv đã ứng dụng kỹ thuật vi ghép để kiểm tra khả năng tạo chồi trên cây thuộc họ Arabidopsis. Họ đã sử dụng kỹ thuật vi ghép đơn giản (1 gốc ghép – 1 chồi ghép) để kiểm tra sự tƣơng tác giữa gốc ghép với chồi ghép và kỹ thuật vi ghép hai chồi trên gốc để nghiên cứu tƣơng tác giữa hai chồi ghép với nhau. Qua nghiên cứu này, họ đã kết luận đƣợc rằng khả năng tạo chồi trên cây ghép do sự di chuyển từ gốc ghép sang chồi ghép và không có con đƣờng ngƣợc lại. Với phƣơng pháp vi ghép nhóm nghiên cứu có thể xác định những gen có liên quan đến các đặc tính của cây nhƣ thời gian ra hoa, hệ thống gen kháng và các phản ứng sinh học với stress. Cùng với kỹ thuật vi ghép này, A. Starrantino và ctv đã ứng dụng để phục hồi các cây citrus bị nhiễm bệnh virus bằng cách vi ghép đỉnh sinh trƣởng lên gốc đƣợc tạo từ hạt và thu đƣợc tỷ lệ sống 40%. Sau khi nghiên cứu các phƣơng pháp ghép khác nhau và dùng các chất kích thích tăng trƣởng họ đã cải thiện đƣợc tỷ lệ sống của cây vi ghép. Theo nhóm này nếu nhúng đỉnh sinh trƣởng và gốc ghép vào dung dịch 6-BAP ở 26 nồng độ 0.5 ppm trong 10 phút trƣớc khi ghép thì có thể nâng tỷ lệ sống của cây lên 73% – 91%, nhƣng thƣờng đạt 63%. Năm 1999, Carimi và ctv đã tái sinh đƣợc phôi vô tính và hình thành cây khi nuôi cấy lớp mỏng tế bào nhụy của cây citrus. Ở Jamaica, Potluri và Sasikala đã tiến hành ghép đỉnh chồi (0.1 – 1 mm) lên gốc cây kháng và đã thu đƣợc kết quả rất tốt. J. Dobranszki và ctv, 2000 đã nghiên cứu tìm ra phƣơng pháp làm tăng tỷ lệ sống của cây táo vi ghép và tạo đƣợc điều kiện duy trì sự tiếp xúc tốt giữa gốc và chồi ghép. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhúng mặt cắt của gốc ghép và chồi ghép vào hỗn hợp acid citric 0.15 mg/l, ascorbic acid 0.1 mg/l và gibberellic acid 0.1 mg/l trƣớc khi ghép sẽ tăng tỷ lệ sống của cây vi ghép lên đến 95%. Một kết quả khác của nhóm là chồi ghép trƣớc khi đặt vào vị trí ghép trên gốc ghép nếu đƣợc nhúng vào dung dịch agar 0.1% thì khả năng dính của chồi ghép vào gốc ghép tốt hơn, agar làm cho sự dung hợp giữa gốc và chồi ghép tốt hơn cây ghép thích nghi nhanh và đạt tỷ lệ sống 100%. Năm 2001, Emmarol E .Mneney và Sinclair H .Mantell đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây điều thu đƣợc kết quả tỷ lệ thành công của cách ghép là 60% - 80 %, vị trí ghép không có sự khác biệt nhau khi xét trên khă năng thành công. Đồng thời các nhà khoa học đã tìm ra nồng độ các chất khống chế hoạt chất phenol của cây điều: với 200 µM ascorbic acid cho tỷ lệ thành công là 73%, 2mg/l Diethyl – dithocarabamate (DIECA) cho tỷ lệ thành công 55% và 3% (w/v) Polyvinyl purrolidone (PVP) cho tỷ lệ thành công 41%. Năm 2002, A .Onay và ctv đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây đào lạc kết quả thu đƣợc tỷ lệ thành công khi ghép là 70% khi cây ở 1 năm tuổi và 90% cây sống khi đem ra ngoài trồng. Năm 2003, trƣờng đại học Rajshahi ở Bangladesh đã thành công khi tiến hành tái sinh cây bƣởi từ mô sẹo và kết quả thu đƣợc khi nuôi cấy trên môi trƣờng MS có chất kích thích sinh tƣởng BAP với nồng độ 1 mg/l kết hợp với NAA 5 mg/l cho khả năng hình thành mô sẹo tốt nhất và các cây đạt 95% sống khi trồng ra đất. Năm 2003, tổ chức FFTC (Food and fertilizer technology center) ở châu Á đã thành công khi vi ghép trong nhà kính tạo cây cam sạch virus ở tỉnh Nghệ An. 27 Tháng 3 năm 2004, trƣờng đại học của California đã thành công khi tiến hành ghép chồi lên gốc cây kháng và đã thu đƣợc kết quả rất tốt cũng nhƣ việc xác định ảnh hƣởng của 2,4 – D, ABA và kinetin lên sự hình thành mô sẹo. Năm 2003 Bash, Jonh và ctv đã dùng kỹ thuật vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt và hóa chất để tạo ra những cây citrus sạch bệnh. Kết quả đã tạo ra những cây citrus sạch bệnh mặc dù trƣớc đó họ đã dùng các đỉnh sinh trƣởng dƣơng tính với Citrus Tristeza Virus. . A : Gốc ghép đƣợc cắt chữ T B : Lấy mắt ghép từ cành ghép C : Mắt ghép đã sẵn sàng để ghép D : Mắt ghép đƣợc ghép vào vết cắt E : Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.1 7: Cách ghép.    Ghép chữ T B C D A: Gốc ghép B: Gốc ghép đƣợc tạo “cửa sổ” C: Mắt ghép đƣợc đặt vào “cửa sổ” D: Dùng dây buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.1 6: Cách ghép cửa sổ. lát mỏng  Nuôi cấy hạt 2 .4 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về kỹ thuật vi ghép 2 .4. 1 Nghiên cứu trong nƣớc Lê Trần Bình (1993), thực hiện thành công vi ghép trong nhân giống cam chanh.