ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA XÉT NGHIỆM HIV ……… , tháng … năm ……. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA XÉT NGHIỆM HIV Cấu trúc virus HIV HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3lớp. 1. Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú. Đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần: + Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân töû là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh. + Glycoprotein: xuyên màng có trọng lượng phân töû 41 kilodalton. 2. Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein: + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18). + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS 3.Lõi: Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm: + Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom). Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là cac gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuûa virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV. Nguyên lý của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV 1.elisa gián tiếp Kháng thể kháng HIV có trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virút HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (các giếng phản ứng trên phiến nhựa). Phức hợp kháng nguyên -kháng thể này được nhận biết đặc hiệu bởi một cộng hợp là một kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. 2.elisa cạnh tranh Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng thể kháng HIV có trong mẫu thử với cộng hợp là kháng thể kháng HIV đã gắn với enzyme để được gắn lên các kháng nguyên đã cố định trên giếng. Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể trong mẫu thử. 3.sanwich elisa Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virút gắn enzyme. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. 4. các thế hệ sinh phẩm Sinh phẩm thế hệ thứ nhất sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với HIV. Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế. Sinh phẩm thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp hoặc protein tổng hợp. Sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Sinh phẩm thế hệ ba xử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp và các proteine tổng hợp nhưng kháng thể được phát hiện theo nguyên tắc ELISA sandwich. Độ nhạy và độ đặc hiệu được cải thiện rõ rệt. Sinh phẩm thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu thử. Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyền máu. Các sinh phẩm ELISA ngày càng được hoàn thiện để có thể phát hiện sớm và chính xác kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết thanh. Các sinh phẩm dùng các kháng nguyên có các epitop tạo ra các kháng thể sớm và có các loại kháng nguyên cho phép phát hiện kháng thể kháng virút HIV 1 & 2, các thứ type virút và các virút HIV nhóm O. 5. ưu điểm phương pháp elisa - Cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu. Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm. - Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của người làm xét nghiệm. - Có thể lưu các bảng kết quả và các thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm. - Giá thành xét nghiệm tương đối rẻ. 6.nhược điểm - Cần có sự đầu tư cho trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy móc. - Các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-8 0 C) - Thời gian thực hiện xét nghiệm 2-3 giờ - Không thích hợp cho những nơi số lượng mẫu ít do phải làm nhiều chứng 7. Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV NGUYÊN TẮC : - Là phản ứng ELISA “Sandwich “ một bước. - Kháng nguyên gắn trên giếng là các protein vỏ gp160 của HIV-1 và ANT70 (nhóm O); gp36 của HIV2 - Nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng. Đồng thời khối cầu cộng hợp là kháng nguyên HIV gắn men cũng có sẵn trong mỗi giếng sẽ tạo phức hợp kẹp chả: Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp. - Phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp sẽ được phát hiện bằng phản ứng hiện màu với cơ chất Quy trình thực hiện - Lấy máu=> huyết thanh của một người được pha loãng ra 400 lần=> cho vào đĩa mà kháng nguyên HIV đã được cố định=> rửa giải các thành phần khác trong huyết thanh => nếu huyết thanh có kháng thể hiv sẽ giữ lại => một kháng thể thứ cấp đặc hiệu với kháng thể HIV được cho và đĩa => rửa giải kháng thể thứ cấp có gắn enzyme sẽ được giữ lại nếu bề mặt có kháng thể HIV => cho cơ chất đặc hiệu với enzyme của kháng thể thứ cấp => đo OD => so sánh kết quả này với mẫu huyết thanh người bình thường . ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA XÉT NGHIỆM HIV ……… , tháng … năm ……. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA XÉT NGHIỆM HIV Cấu trúc virus HIV HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae thực hiện xét nghiệm 2-3 giờ - Không thích hợp cho những nơi số lượng mẫu ít do phải làm nhiều chứng 7. Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV NGUYÊN TẮC : - Là phản ứng ELISA “Sandwich. type virút và các virút HIV nhóm O. 5. ưu điểm phương pháp elisa - Cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu. Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót và