Tổng quan về cây thuốc lá

Tổng quan về cây thuốc lá

1 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu trong suôt quá trình hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè nhứng người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 05 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid Bp Base pair dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus IAA Indolaxetic Acid NAA α- naphthalenneacetic Acid PVY Ptato virus TMV Tobacco Mosaic virus CMV Cucumber Mosaic virus MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog BAP 6- benzenladenine Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase RM Môi trƣờng ra rễ RNAi RNA interfence X-gluc 5-bromo-4- chloro-3- indolyl glucuronide EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid 3 MỞ ĐẦU Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy, thuốc lá là một trong những đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tƣợng chuyển gen. Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus) và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc ta. Những phƣơng pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá nhƣ sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng .). Tuy nhiên, những biện pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà ngƣời ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực vật. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phƣơng pháp chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bƣớc đầu phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR 4 Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1. Phân loại Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana.sp thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana có 50- 70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ. Căn cƣ́ và o hì nh thá i, màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính: - Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tƣơi . Đây là loạ i phổ biế n nhấ t chiế m 90% diệ n tí ch thuố c lá trên thế giớ i. - Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiế m 10% diệ n tí ch thuố c lá trên thế giới. - Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng , phớ t hồ ng hay tí m . Thƣờ ng chỉ có trong vƣờ n thƣ̣ c vậ t phụ c vụ nguồ n dƣ̣ trƣ̃ gen cho lai tạo, ít đƣợc dng trong sản xuất. - Loài Nicotiana polidiede L. : có hoa màu trắng. Loài này cng ít đƣợc dng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số quố c gia. 5 Hình 1.1: Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) Trên thế giới cây thuốc lá đƣợc trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lƣợng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nƣớc Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ.Tại Việt Namcây thuốc lá đƣợc canh tác từ Bắc chí Nam, chủ yếu ở các tỉnh sau: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Dak Lak (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam). 1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trƣờng thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tƣ 6 nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá nhƣ phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [10], [15].Trồng thuốc lá có hiệu quả cao hơn nhiều so với các loại cây trồng khác (1000- 1200 USD/ tấn lá khô) [8]. Các hãng sản xuất thuốc lá của các nƣớc tƣ bản đều nhận đƣợc nguồn lợi nhuận khổng lồ từ cây thuốc lá. Ở nƣớc ta, cây thuốc lá cng mang lại giá trị kinh tế cao, sử dụng hiệu quả đất đai, góp phần tạo công ăn việc làm, tận dụng đƣợc nguồn lao động của địa phƣơng, tăng thu nhập cho ngƣời lao động. Lợi nhuận cao từ sản xuất thuốc lá đã sự quan tâm của nhiều cấp chính quyền trong cả nƣớc, tại một số tỉnh miền núi phía Bắc nhƣ Cao Bằng, Lạng Sơn, . cây thuốc lá đã nằm trong cơ cấu cây trồng truyền thống, thực sự mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tại An Giang nhờ vào cây thuốc lá nên giải quyết đƣợc khoảng 200 lao động với thu nhập trung bình 30.000- 40.000 đồng/ ngày [49]. Năm 2010, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam đạt kim ngạch xuất khẩu trên 175 triệu USD, tăng 17% so với năm 2009. Xuất siêu gần 54 triệu USD, nộp ngân sách vƣợt mốc 5.000 tỉ đồng, tăng 6% so với năm 2009 [47]. Đời sống, việc làm và thu nhập của ngƣời lao động đƣợc bảo đảm ổn định. Đối với ngành công nghệ sinh học cây thuốc lá đƣợc sử dụng nhƣ thực vật mô hình cho những nghiên cứu cơ bản cng nhƣ ứng dụng nhờ khả năng dễ dàng tiến hành nuôi cấy in vitro và chuyển gen [26]. 1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam Là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao hiện thuốc lá đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc. Diện tích trồng thuốc lá năm 2008 khoảng 25.000 ha. Theo định hƣớng của chính phủ, dự kiến diện tích trồng thuốc lá năm 2010 là 39.200 ha và phát triển ổn định tới năm 2020 là 40.300 ha [50]. Theo đánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của 7 nƣớc ta có chất lƣợng tƣơng đối tốt, có thể thay thế đƣợc nguyên liệu Trung Quốc. Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá là đơn vị đi đầu trong nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá đã phát triển sản xuất đại trà các giống thuốc lá K326, C9-1, K176 đồng thời sản xuất thử nghiệm thành công một số giống lai nhƣ VTL1H, VTL5H tại vùng núi phía Bắc (theo báo cáo Văn phòng chƣơng trình KC06) hay khảo nghiệm một số giống nhƣ RGH04, PVH09, PVH51 trên khu vực đất cát ở Gia Lai. Những nghiên cứu của Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá cho thấy sự quan tâm của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam trong công tác phát triển giống mới nhằm thúc đẩy sự phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại nƣớc ta. Đặc thù của sản xuất thuốc lá điếu là phải có sự phối trộn nhiều loại nguyên liệu thuốc lá từ các vng khác nhau để tạo nên tính phong phú của sản phẩm. Hàng năm, ngành thuốc lá vẫn phải nhập khẩu một lƣợng đáng kể nguyên liệu từ các nƣớc trên thế giới và nguyên liệu trong nƣớc cng đƣợc xuất khẩu với số lƣợng đến chục ngàn tấn. Sản xuất thuốc lá vẫn là một lĩnh vực kinh tế cần thiết khi ngành thuốc lá Việt Nam đóng góp cho ngân sách Nhà nƣớc trên bảy ngàn tỷ đồng mỗi năm. Hút thuốc lá có ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu dng nên nhà nƣớc có chủ trƣơng hạn chế sản xuất thuốc lá điếu cho tiêu thụ nội địa. Hiện nay thuốc lá nguyên liệu sản xuất trong nƣớc chƣa đáp ứng đủ nhu cầu cho các nhà máy thuốc điếu, mặt khác nhu cầu nguyên liệu cho xuất khẩu khá lớn nên Chính phủ khuyến khích phát triển sản xuất nguyên liệu trong nƣớc. Chiến lƣợc phát triển Ngành thuốc lá Việt nam đến năm 2020 đã đƣợc Chính phủ phê duyệt, trong đó nhấn mạnh chủ chƣơng phát triển thuốc lá nguyên liệu để hạn chế nhập khẩu, tăng cƣờng xuất khẩu, tạo công ăn việc làm và nâng cao hiệu quả kinh tế cho nhà nông [50]. Vùng trồng thuốc lá của Việt Nam tập trung chủ yếu tại các tỉnh miền núi, nên việc phát triển trồng thuốc lá tại đây sẽ hiện thực hoá chủ trƣơng của Đảng và Nhà nƣớc “Xóa đói, giảm nghèo” cho đồng bào các dân tộc miền núi. Chín tỉnh trồng thuốc lá tập trung tại Việt Nam (gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái 8 Nguyên, Bắc Giang, Gia Lai, Đắc Lắc, Ninh Thuận Bình Thuận và Tây Ninh) do tổng công ty hỗ trợ phát triển đã chiếm hơn 90% diện tích vùng trồng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam. Trong những năm qua, Tổng công ty cng đã không ngừng mở rộng thị trƣờng xuất khẩu thuốc lá nguyên liệu và thuốc điếu với giá trị kim ngạch xuất khẩu năm 2008 đạt trên 80 triệu USD. 1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá Trong sản xuất nông nghiệp thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất lớn. Đối với cây hàng năm, sự thiệt hại thể hiện qua việc giảm năng suất hoặc gây mất mùa toàn bộ trong vụ. Đối với cây lâu năm, cây thân gỗ bệnh virus không những làm giảm chất lƣợng và năng suất ngay đối với cây bị nhiễm bệnh mà, mà còn có nguy cơ lây lan cho các cây khỏe mạnh những năm sau [1]. Hiện nay, có khoảng hơn 2000 loại virus thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, trong số đó khoảng mộ t nƣ̉ a là nh ững loài gây hại chính cho cây trồng. Mức độ thiệt hại do các bệnh virus gây ra cho cây trồng là rất nghiêm trọng, có thể lên tớ i 95 - 100%. Sự thiệt hại không những chỉ dừng ở mức độ suy giảm về năng suất mà còn ảnh hƣởng cả đến chất lƣợng sản phẩm thu hoạch [2]. Riêng đối với cây thuốc lá thiệt hại về kinh tế do virus gây ra ở thuốc lá khá lớn lên tới hàng chục tỷ đồng [40]. Bệnh virus không những làm giảm năng suất, chất lƣợng cây thuốc lá, mà còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau. Mặt khác,virus không thể tiêu diệt, phòng trừ nhƣ những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng tích ly dần dần trong cây và làm thoái hoá giống [3]. Một số loại bệnh virus trên cây thuốc lá 9 Bảng 1.1: Bệnh virus trên thuốc lá [52] Tên bệnh Tên virus gây bệnh Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus( virus khảm linh lăng) Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus ( virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần) Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá) Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dƣa chuột) Vàng hoại tử rau diếp Vàng hoại tử rau diếp(trong Nicotiana glutinosa) Còi cọc cây lạc Peanut stunt virus Bệnh hình hoa hồng Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus ( virus gây bệnh biến dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus( virus gây đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc lá Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn thuốc lá) Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus( virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh) Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá) Bung hạt thuốc lá Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc lá Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua) Viền gân lá Potato virus ( virus Y khoai tây) U vết thƣơng Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thƣơng) 10 1.2.2. Bệnh khảm lá do virus Bệnh khảm lá do virus gây ra là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của lá thuốc, nhất là đối với thuốc lá sợi vàng. Bệnh còn có tên là bệnh “hoa lá vàng”. Bệnh nặng và phân bố rộng ở nhiều nơi và vào bất kỳ ma vụ nào trong năm [3]. Bệnh xuất hiện càng sớm thì càng ảnh hƣởng đến năng suất, tỉ lệ phục hồi hoàn toàn khá thấp (2,3- 5,2%). Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thƣờng bị tác hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy, lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mi vị thơm ngon và hút nặng. Biểu hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại biến thành dạng khảm. Trên bề mặt của lá có biểu hiện của các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt. Ngoài ra còn có các biểu hiện khác nhƣ: phiến lá nhăn nheo, lồi lõm do các gân lá bị kìm hãm sinh trƣởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thƣớc lá bị thu nhỏ lại. Ngoài đồng, đôi khi cây bệnh ở dạng tiềm ẩn (không biểu lộ triệu chứng ra ngoài) ở các mức độ khác nhau [3]:  Ẩn bệnh toàn phần: cây hoàn toàn không biểu lộ triệu chứng;  Ẩn bệnh cục bộ: chỉ có vài triệu chứng ở lá ngọn nhƣng không tiêu biểu lắm;  Ẩn bệnh tạm thời: chỉ biểu lộ triệu chứng ở giai đoạn sau của bệnh;  Ẩn bệnh vĩnh viễn: không biểu lộ triệu chứng trong suốt giai đoạn cây phát triển. [...]... chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh 3.1.2.2 Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Những nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA,... sung vào môi trƣờng nhằm loại bỏ vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh lá Thí nghiệm chuyển gen gus vào cây thuốc lá C9-1 đƣợc lặp lại 2 lần, mỗi lần với 30 mảnh lá nguyên liệu Sau 10 ngày tại những vết cắt ở các mảnh lá xuất hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá ( hình 3.1) Theo nghiên cứu trƣớc về quá trình tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi [8][7] Kinetin là chất điều... bề mặt các hạt thuốc lá Các cây con sau khoảng 4 tuần trên môi trƣờng MS có kích thƣớc lá từ 46cm là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tái sinh và chuyển gen ở cây thuốc lá 3.1.2 Chuyển gen và tái sinh cây 3.1.2.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã đƣợc Vân và cộng sự [12][13] thiết lập Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc... vào thuốc lá nhằm đánh giá hiệu quả của quy trình tái sinh và chuyển gen vào thuốc lá theo phƣơng pháp của Banerjee và cộng sự [12] có cải tiến Đây là tiền đề để tiến hành chuyển cấu trúc TMV-RNAi 28 3.1.1 Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen Theo Banerjee và cộng sự [12], mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để chuyển gen vào cây thuốc lá Để tạo đƣợc nguồn nguyên liệu, hạt thuốc lá. .. Mẫu lá bị bệnh đƣợc nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong 20 ml buffer) với pH = 7 26 - Lá lây nhiễm đƣợc gây tổn thƣơng nhẹ bằng SiC - Cho dịch virus lên phần lá đã gây xƣớc, sau vài phút rửa lá bằng nƣớc 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, quan sát và đánh giá triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1... vật, ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm Với 30mảnh lá /lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 2 lần) thu đƣợc trung bình 24,5± 2,12 mảnh lá có cảm ứng, đạt tỷ lệ khoảng 81,6± 7,07 (bảng 3.1) Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng đƣợc thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1trực tiếp lên môi trƣờng GM và GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc Toàn bộ mảnh lá không... để tạo cây trồng với những tính trạng mong muốn Để có thể chuyển các gen mong muốn vào cây trồng, trƣớc tiên phải xây dựng đƣợc tái sinh cây hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả Tại Việt Nam, hệ thống tái sinh và chuyển gen chỉ thị gus mới chỉ đƣợc nghiên cứu trên giống thuốc lá K326 [8][7] mà chƣa đề cập tới giống C9-1 Giống thuốc lá C9-1 đƣợc Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá lai... sang môi trƣờng ra rễ (MS+0,1mg/l NAA) - Cây rễ hoàn chỉnh 4-5 tuần tuổi đủ điều kiện để chuyển sang trồng trong bầu trấu-cát (tỷ lệ 1: 1) 33 A B D C E F G H I Hình 3.1 Kết quả chuyển gen gus vào cây thuốc lá A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn B: Mảnh lá được đặt trên môi trường cảm ứng C: Mảnh lá bắt đầu cảm ứng sau 10 ngày quan sát D: Các mảnh lá không biến nạp đặt trên môi truong bổ sung... trên môi trường chọn lọc F: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ 34 G: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu H: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu cát: trấu I: Cây trồng trong điều kiện nhà lưới sau 2 tuần 3.1.3 Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào Lấy phần ngọn thân mần của 8 cây thuốc lá sinh trƣởng trên môi trƣờng có chứa kanamycine chọn lọc ngâm trong dung... ẩn bệnh có thể giải thích do do cây bị nhiểm bệnh vào giai đoạn trƣởng thành nên TMV không kịp gây ra triệu chứng Tuy nhiên năng suất và phẩm chất thuốc vẫn bị ảnh hƣởng nghiêm trọng Chỉ có thể phát hiện đƣợc cây ẩn bệnh bằng phƣơng pháp phản ứng huyết thanh Ngoài ra, trong điều kiện nóng (>30 oC), cây cũng dễ bị mất triệu chứng Hình 1.2: Bệnh khảm lá trên cây thuốc lá TMV và CMV là hai loại virus . đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc lá Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn thuốc lá) . vòng thuốc lá) Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)