môi trờng - Vách tế b o: Cấu tạo chủ yÕu tõ nucleoproteit, gåm hai chÊt chÝnh : lipoproteit v polysaccarit với chức bảo vệ hình dạng vi khuÈn v cã tÝnh b¸n thÊm c¸c chÊt ho tan hấp thụ v o thể, m ng tÕ b o chÊt d y tõ 50 – 100A0 (angstron), có chức : + Duy trì áp suất thẩm thấu tế b o + Bảo đảm viƯc chđ ®éng tÝch l chÊt dinh d−ìng tÕ b o v thải sản phẩm trao đổi chất ngo i tế b o + L nơi xảy trình sinh tổng hợp số th nh phÇn cđa tÕ b o v vá nhên + L n¬i chøa mét sè enzym cđa tÕ b o vi khuÈn TÕ b o chÊt cã cÊu t¹o d¹ng h¹t, tÕ b o chÊt cã nh©n tÕ b o không điển hình, ngời ta gọi l thể nhân khuếch tán, chủ yếu cấu tạo ADN Sợi ADN cã chiỊu d i gÊp 20 – 50 lÇn chiỊu d i tÕ b o vi khuÈn Ngo i ra, tế b o chất có hạt tế b o chất, hạt n y chủ yếu chứa đựng hệ thống men, đặc biệt l men oxy hoá - khử, xảy trình trao ®ỉi chÊt cđa tÕ b o vi khn Trong h¹t tế b o cha ARN, hoạt động giống nh phận sinh lợng tế b o thực vật Đa số lo i vi khuẩn hại có lông roi phát sinh từ tế b o chÊt ngo i, nã cã thÓ cã 1, từ đầu hay nhiều lông roi quanh v có lo i vi khuÈn kh«ng cã l«ng roi (Corynebacterium sepedonicum) Trong tÕ b o vi khuẩn có sắc tố ho tan hay không ho tan (carotenoide, fluorescein), nhờ khuẩn lạc vi khuẩn có m u v ng, trắng v môi trờng vi khuẩn phát triển có m u sắc khác III Đặc điểm sinh sản vi khuẩn gây bệnh hại Vi khuẩn hại sinh sản theo phơng thức vô tính : phân đôi tế b o, nên kiểu sinh sản đơn giản Trong năm gần đây, qua kết nghiên cứu ngời ta thấy vi khuẩn có hình thức sinh sản vô tính m tái tổ hợp (hình thức sinh sản hữu tính) Kết sinh sản hữu tính l tạo dòng vi khuẩn mới, có tính độc v tính gây bệnh thay đổi l m cho khả biến dị vi khuẩn xảy dễ d ng tự nhiên IV Đặc tính sinh lý sinh hoá vi khuẩn Vi khuẩn gây bệnh l bán ký sinh nuôi cấy sinh trởng, phát triển tốt loại môi trờng nhân tạo dùng vi khuÈn häc Trư ng ñ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 86 Tuy phụ thuộc v o yếu tố định, nh−ng nãi chung sù sinh tr−ëng v sinh s¶n cđa vi khuẩn bệnh bắt đầu 100C, nhiệt độ tối thích 25 300C, ngừng sinh sản 33 400C Nhiệt độ gây chết 40 500C (trong 10 phút) Khác với loại nấm bệnh, để sinh trởng v sinh sản, vi khuẩn bệnh đòi hỏi môi trờng trung tính - kiềm yếu, thích hợp pH Phần lớn vi khuẩn bệnh l háo khí cần oxy nên phát triển mạnh bề mặt môi trờng đặc môi trờng lỏng giầu oxy nhờ lắc liên tục máy lắc Một số khác l loại yếm khí tự dễ d ng phát triển bên chất (mô cây) oxy Vi khuẩn gây bệnh l sinh vật dị dỡng nguồn cácbon v nguồn đạm Cho nên để phát triển, vi khuẩn cần nhận đợc lợng thông qua đờng phân giải chất hữu có sẵn nh protein v polysaccarit Phân giải nguồn cácbon (đờng, gluxit) tạo axit v khÝ Tuú theo lo¹i vi khuÈn cã cờng độ hoạt tính mạnh, yếu khác trình phân giải n y m ngời ta coi l tiêu để giám định lo i vi khuẩn Trong pha sinh sản vi khuẩn gây bệnh môi trờng lỏng pha tăng trởng số lợng (pha log) bắt đầu sau – giê sau cÊy truyÒn v pha ổn định số lợng sau 24 28 Trên môi trờng đặc (agar) vi khuẩn sinh trởng tạo th nh khuẩn lạc Khuẩn lạc có hình dạng, kích thớc, m u sắc, đặc thù bề mặt, độ láng bóng, v.v khác nhau, đặc trng cho nhóm, lo i vi khuẩn khác Nói chung vi khuẩn bệnh cây, phân biệt ba dạng khn l¹c chđ u nh− sau: D¹ng S: khn l¹c nhẵn, láng bóng bề mặt, rìa nhẵn Dạng R: khuẩn lạc sù sì, bề mặt mờ không nhẵn bóng, rìa răn reo Dạng M: khuẩn lạc nhầy nhớt Trong trình sinh trởng phát triển, vi khuẩn bệnh có khả tạo th nh sắc tố tuỳ theo lo i vi khn S¾c tè cđa vi khn l hợp chất có đạm (nitơ) tạo quan m u chromophore vách tế b o Có nhiều loại sắc tố có m u kh¸c nhau: m u xanh lơc (fluorescein), m u xanh lơ (pyocyanin), m u đỏ (prodigiosin), m u v ng (carotenoit), m u ®en (melanin, tyrosin) Trong sè n y, có loại sắc tố thẩm thấu khuếch tán v o m«i tr−êng l m biÕn m u m«i tr−êng nhân tạo nuôi cấy vi khuẩn nh sắc tố flourescein lo i Pseudomonas syringae Cũng có loại sắc tố không thẩm thấu, không khuếch tán v o m«i tr−êng m ë tÕ b o chÊt l m khuẩn lạc có m u nuôi cấy môi trờng đặc nh sắc tố v ng carotenoit lo i Xanthomonas Để tạo th nh sắc tố, vi khuẩn cần chất dinh dỡng môi trờng khác nhau, cần nguồn đạm nitơ, số chất khoáng kim loại Fe, Cu, v.v v cần độ pH ổn định Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 87 S¾c tè cã