Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA ppt

CHƯƠNG VI CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA Các khái niệm cơ bản Việc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như Taq đã giúp cho Kary Mullis đoạt giải Nobel 1993. PCR (polymerase chain reaction) phản ứng chuổi polymerase bao gồm: 1- Biến dây đôi thành dây đơn 2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. 3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) Các khái niệm cơ bản Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA Taq (Thermus aquaticus) • Taq là vi khuẩn có tính chịu nhiệt • Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. • Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn Deoxynucleotide triphosphate • Hàm lượng deoxynucleotide trong khoảng 20 đến 200mM cho kết quả ổn định, trung thực, và chuyên tính. • Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó. Magnesium chloride Nồng độ Mg 2+ có thể ảnh hưởng đến : • Quá trình anneling của primer. • Nhiệt độ để tháo dây thành dây đơn. • Sự chuyên tính của sản phẩm PCR. • Hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả. PCR sẽ cần một hàm lượng Mg từ 0,5 đến 2,5mM ứng với hàm lượng tổng số dNTP đã cho. Cặp mồi primer RAPD: Chiều dài ngắn 10-16 mer Ti thể, microsatellite dài 20-24 mer Nồng độ cao không những không cần thiết mà tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimers, và hiện tượng priming nhằm Nhiệt độ annealing Td = 4 (G + C) + 2 (A + T) đối với primer có khoảng 20 oligonucleotide Số base càng ít, nhiệt độ càng thấp, và ngược lại Phản ứng dung dịch đệm Tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Nồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi. [...]... 2004) Vật liệu chọn giống cá Tra: - Phân tích biến dị RAPD (31 primer), mtDNARFLP (20 enzyme giới hạn), microsattlite (10 primer đặc trưng cá tra) - Phân tích trên 4 quần đàn cá tra: 3 quần đàn trại giống, 1 quần đàn tự nhiên - Kết quả: + Các quần đàn có đa dạng di truyền cao + Quần đàn tự nhiên đa dạng hơn cả Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta: (Tun, 2004) Vật liệu chọn giống tôm sú: - Phân tích biến... tôm sú Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra: - Phân tích đa hình AFLP, sử dung 69 cặp mồi - Phân tích trên 2 nhóm cá kích thước lớn và kích thước nhỏ - Số băng có độ chênh lệch >50%: 4 - Số băng chênh lệch >50% tái lặp được: 3 - Giải trình tự 3 băng tái lặp: AFLP1, AFLP2 & AFLP3 Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra: AFLP1, đại diện nhóm... Đa hình về số phân đoạn nucleotide ngắn (2-6) lặp lại ở một locus Phng phỏp kinh in - Ly trớch DNA - Ct vi enzyme hn ch - Ni kt v chuyn i - Nuụi cy khun lc - Hybridise - Phõn lp plasmid - Chy trỡnh t - Thit k primer ISOLATION, CHARACTERISATION, AND AMPLIFICATION OF MICROSATELLITE MARKERS: PROTOCOL BREAKDOWN STRUCTURE DOT-BLOT: microsatellite presence/density (Facultative) Extract DNA Cut DNA with SAU... khụng nờn l GGG, CCC, TTT, AAA hoc T Ty th Ly trớch DNA PCR vi primer co trỡnh t ca cỏc gen trờn ty th in di Chy trỡnh t Phõn tớch s liu Tng th ca ty th RAPD DNA đa hình khuyếch đại ngẫu nhiên Ly trớch DNA PCR dựng cỏc primer ngn (9-12) in di Phõn tớch cỏc bng RAPD phn mm phõn tớch tớnh a hỡnh ứng dụng trong NTTS thế giới: Phân loại giống loài, bảo tồn quỹ gen (Capili ctv.; Sodsuk & ctv.)... dõy gc), trong ú Mg2+ úng vai co-factor ca Taq polimerase DNA template Khi khuych i vựng mc tiờu t dõy n DNA, s lng ca template c tớnh toỏn trờn c s mol Phộp tớnh ny giỳp chỳng ta xỏc nh s lng DNA cn phi cú, s chu k tng hp ra DNA vi s lng mong mun T l gia primer : template Nu t l ny quỏ cao, hin tng primerdimers s xut hin, ging nh trng hp mu DNA quỏ loóng nu t l ny quỏ nh, kt qu sn phm PCR khụng nhiu... Phương pháp Random Amplified Polymorphism DNA RAPD: DNA đa hình khuyếch đại ngẫu nhiên Phương pháp Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP: Đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế Phương pháp microsatellite: Đa hình về số phân đoạn nucleotide ngắn (2-6) lặp lại ở một locus microsatellite Phương pháp Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP: Đa hình chiều dài phân đoạn khuyếch đại Phương pháp Single... TTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCATTCNGGTAGGTCGT 5 Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra: Marker AFLP1 AFLP2 AFLP3 Nhóm cá lớn Nhóm cá Chênh lệch nhỏ 2 nhóm 38%(40/106) 73%(73/100) 35% 37,5%(39/10 71%(71/100) 33,5% 4) 94%(94/100) 2,0 96% (100/104) Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta: Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra: - Giải trình tự Intron 1 ở gen điều khiển GH - So sánh đột... & ctv.) Biến dị quần thể, vật liệu ban đầu chọn giống (Moore, Kate ctv., Piamsak & ctv.) Phát hiện tác nhân gây bệnh (Lo & ctv.;Lightner & ctv.; Fegan, Flegel & ctv.) QTLs (Hulata & ctv.;) Điều khiển giới tính (Brenden & ctv.; Kanokporn; Piamsak & ctv.)) Chuyển cấy gen (Hew & ctv.; Maclean & ctv.; Zhu & ctv.) Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta: Phân biệt giống loài, bảo tồn quỹ gen: - Khác biệt lươn... (Tun, 2004) Vật liệu chọn giống tôm sú: - Phân tích biến dị RAPD (4 primer), mtDNA-RFLP (15 enzyme giới hạn), microsattlite (8 primer) - Phân tích trên 3 quần đàn tôm sú: miền trung, nam Bộ và nhập nội - Kết quả: + Các quần đàn có đa dạng di truyền cao + Tương đồng giữa tôm miền trung và nam bộ cao + Khi tạo vật liệu chọn giống nên sử dụng cả tôm nhập nội Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta Di truyền giới... nhóm cá lớn, cá nhỏ - Đa hình RFLP với AlwNI, BsmAI và MboII - Cá lớn cắt BsmAI: 95%(118/124) - Cá nhỏ không cắt BsmAI: 78% (92/118) Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta: Trợ giúp chọn giống màu thịt cá tra: - Phân tích RAPD: 10 primer - mtDNA-RFLP: 16 enzyme giới hạn - Microsattlite: 10 primer đặc trưng cá tra - Khác biệt về tần số, không thấy chỉ thị đặc trưng theo màu thịt  . CHƯƠNG VI CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA Các khái niệm cơ bản Việc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu. template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. 3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) Các khái niệm cơ bản Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối. là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Nồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của