vai trò hô hấp, trình oxy hoá khử, trao đổi chất vi khuẩn Sắc tố có vai trò bảo vệ, chống tác động có hại ánh sáng tia tím có vai trò nh chất có hoạt tính kháng sinh, đối kháng, v.v Một đặc điểm sinh lý v tính gây bệnh vi khuẩn l khả sản sinh v hoạt động hệ thống enzyme v độc tố Quá trình trao đổi chất phức tạp tế b o vi khuẩn (sơ đồ) điều khiĨn bëi nh÷ng enzyme (men) nh− photphorilaza, transferaza, decacboxylaza, oxydaza, dehydrogenaza, hydraza,v.v… chøa ë ribos«m, m ng tÕ b o chất, vách tế b o ,v.v Nhiều loại enzyme l ngoại men vi khuẩn tạo ra, tiÕt ngo i v o m«i tr−êng sèng ®−ỵc coi nh− l vị khÝ quan träng cđa kÝ sinh vật, nhờ m xâm nhiễm v o để vợt qua đợc chớng ngại vật tự nhiên (biểu bì, cutin, vách tế b o thực vật), để chuyển hoá hợp chất hữu phức tạp th nh dạng đơn giản dễ hấp thụ sử dụng cho vi khuẩn v để trung ho vô hại hoá chất đề kháng chống lại kí sinh vật Sơ đồ chuyển hoá chất dinh dỡng vi khuẩn Tăng sinh khối Chất dự trữ TÕ b o vi khn C¸c chÊt dinh d−ìng hÊp thụ Trao đổi lợng Sản phẩm trung gian Axít hữu v.v CO2 Sản phẩm Trung gian dị hoá Enzym e Axit amin Độc tố Indol H2S v.v Các men phân giải pectin mảnh gian b o nh pectinaza, protopectinaza, polygalacturonaza, có hầu hết vi khuẩn hại cây, hoạt tính mạnh biểu lo i vi khuẩn gây bệnh thối rữa Đối với lo i vi khuẩn gây bệnh héo (Ralstonia solanacearum), men pectinmethylesteraza phân giải pectin sinh axit pectinic mạch dẫn kết hợp với Ca tạo th nh pectat canxi vít tắc lu thông bó mạch, góp phần tạo triệu chứng héo đột ngột bệnh Tr ng ủ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 88 Nhiều loại enzyme cutinaza (phân giải cutin), hemixenlulaza, xenlulaza (phân giải xenlulo) phổ biến vi khuẩn, ®Ỉc biƯt l vi khn Xanthomonas campestris (bƯnh thèi bã mạch cải bắp), Corynebacterium sepedonicum (bệnh thối vòng củ khoai tây) Nhiều loại enzyme (men) thuỷ phân chuyển hoá hợp chất phức tạp tế b o th nh hợp chất đơn giản dễ sử dụng cho vi khuÈn nh− amilaza, invertaza, β Glucosidaza, lactaza v c¸c enzyme phân giải protein v peptit nh proteaza, peptidaza, amidaza, men phân giải chất béo nh lipaza, v.v Th nh phần v hoạt tính loại enzyme nói khác tuỳ theo lo i vi khuẩn Cho nên hệ thống enzyme v sản phẩm phân giải tạo tác động enzyme vi khuẩn có khác biệt đ đợc sử dụng nh tiêu sinh hoá quan trọng để phân định lo i vi khuÈn Cã lo i vi khuÈn nhê enzyme riêng biệt phân giải gelatin, khử nitrat (NO3) t¹o th nh nitrit (NO2) Cã lo i vi khuÈn phân giải protein hay peptone tạo sản phẩm phân giải l indol hay ammoniac (NH3) khÝ sulfua hydro (H2S), cã lo i vi khuÈn cã thể phân giải hợp chất cacbon nh loại đờng (glucoza, saccaroza, lactoza, maltoza, v.v) tạo sản phẩm axit hay khí khả Tóm l¹i, vi khn nhê cã mét hƯ thèng enzyme phong phú đảm bảo đợc chất dinh dỡng cần thiết v trình trao đổi chất tế b o vi khuẩn m có tác dụng phá huỷ cấu trúc mô v trao đổi chất bình thờng tế b o nh hoạt động cđa hƯ thèng enzyme c©y ký chđ Vi khn bƯnh sản sinh độc tố Độc tố vi khuẩn có tác động phá huỷ hệ thống enzyme cđa tÕ b o c©y ký chđ v g©y tác hại lớn đến chức sinh lý v trao đổi mô thực vật Có thể phân chia loại độc tố vi khuẩn th nh hai nhóm: nhóm pathotoxin v nhóm vivotoxin Các loại độc tố pathotoxin có tính đặc hiệu theo lo i ký chủ v có vai trò lớn việc tạo triệu chứng bệnh Đó l loại độc tố tabtoxin, phaseolotoxin, syringomycin l chất peptit, dipeptit, tripeptit, có tác động ức chế enzyme tổng hợp glutamine, l m đình trệ tổng hợp diệp lục, phá vỡ phản ứng tự vệ nh phản ứng siêu nhậy chống lại vi khuẩn gây bệnh (Pseudomonas syringae pv tabaci, v.v) Các loại độc tố thuộc nhóm vivotoxin l nh÷ng polysaccarit (Pseudomonas solanacearum, Xanhthomonas sp.) amylovorin (Erwinia amylovora) glucopeptit (Corynebacterium sp.) Đây l độc tố gây héo cây, tác động phá huỷ m ng tế b o, mạch dẫn trồng Để nghiên cứu sinh lý, sinh hoá v đặc điểm sinh trởng vi khuẩn ngời ta cần phân lập khiết lo i vi khuẩn riêng biệt môi trờng dinh dỡng nhân tạo, nuôi cấy chúng môi trờng đặc lỏng Tr ng ủ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 89 Môi trờng phân ly nuôi cấy vi khuẩn Để phân lập, nuôi cấy vi khuẩn từ mô thực vật bị bệnh việc nghiên cứu chẩn đoán, giám định vi khuẩn v đặc điểm sinh lý, sinh hoá chúng, ngời ta thờng dùng nhiều loại môi trờng dinh dỡng nhân tạo khác tuỳ theo loại vi khuẩn v mục tiêu nghiên cứu Phổ biến l môi trờng bán tổng hợp v môi trờng tổng hợp (hoá chất) Các loại môi trờng điều chế đợc khử trùng triệt để cách hấp vô trùng nồi hấp nhiƯt ®é 1210C, – 1,5 atm 15 – 30 M«i tr−êng PSA (Pepton-saccaro-agar) Pepton 10 g Saccarose 10 g Glutamat natri 1g Agar 17 - 20 g Nớc cất 1000 ml Môi trờng PPSA (Potato-pepton-saccaro-agar) Khoai tây gät vá 200 g Pepton 10 g Saccarose 10 g Agar 20 g N−íc cÊt 1000 ml M«i tr−êng PGA (Potato - glucose-agar) Khoai t©y 200 g Glucose (dextrose) Agar N−íc cÊt 20 g 20 g 1000 ml M«i tr−êng Ayers (thử phản ứng tạo axit từ loại đờng cần thiết cho thêm v o) KCl 0,2 g MgSO4.7H2O 0,2 g NH4H2PO4 1g Agar 12 g N−íc cÊt 1000 ml Bromothymol xanh ml (dung dÞch cån 1,6%) Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 90 M«i tr−êng chän läc King’B (Vi khuÈn cã s¾c tè flourescein (Pseudomonas sp.) Glycerin 15,0 ml K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Bacto peptone 20 g Agar 17 g N−íc cÊt 1000 ml pH 7,2 M«i tr−êng chän läc PPGA + 0,1% CaCl2 (Pseudomonas glumae), (Matsuda, 1988) K2HPO4 0,5 g CaCl2 1,0 g NaCl 3,0 g Na2.HPO4 3,0 g Glucose 5,0 g Pepton 5,0 Agar 20,0 g Khoai t©y 200 g N−íc cÊt 1000 ml Môi trờng Wakimoto cải tiến (Xanthomonas oryzae) Bactopepton 5,0 g Nitrat canxi 0,5 g Phèt ph¸t natri 0,8 g S¾t sunfat 0,05 g Saccaro 20,0 g Agar 17 – 20 g N−íc cÊt 1000 ml V TÝnh biÕn dÞ di truyền vi khuẩn Sự tăng sinh khối vi khuẩn bệnh đợc tiến h nh chủ yếu sinh sản vô tính theo phơng thức phân đôi tế b o mĐ th nh hai tÕ b o míi nh nhờ hoạt động cấu trúc mezosôm (mesosome) tạo th nh m ng ngăn ngang tế b o phân tách vi khuẩn th nh hai tÕ b o míi Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 91 Tuy nhiên, nh sinh vật khác, vi khuẩn bệnh luôn có biến đổi tính trạng tác động thay đổi yếu tố nội bên có cấu trúc gen di truyền v yếu tố bên ngo i l yếu tố sinh thái, môi trờng sống Những biến đổi di truyền l m cho lo i vi khuẩn có thêm tính trạng số tính trạng cị gäi l tÝnh biÕn dÞ cđa vi khn BiÕn dị di truyền l đờng dẫn tới hình th nh xuất dạng mới, chủng sinh lý mới, nòi sinh học có tính độc, tính gây bệnh thay đổi cđa mét lo i vi khn g©y bƯnh c©y ë thiên nhiên Đó l nguyên nhân l m đa dạng hoá v gây biến động liên tục quần thể ký sinh đồng ruộng, gây thêm nhiều khó khăn v phức tạp cho việc chọn lựa áp dụng biện pháp phòng trừ bệnh vi khuẩn Những biến dị di truyền vi khuẩn phát sinh đột biến ngẫu nhiên v tái tổ hợp gen di truyền tế b o vi khuẩn a) Đột biến: trình ®ét biÕn cđa vi khn cã thĨ x¶y yếu tố gây đột biến hoá học v vật lý yếu tố ký chủ gây (giống kháng nhiễm) Dới tác động chất gây đột biến hoá học hay yếu tố vật lý (chiếu tia phóng xạ) tợng đột biến xảy đoạn n o phân tử nucleotit ADN, l m phát sinh thể đột biến hình thái, đột biến sinh lý - sinh hoá, v.v,Các thể đột biến vi khuẩn có thay đổi hình thái khuẩn lạc, m u sắc khuẩn lạc, tính kháng nguyên, tính độc, tính gây bệnh, tính mẫn cảm v chống chịu chất kháng sinh, thực khuẩn thể (bacteriophage), khả sản sinh độc tố, v.v Nhiều thể đột biến đ xuất có biến đổi tính gây bệnh nh− lo i Pseudomonas tabaci, Erwinia aroidae Trong giíi h¹n quần thể ký sinh, tần số đột biến v o khoảng từ ì 10-5 đến ì 10-10 b) Tái tổ hợp vật chất di truyền: vi khuẩn, tái tổ hợp tiến h nh theo kiểu: chuyển nạp, tải nạp v tiếp hợp - Chuyển nạp: l kiểu tái tổ hợp vËt chÊt di trun, l m biÕn ho¸ hƯ gen cđa “tÕ b o vi khn nhËn” b»ng c¸ch tù hấp thụ v o ADN ngoại lai đợc giải phãng tõ mét “tÕ b o vi khuÈn cho” có tính trạng khác Griffith 1928 lần đ phát thấy tợng tổ hợp genom chủng vi khuẩn với đoạn ADN ngoại lai trạng thái tự dung dịch chủng vi khuẩn khác để tạo th nh cá thể tái tổ hợp vi khuẩn có tính trạng bổ xung - Tải nạp: l kiểu tái tổ hợp, l mang truyền đoạn vật chất di truyền ADN (gen) cđa mét chđng vi khn “vi khn cho” g¾n v o genom cña tÕ b o “vi khuÈn nhËn” thông qua môi giới chuyển tải l thực khuẩn thể «n ho (bacteriophage «n ho ) Thùc khuÈn thÓ «n ho l thực khuẩn thể không ác tính không ph¸ hủ “tÕ b o vi khn chđ” m cïng tồn tại, ADN chúng gắn với đoạn ADN (gen) cđa chđng vi khn chđ, ®Ĩ sau ®ã cã thĨ chun t¶i sang mét tÕ b o vi khn kh¸c Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 92 Vi khuÈn chñ mang bên thực khuẩn thể ôn ho gọi l vi khuẩn sinh tan (lisogene) Hiện tợng tải nạp l chế biến dị quan trọng vi khuẩn đ đợc Lederberg phát năm 1952 v sau Okabe v Goto, 1961 đ nghiên cứu tợng tải nạp Ralstonia solanacearum (bệnh héo xanh vi khuẩn) Đây l kiểu tái tổ hợp có ý nghĩa quan trọng việc tạo th nh chủng nòi lo i vi khuẩn gây bệnh - Tiếp hợp: l tiếp xúc trực tiếp hai tế b o vi khuẩn khác giới tính để trun mét phÇn vËt chÊt di trun tõ tÕ b o vi khn cho (vi khn giíi tÝnh d−¬ng F+) v o genom cña tÕ b o vi khuÈn nhận (vi khuẩn giới tính âm F ), dẫn đến hình th nh hợp tử không ho n to n” (merozygote) Ỹu tè giíi tÝnh F l mét đoạn ADN tự nằm độc lập nguyên sinh chất gắn v o ADN nhân vi khuẩn TÕ b o vi khuÈn cã yÕu tè F l vi khn ®ùc F+, l m nhiƯm vơ cđa “tÕ b o vi khuẩn cho gen, ngợc lại l vi khn F− l m nhiƯm vơ cđa “tÕ b o vi khuÈn nhËn”(vi khuÈn c¸i) TÕ b o F+ cã loại có tần số tái tổ hợp thấp, chuyển hoá th nh tế b o F+ có tần số tái tổ hợp cao (vi khuẩn Hfr) kiểu tiếp hợp vi khuẩn bệnh lo i Pseudomonas v Xanthomonas VI Nguồn gốc tiến hoá tính ký sinh vi khn g©y bƯnh c©y TÝnh ký sinh vi khuẩn gây bệnh bắt nguồn từ khả dinh dỡng mô tế b o thực vật chết Trong thiên nhiên, t n d trồng sau vụ thu hoạch rơi rụng mặt đất, vùi sâu đất l nguồn cung cáp thức ăn cho vi khuẩn Mặt khác số vi khuẩn rơi v o vùng mô tế b o chết lý n o v sử dụng tến b o chết l m thức ăn Ngo i yếu tố ngoại cảnh kích thích hoạt động enzyme vi khuẩn giữ vai trò quan trọng trình tiến hoá tính ký sinh vi khuẩn gây bệnh Các lo i vi khuẩn gây bệnh có chung tổ tiên, m có lÏ chóng xt ph¸t tõ nhiỊu ngn kh¸c Cã thể nói vi khuẩn gây bệnh đợc bắt nguồn từ nhóm sau đây: - Các nhóm vi khuẩn hoại sinh đất (Pseudomonas sp.) - Các nhóm vi khuẩn sống phụ sinh phận khác (Xanthomonas herbicola, v.v.) - Các nhóm vi khuẩn sống đất vùng rễ Sự hình th nh tÝnh ký sinh cđa vi khn g©y bƯnh c©y xuất phát từ nhóm theo đờng khác Con đờng trải qua số giai đoạn định v Tr ng ủ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 93 giai đoạn nh tính ký sinh đợc hình th nh ng y c ng rõ nét giai đoạn nh yếu tố ngoại cảnh có ảnh hởng lớn v có trờng hợp yếu tố bên ngo i l m cho đờng lên vi khuẩn ký sinh trë th nh quanh co v cã thÓ có lúc phải quay trở lại, nghĩa l tính ký sinh đợc hình th nh, cha kịp củng cố bị Trong giai đoạn tiến lên tính ký sinh, trồng có phản ứng chống đối định v l m cho đờng lên tính ký sinh l đờng thuận lợi dễ d ng Nói chung đờng tiến lên tính ký sinh vi khuẩn gây bệnh bao gồm bớc sau đây: Điểm xuất phát : dạng vi khuẩn hoại sinh đất, tập đo n vi sinh vật rễ cây, phận cây, muốn tiến lên gây bệnh cho trớc hết chúng phải sử dụng đợc tế b o chết l m thức ăn Xâm nhập v o phận tình trạng không hoạt động sinh lý, phận tình trạng ngủ nghỉ: củ cây, hom giống, v.v Gây bệnh cho phận trạng thái tích cực hoạt động sinh lý bớc n y vi sinh vật phải thông qua hai giai đoạn : * Gây bệnh có tính chất thời, trờng hợp gặp điều kiện thuận lợi v gây bệnh đợc phận định Các loại vi khuẩn giai đoạn phát triển n y cha hẳn khả sống hoại sinh Vì gặp trờng hợp bất thn chóng cã thĨ trë l¹i sèng ho¹i sinh, khả hoại sinh v chống tác động loại vi khuẩn hoại sinh khác có bị giảm sút nhiều v chúng sống bình thờng điều kiện hoại sinh đợc Mặt khác tính ký sinh loại vi khuẩn n y cha đợc ổn định * Gây bệnh lâu d i v bệnh lan rộng khắp phận ký chủ Tuy giai đoạn n y vi khuẩn đ gây bệnh đợc cho cây, nhng phạm vi ký chủ chúng rộng Phần lớn l lo i vi khn ®a thùc Quan hƯ cđa chóng với lo i xác định cha đợc xác lập, khả lựa chọn chúng cha hình th nh Phạm vi ký chủ bị thu hẹp dần v tính chuyên hoá đợc hình th nh Các lo i vi khuẩn gây bệnh bớc phát triển n y phần lớn l lo i vi khuẩn chuyên tính mức độ phát triển n y vi khuẩn bị hẳn khả hoại sinh v quan hệ chúng với trở nên khăng khít v chúng không khả sinh trởng phát triển ngo i tế b o trồng VII Phân loại vi khuẩn gây bệnh Phân loại vi khuẩn gây bệnh l vấn đề phức tạp, ch−a ho n chØnh v thèng nhÊt Tõ cuèi thÕ kỷ 19 đến nay, nhiều hệ thống phân loại vi khuẩn bệnh đ Tr ng ủ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 94 đợc xây dung nh hệ thống phân loại Migula, Smith, Bergey, Crassinicop, Dowson, Tesic, Gorlenco, v.v Ngời ta đ áp dụng tơng đối rộng r i bảng phân loại vi khuẩn Bergey Nhng bảng phân loại thiếu thống nguyên tắc xếp loại Loại Corynebacterium gồm vi khuẩn thuộc nhóm gram dơng, lông roi (không chuyển động) Loại n y tơng tự nh loại Aplanobacter bảng phân loại Smith Loại Pseudomonas gồm vi khuẩn hình gậy, chuyển động, hình th nh khuẩn lạc không m u Loại Xanthomonas gồm vi khuẩn có hình dạng nh nhng hình th nh khuẩn lạc m u v ng Loại Erwinia gồm lo i vi khuẩn không hình th nh b o tử v có lông roi to n thân Loại Bacillus gồm vi khuẩn nh loại khác l có hình th nh b o tử Ngo i loại loại đặc biệt gồm vi khuẩn gây tợng u sng, có bớu cây, loại Agrobacterium Việc tách riêng loại n y dựa nguyên tắc ho n to n khác (triệu chứng bệnh) v sở không đợc thống Một số lo i bắt nguån tõ Rhizobium, mét sè lo i b¾t nguån tõ lo i vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, v.v Bảng Tổng hợp bảng phân loại vi khuẩn gây bệnh chủ yếu Dạng không Tác giả chuyển động Dạng chuyển động v cã l«ng roi ë cùc Migula 1894 1900 Bacterium Pseudomonas Bacillus - Bacterium Bacterium Bacterium Bacillus Aplanobacter Bacterium Bacillus - Leman v Neumann 1896 – 1927 Smith, 1905 Phytomonas Dạng chuyển động v có lông roi to n thân Dạng có hình th nh b o tử Erwinia Bergey, 1939 Pseudomonas Corynebacterium Xanthomonas Erwinia Agrobacterium Bergey, 1948 Pseudomonas Bacterium Pseudomonas Pectobacterium Xanthomonas Mycrobacterium Kratxinicèp, 1949 Bacillus Erwinia Pseudobacterium Corynebactorium Dowson, 1939, Corynebactorium Chromobacterium Pseudomonas 1957 Aplanobacter Chromopseudomonas Tesic, 1956 - - Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 95 Lo¹i Erwinia theo xếp Bergey, l loại không đồng Vì Uôndi (1945) đ chia loại n y l m hai loại: loại Erwinia gồm vi khuẩn gây bệnh có lông roi to n thân, enzymee pectinaza v protopectinaza Loại Pectobacterium gồm vi khuẩn hình gậy có lông roi to n thân, nhng có loại enzymee nói Tóm lại, sở phân loại khác tuỳ theo quan điểm phân loại nh nghiên cứu v hầu hết tiêu phân loại cha đợc nghiên cứu đầy đủ nên bảng phân loại có vấn đề cha thống thiếu sở cụ thể việc phân loại số lo i (species) Song nhìn chung để phân loại vi khuẩn gây bệnh cây, ngời ta đ dựa v o nhiều tiêu phân loại : chủ yếu dựa v o đặc điểm hình thái, sinh trởng (hình dạng, kích thớc tế b o, đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm lông roi, tính chuyển động, khả nhuộm Gram, v.v ), đồng thời dựa v o đặc tính sinh lý sinh hoá (quan hệ với ô xy, nhiệt độ, sắc tố, thuỷ phân gelatin, tinh bột, khả phân giải protêin tạo th nh indol, H2S, NH3, khả khử nitrat (NO3) th nh nitrit (NO2) N tự do, khả phân giải nguồn cacbon, đặc biệt l loại đờng,v.v v dựa v o tính gây bệnh, tính kháng nguyên, tính chuyên hoá ký chủ, đặc điểm triệu chứng bệnh, Gần đây, dựa v o đặc điểm th nh phần cấu trúc ADN vi khuẩn, phân tích sở sinh học phân tử để xác định, phân loại lo i vi khn Dùa v o hƯ thèng ph©n lo¹i trun thèng cđa Bergey (1939, 1974) v Gorlenco (1966) nêu tóm tắt chung vi khuẩn gây bƯnh c©y nh− sau : Líp Schizomycetes (Eubacteriae) Bé Eubacteriales Họ :Mycobacteriaceae (Chester 1901): vi khuẩn không chuyển động (Corynebacteriaceae) Lo¹i (Genus) : Corynebacterium (Lehman – Neumann 1896) vi khuÈn Gram d−¬ng Lo i (species) : Corynebacterium sepedonicum Lo¹i Aplanobacterium (Smith, 1905; Tesic, 1956) vi khuÈn Gram ©m Hä Pseudomonadaceae (Wilson, 1917) vi khn chun ®éng có lông roi cực Loại : Pseudomonas (Migula, 1900) : khuẩn lạc không m u (trắng kem) Lo i Pseudomonas solanacearum Lo¹i Xanthomonas (Dowson, 1939) : khuÈn l¹c m u v ng Lo¹i Xanthomanas campestris, v.v, Hä : Rhizobiaceae (Conn, 1938) Lo¹i Rhizobium (Frank, 1899) Lo¹i agrobacterium (Conn, 1942) : vi khuÈn h¹i c©y g©y u s−ng Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 96 Lo i agrobacterium tumefaciens Hä : Bacteriaceae (Conn, 1872) : vi khuẩn chuyển động, nhiều lông roi bao quanh tế b o, không sinh b o tử Loại : Erwinia (Winslow, 1920) Lo i Erwinia carotovora : khuÈn lạc không m u Loại Chromobacterium (Bexgonzini, 1881) : cã m u Hä : Bacillaceae (Fischer, 1895) : vi khuẩn chuyển động, sinh b o tử Loại Bacillus (Conn, 1872) Loại Clostridium (Prasnowski, 1880) Trong năm gần đây, phân loại vi khuẩn đại nghiên cứu sở sinh học phân tử phân tích cÊu tróc ADN cđa lo i ADN cđa c¸c c¸ thể, isolate lo i có mét code di trun t−¬ng tù nghÜa l th nh phần nucleotit giống nhau, h m lợng guanin v xitozin (G + X) tơng tự Những nghiên cứu khẳng định : h m lợng G.X lo i lo¹i Erwinia l 50 – 54%; Corynebacterium: 54 - 55%; Pseudomonas: 58 - 63%; Xanthomonas: 64 - 69% VIII Triệu chứng bệnh vi khuẩn Các loại hình triệu chứng bệnh vi khuẩn gây : - Vết đốm, cháy lá: tợng đám mô chết hoại tử có hình dạng, m u sắc khác phận mặt đất l lá, thờng đợc phân biệt gọi dạng đốm v cháy Tiêu biểu l bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae), bệnh đốm sọc lúa (Xanthomonas ozyricola), bệnh giác ban bông, đốm da chuột, bệnh cháy xém lê, v.v - Héo rũ: Vi khuẩn xâm nhập gây hại hệ thống mạch dẫn rễ, thân, c nh, lá, phá huỷ v vít tắc bó mạch dần trở th nh m u nâu, nâu đen, gây héo rũ nhanh chóng số lá, c nh sau to n héo rũ v chết Điển hình l bệnh héo xanh vi khuẩn hại họ c , họ đậu,do lo i Ralstonia solanacearum Smith - Thèi háng: TriƯu chøng rÊt phỉ biÕn đặc trng cho lo i vi khuẩn Erwinia carotovora gây tợng thối nhũn củ khoai tây, c rốt, bắp cải, h nh tây,v.v - Bạc m u: Triệu chứng thể thời kỳ đầu bệnh vi khuẩn xuất với triệu chứng vết đốm hoại tử Mô bệnh hoá v ng nhạt, diệp lơc, nh− bƯnh v ng l¸ vi khn - BiÕn d¹ng u s−ng: Mét sè Ýt bƯnh vi khn cã triệu chứng đặc trng tạo u sng ë rƠ, ë th©n, c nh,…nh− bƯnh ung th− vi khuẩn hại nho v trồng khác (agrobacterium tumefaciens) Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 97 IX Đặc điểm xâm nhiễm truyền lan vi khuẩn Tính chuyên hoá ký sinh Tính chuyên hoá ký sinh l biểu mức độ thích ứng chọn lọc phạm vi ký chủ thích hợp để ký sinh gây bệnh lo i vi khuẩn Căn v o tính chuyên hoá ký sinh, loại vi khuẩn hại phân th nh hai nhóm chủ yếu l vi khuẩn đơn thực có tính chuyên hoá cao (hẹp) v vi khuẩn đa thực có tính chuyên hoá thấp (rộng) + Vi khuẩn đơn thực, chuyên hoá cao (hẹp) : ký sinh gây bệnh lo i trồng v i lo i trồng ®Þnh mét hä thùc vËt, vÝ dơ nh− lo i Corynebacterium michiganense (g©y bƯnh hÐo c©y c chua), lo i Bacterium stewarti (héo ngô), lo i erwinia tracheiphila (héo bầu bí), lo i Xanthomonas oryzae (bạc lúa), lo i Xanthomonas malvacearum (giác ban bông), + Vi khuẩn đa thực, chuyên hoá thấp (rộng) : có khả ký chđ ký sinh, chän läc ph¹m vi ký chđ rÊt réng bao gåm nhiỊu lo i c©y trång ë nhiều họ thực vật khác Điển hình l lo i Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh vi khuẩn hại lo i thuộc họ c , lo i họ đậu, bầu bí, chuối,v.v gồm 200 lo i trồng khác thuộc 44 họ thực vật Bệnh vi khuẩn u sng Agrobacterium tumefaciens hại 66 lo i c©y thuéc 39 hä thùc vËt Lo i erwinia carotovora gây hại nhiều lo i cây, nhiều họ khác nh cải bắp, khoai tây, c rốt, h nh tây,v.v Các lo i vi khuẩn đơn thực có tính chuyên hoá cao, sống mô sống bảo tồn t n d bệnh nhng khả bảo tồn lâu d i sống đất so với lo i vi khuẩn đa thực Nghiên cứu tính chuyên hoá vi khuẩn l sở khoa học việc xây dựng hệ thống phòng chống tổng hợp bệnh vi khuẩn hại trồng Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh Quá trình xâm nhiễm bao gồm giai đoạn : xâm nhập lây nhiễm giai đoạn ủ bệnh giai đoạn phát triển bệnh * Giai đoạn xâm nhập lây nhiễm ban đầu đợc thực có tiếp xúc vi khuẩn với bề mặt phận trồng, để xâm nhập đợc v o bên mô thông qua đờng khác Tuỳ theo lo i vi khuẩn m khả xâm nhập v o mô có khác Vi khuẩn xâm nhập v o ho n to n mang tÝnh thơ ®éng bëi nã khả xâm nhập trực tiếp để chọc thủng v o mô tế b o xuyên qua biểu bì, bề mặt nguyên vẹn - Vi khuẩn xâm nhập qua vết thơng giới : l cách xâm nhập thụ động qua vết thơng giới gió ma, côn trùng, gia súc hoạt động ngời chăm sóc, vun sới, cắt tỉa lá, thân c nh, gây cách ngẫu nhiên, nhẹ nh ng nhng lại có tác dụng mở đờng cho vi khuẩn dễ d ng xâm nhập, lây nhiễm v o mô không nguyên vẹn Phơng pháp xâm nhập lây nhiễm qua vết thơng giới l phổ biến nhiều lo i vi Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 98 khuÈn Tiªu biĨu l c¸c lo i vi khn Erwinia carotovora (thèi cđ khoai t©y, h nh t©y, v.v.); Corynebacterium michiganense (g©y héo c chua); Pseudomonas tabaci (đốm cháy thuốc lá), - Vi khuẩn xâm nhập qua lỗ hở tự nhiên nh lỗ khí khổng, thuỷ khổng, mắt củ chồi non, vỏ thân,v.v Lỗ khí khổng l đờng xâm nhiễm tơng đối chủ động, phổ biến nhiều lo i vi khuẩn gây đốm lá, hại nhu mô nh lo i Xanthomonas malvacearum (gây bệnh giác ban bông); Xanthomonas vesicatoria (gây bệnh đốm đen vi khuÈn c chua),v.v - Vi khuÈn x©m nhËp trùc tiÕp v o mô quan cutin bảo vƯ nh− l«ng rƠ, l«ng hót, Mét sè lo i vi khuẩn xâm nhập v o mô hai đờng xâm nhập nói Ví dụ lo i Xanthomonas citri gây bƯnh lt c©y cã mói cã thĨ x©m nhËp qua khÝ khỉng v qua vÕt th−¬ng c¬ giíi giã ma, sâu vẽ bùa đục tạo * Thời kỳ tiềm dục bệnh l giai đoạn trình xâm nhập lây bệnh, thay đổi tuỳ theo giống ký chủ v yếu tố ngoại cảnh, l yếu tố nhiệt độ v tính độc, tính gây bệnh chủng vi khuẩn Nói chung phạm vi nhiệt độ cho phép điều kiện nhiệt độ c ng cao thời kỳ tiềm dục c ng rút ngắn, bệnh phát triệu chứng c ng nhanh Ví dụ: bệnh giác ban hại vi khuẩn Xanthomonas malvacearum nhiệt ®é thÝch hỵp 25 – 300C, thêi kú tiỊm dơc tõ – ng y, nh−ng ë nhiƯt ®é cao > 350C thấp < 200C thêi kú tiỊm dơc kÐo d i tíi – 14 ng y * Giai đoạn phát triển bệnh l giai đoạn thời kỳ tiềm dục, từ triƯu chøng bƯnh xt hiƯn, bƯnh tiÕp tơc ph¸t triển gây hại kết thúc Đặc điểm truyền lan vi khuẩn Trong thời kỳ trồng sinh trởng phát triển đồng ruộng, bệnh vi khn cã thĨ trun lan tõ c©y n y sang khác, từ vùng có ổ bệnh đến vùng xung quanh nhiều đờng khác : - Trun lan nhê giã, kh«ng khÝ : lng kh«ng khí theo vi khuẩn, mảnh vụn mô bệnh truyền bệnh xa từ chỗ n y sang chỗ khác Tuy nhiên cách truyền lan n y bệnh vi khuẩn truyền lan với khoảng cách hĐp, nhÊt l kh«ng khÝ kh«, vi khn kh«ng sống đợc lâu - Truyền lan nhờ nớc : vi khn dƠ d ng trun lan nhê n−íc t−íi, n−íc m−a, nhÊt l ®iỊu kiƯn m−a, giã, b o Ma gió l m sây sát tạo vết thơng nhẹ thích hợp cho vi khuẩn xâm nhËp N−íc t−íi cịng cã thĨ ®−a vi khn ë đất, lan truyền xa với khoảng c¸ch réng lín Nhê cã n−íc m c¸c t n d mô bệnh đợc vận chuyển xa để lây nhiễm bệnh - Truyền lan nhờ côn trùng v động vật khác : lo i ong, côn trùng miƯng nhai Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 99 ®Ịu cã thể mang vi khuẩn truyền xa theo phơng pháp giới Một số lo i côn trùng miệng chích hót cã thĨ lÊy vi khn ë c©y bƯnh, chøa rt ®Ĩ trun bƯnh Mét sè tun trïng ®Êt, èc sªn, chim, nhƯn cịng cã thĨ trun lan bƯnh vi khÈn tù nhiªn - Trun lan qua hoạt động ngời : vi khuẩn lây lan qua dụng cụ v qua hoạt động ngời trình chăm sóc, vun sới, tỉa cây, bấm c nh, ngắt vận chuyển hạt giống, giống nhễm bệnh vùng trồng trät kh¸c Sù trun lan bƯnh, sù ph¸t sinh phát triển bệnh nơi n o có liên quan chặt chẽ với tồn v tÝch l cđa ngn bƯnh s½n cã X Ngn bƯnh vi khuẩn Nguồn bệnh l vị trí, phận m vi khuẩn bảo tồn lâu d i để phát tán lây nhiễm bệnh cho vụ trồng, năm Trong thực tiễn sản xuất nông nghiệp, nguồn bệnh vi khuẩn bảo tồn từ vụ n y sang vụ khác, năm n y sang năm khác tồn lu trữ lâu d i t n d bệnh, hạt giống, củ giống, đất trồng, cỏ dại,v.v - Hạt giống, c©y gièng, cđ gièng : l ngn bƯnh quan träng nhiều loại bệnh vi khuẩn hại Đây l nguồn bệnh Vi khuẩn bảo tồn, tiềm ẩn bên bề mặt hạt giống, từ truyền lan bệnh nơi Ví dụ lo i vi khuÈn Pseudomonas phaseolicola tån t¹i ë vá h¹t, bên hạt, phôi hạt hạt đậu tơng,v.v Hạt giống bị nhiễm vi khuẩn l thời kỳ sinh trởng bị bệnh, vi khuẩn di chuyển theo bó mạch dẫn xâm nhập v o hạt (Xanthomonas malvacearum : bệnh giác ban bông; Pseudomonas tabaci : bệnh đốm vi khuẩn hại thuốc lá,v.v.) - T n d bệnh l nguồn dự trữ vi khuẩn quan trọng Vi khuẩn tồn lâu d i bên t n d mô bệnh rơi rụng, sót lại đồng ruộng sau thu hoạch t n d bị thối mục, giải phóng vi khn ngo i míi dƠ d ng bÞ chÕt đất tác động vi sinh vật đối kháng, khuẩn thực thể (bacteriophage),v.v - Một số lo i vi khuẩn có khả c trú qua đông, bảo tồn, tiềm sinh rễ trồng v dại đất Ví dụ nh lo i Pseudomonas tabaci (bệnh đốm vi khuẩn hại thuốc lá), Xanthomonas oryzae (bệnh bạc lúa), Ralstonia solanacearum Smith (bÖnh hÐo xanh vi khuÈn c chua, khoai tây, thuốc lá,v.v.) - Nhiều lo i cỏ dại đồng ruộng có mặt quanh năm đồng ruộng cã thĨ l ký chđ cđa mét sè bƯnh vi khuẩn Bản thân lo i cỏ dại n y thờng xuyên nhiễm vi khuẩn đ trở th nh nguồn bảo tồn lu trữ bệnh tự nhiên thời kỳ có mặt mặt trồng Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 100 XI Chẩn đoán bệnh vi khuẩn Chẩn đoán bệnh nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh, giám định lo i vi khuẩn gây bệnh, sở chọn lựa biện pháp phòng chống bệnh có hiệu nhằm bảo vệ trồng Các phơng pháp thông dụng để chẩn đoán bệnh vi khuẩn : - Dựa v o triệu chứng đặc trng bên ngo i - Phơng pháp vi sinh : phát v nghiên cứu đặc điểm riêng hình thái khuẩn lạc v tế b o vi khuẩn, nhuộm vi khuẩn mô bệnh, phân lập nuôi cấy vi khuẩn, lây bệnh nhân tạo, v.v - Phơng pháp sinh hoá, sinh lí - Phơng pháp chẩn đoán huyết - Phơng pháp chẩn đoán khuẩn thực thể (bacteriphage) - Phơng pháp ELISA v PCR (phản ứng chuỗi Polymeraza) Phơng pháp chẩn đoán dựa v o triệu chøng bƯnh Mét sè lo i vi khn hc mét nhóm vi khuẩn hại gây loại triệu chứng bệnh đặc trng (nh triệu chứng bệnh vi khuẩn bạc lúa, bệnh loét có múi, bệnh đốm thuốc lá, v.v) Tuy nhiên dựa v o triệu chứng bệnh xác định chẩn đoán bệnh số trờng hợp Nhiều lo i cây, nhiều lo i vi khuẩn khác v nhiều loại vi sinh vật gây bệnh khác tạo triệu chứng tơng tự giống khó phân biệt (nh loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng cây, củ, quả, v.v) Vì phải tiến h nh khảo sát chi tiết thêm phơng pháp chẩn đoán khác trờng hợp cần thiết, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh l bớc sơ khảo ban đầu Phơng pháp vi sinh Để xác định bệnh vi khuẩn gây ra, điều cần thiết phải khẳng định có mặt vi khuẩn mô bệnh, phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn khiết, sau lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh chúng ký chủ theo nguyên tắc Koch Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trởng khuẩn lạc v phản ứng sinh hoá để có sở phân loại, giám định lo i vi khuẩn cần thiết Các tiêu hình dạng, kích thớc tế b o vi khuẩn đợc quan sát đo đếm phơng pháp hiển vi, phơng pháp nhuộm tế b o vi khuẩn mô bệnh theo Gram, phơng pháp nhuộm lông roi hoá chất kính hiển vi điện tử Các đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn môi trờng nuôi cấy (Agar) cần đợc xác định rõ hình dạng, m u sắc khuẩn lạc, rìa khuẩn lạc (m u trắng kem : Pseudomonas sp; m u trắng xám : Erwinia sp; m u v ng : Xanthomonas sp., v.v.) Tuy nhiên số đặc Tr ng ủ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 101 điểm khuẩn lạc nói thay đổi phần phụ thuộc v o chất môi trờng nuôi cấy v môi trờng đặc hiệu lo i vi khuẩn, v.v Phơng pháp sinh hoá Một số tiêu cần thiết để giám định lo i vi khuẩn cần chẩn đoán phải đợc khảo sát nghiên cứu phơng pháp thử phản ứng sinh hoá riêng biệt Các loại vi khuẩn khác phân biệt nhu cầu, khả sử dụng chất dinh dỡng v kiểu trao đổi chất + Các loại vi khuẩn phân biệt khác có hay khả phân giải, sử dụng số gluxit, hợp chất chứa cacbon, hợp chất hữu trình trao đổi lợng Để chẩn đoán, ngời ta thờng dùng nguồn cacbon l : monosaccarit, disaccarit, polysaccarit, rợu v glucoside, + Ph¶n øng khư nitrat + Kh¶ phân giải, sử dụng nguồn đạm (protein, peptit) + Một số phản ứng khác Phơng pháp huyết Đây l phơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh vi khuẩn đợc ứng dụng bệnh l viƯc kiĨm tra, chän läc gièng, vËt liƯu l m giống bệnh v kiểm dịch thực vật Phơng pháp huyết chẩn đoán vi khuẩn dựa sở phản ứng có tính đặc hiệu cao kháng nguyên v kháng thể tơng tự Để giám định vi khuẩn gây bệnh phơng pháp huyết cần phải điều chế sẵn loại kháng huyết đặc hiệu víi tõng lo i vi khn riªng biƯt A, B, C, Quá trình khái quát theo sơ đồ sau : KNA => Động vật máu nóng (thỏ nh ) => KTA KNB => Động vật máu nóng (thá nh ) => KTB KTA + KNA => { KTA + KNA } => phản ứng dơng KTA + KTB => phản ứng âm Ghi : KNA l kháng nguyên vi khuẩn A KNB l kháng nguyên vi khn B KTA l kh¸ng thĨ A (kh¸ng hut vi khn A) KTB l kh¸ng thĨ B (kh¸ng hut vi khuÈn B) Trư ng ñ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh ñ i cương - 102 ... l 50 – 54%; Corynebacterium: 54 - 55%; Pseudomonas: 58 - 63 %; Xanthomonas: 64 - 69 % VIII Triệu chứng bệnh vi khuẩn Các loại hình triệu chứng bệnh vi khuẩn gây : - Vết đốm, cháy lá: tợng đám mô... triệu chứng bệnh đặc trng (nh triệu chứng bệnh vi khuẩn bạc lúa, bệnh loét có múi, bệnh đốm thuốc lá, v.v) Tuy nhiên dựa v o triệu chứng bệnh xác định chẩn đoán bệnh số trờng hợp Nhiều lo i cây, ... bảo tồn lu trữ bệnh tự nhiên thời kỳ có mặt mặt trồng Trư ng đ i h c Nơng nghi p – Giáo trình B nh đ i cương - 100 XI Chẩn đoán bệnh vi khuẩn Chẩn đoán bệnh nhằm xác định