Công nghệ sinh học ( phần 2 ) Hợp chất Flavonoid trong thực vật có hoa “Các hợp chất flavonoid là một trong những yếu tố quyết định màu sắc của hoa. Quá trình sinh tổng hợp flavonoid là một quá trình biến dưỡng tổng hợp tự nhiên đã được nghiên cứu một cách rất sâu rộng. Theo đó, hợp chất flavonoid được sinh tổng hợp theo con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid, chính là con đường tổng hợp thứ cấp chủ yếu trong tất cả thực vật bật cao. Hầu hết các enzyme cũng như các đoạn gene tương ứng cần thiết cho quá trình trên đều đã được nghiên cứu cụ thể; trong số đó nhiều protein đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc.” Hoa hồng xanh được sản xuất tại công ty Florigene từ việc ứng dụng thành tựu của kỹ thuật di truyền trong sắc tố hoa. Hình ảnh sử dụng trong minh họa được sự cho phép từ Tiến sỹ T. Tanaka. Loài người đã bị thu hút bởi màu sắc hoa có lẽ một thời gian rất dài, thậm chí trước khi bắt đầu nền văn minh. Nhà triết học đời nhà Tống, Chu Tử khuyên người dân trân trọng “hàng ngàn sắc tím với hàng ngàn sắc đỏ từ những đóa hoa mùa xuân”. Hầu hết hàng ngàn sắc đỏ và sắc tím đó bắt nguồn từ flavonoid, một nhóm sắc tố độc đáo nhưng là những sản phẩm vô cùng phổ biến của quá trình biến dưỡng thứ cấp qua con đường phenypropanoid. Chức năng chủ yếu của flavonoid trong hoa là dùng để thu hút côn trùng và các loài động vật khác giúp cho quá trình thụ phấn chéo. Cấu trúc và sự kết hợp độc đáo của các flavonoid ở mỗi loài khác nhau tạo nên các quang phổ cực tím và thông thường được nhìn thấy bởi các loài côn trùng và động vật lớn hơn giúp gia tăng hiệu quả của việc thụ phấn và sự thụ tinh của hoa. Flavonoid trong hoa còn giúp chống lại bức xạ cực tím và có vai trò như một chất bảo vệ chống lại mầm bệnh giống như vai trò của chúng ở những cơ quan khác của thực vật. Hơn nữa, trong nghiên cứu của Van der Meer và cộng sự năm 1992 đã xác định được một nhóm các flavonoid đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt phấn, từ đó chứng minh những sắc tố này có chức năng vô cùng quan trọng trong vai trò chính yếu của hoa là sinh sản. Cấu trúc của flavonoids gồm có bộ khung carbon C6-C3-C6 thường có hai vòng thơm (vòng A và B) và một vòng carbon có một nguyên tử oxygen. Sắc tố anthocyannins là một phân nhóm của flavonoid hiện diện chủ yếu trong không bào của tế bào thực vật. Dựa vào các nhóm OH của vòng B, có ba nhóm anthocyanin chính được tìm thấy trong thiên nhiên là pelargonidin, cyanidin và delphinidin. Methyl hóa cyanidin và delphinidin tạo ra thêm ba nhóm anthocyanin bổ sung nữa là peonidin, petudin và malvidin. Màu sắc của hoa được xác định bởi các yếu tố trong tế bào cũng như các yếu tố điều khiển sự phân bố theo thời gian và không gian của các sắc tố ở cấp độ mô – cơ quan thực vật. Trong các tế bào của cánh hoa, màu sắc được điều hòa bởi ít nhất 6 yếu tố sau: 1. Sinh tổng hợp anthocyanin – là yếu tố quan trọng nhất; 2. Sinh tổng hợp các sắc tố khác như carotenoid và betalain; 3. Sự chuyển đổi các phân tử anthocyanin cơ bản trong các quá trình hydro hóa, methyl hóa hoặc kết hợp; 4. Các sắc tố phụ như flavone và các ion kim loại; 5. Sự thay đổi của pH trong không bào; 6. Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của các siêu phân tử sắc tố. Tất cả yếu tố trên đều có khả năng thay đổi cường độ và quang phổ của màu sắc hoa. Từ những năm đầu của thế kỷ 19 từ khi nhà di truyền học Gregor Mendel coi màu hoa như là một marker trong các thí nghiệm di truyền cổ điển của ông, sự khám phá flavonoid đã đóng góp rất to lớn cho sự phát triển của nền sinh học hiện đại. Ngược lại sự phát triển của sinh học hiện đại cũng giúp các nhà khoa học hiểu biết một cách sâu rộng khoa học di truyền và sinh hóa của màu sắc hoa. Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote Các glycoprotein chiếm thị phần chính trên thị trường các protein dược phẩm. Hầu hết các protein này đều được sản xuất bởi công nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào việc sử dụng các hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật. Hệ thống biểu hiện của nấm men và tế bào động vật có nhiều ưu điểm trong sản xuất các protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân chuẩn, các protein thường được biến đổi sau quá trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống này và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác giữa các protein và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl hóa của các hệ thống này là một vấn đề rất quan trọng mà chúng ta cần phải hiểu khi biểu hiện một protein nào đó. 1. Các dạng glycosyl hóa protein 1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã được bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một protein [19,20]. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà vị trí thứ hai không phải là Pro. Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 phân tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man 9 GlcNAc 2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy Golgi . Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N: - Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 được tập hợp ở mạng lưới nội chất nhám và được biến đổi thành Man 8 GlcNAc 2 . - Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường diễn ra trong Golgi bởi các enzyme mannosidase tạo thành Man 5 GlcNAc 2 để tổng hợp các oligosaccharide phức tạp hoặc hình thành các oligomannoside. - Sự chuyển thành dạng đa anten phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của Golgi và trans-Golgi, có hoặc không có đuôi sialic acid, và từ đó protein được tiết ra môi trường ngoại bào. 1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc tạo liên kết cộng hóa trị giữa một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein. Dạng phổ biến của hiện tượng glycosyl hoá ở vị trí O ở người thường xảy ra ở Golgi , liên quan tới sự chuyển GalNAc từ UDP-GalNAc sang axit amin Ser hoặc Thr thông qua hoạt động của enzyme GalNAc transferase kéo theo sự chuyển của hàng hoạt các phân tử đường khác nhau như galactose, GalNAc, and N-GlcNAc, fucose, glucose, mannose, hydroxyproline… 2. Sự glycosyl hóa protein ở tế bào động vật có vú Các tế bào động vật có vú (như tế bào CHO, tế bào myeloma, tế bào HEK) đang được ưa chuộng bởi vì bộ máy glycosyl hoá của chúng rất giống ở người, mặc dù các phân tử đường được gắn vào protein không hoàn toàn giống ở người, chúng vẫn được bán trên thị trường. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn bao gồm mannose, galctose, N-acetylglucosamine (GlcNAc) và axit neuramic. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm một số lượng phân tử đường khác nhau bao gồm galactose, N- acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, axit sialic và axit neuramic. Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein dược phẩm được sản xuất bởi hệ thống tế bào động vật có vú là khác nhau và thay đổi theo từng mẻ. Vì vậy, sự đa dạng này phải được kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng. Trong thực tế, các kiểu mẫu glycosyl hóa này có thể được thay đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình lên men, sử dụng các enzyme biến đổi, hoặc tạo ra những hệ thống biểu hiện được làm giàu hoặc loại bỏ những dạng gắn phân tử đường đặc biệt nào đó. 3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các glycoprotein dược phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác là chúng có khả năng tạo ra các kiểu mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã được hiểu rõ vai trò của phần carbonhydrate. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N trong S. cerevisiae có đặc điểm phân nhánh rất nhiều và mang rất nhiều đường mannose. Trong khi các protein được glycosyl hóa ở vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất là 5 phân tử mannose. Sự glycosyl hóa ở vị trí N trong Pichia hầu hết bao gồm chuỗi ManGlcNAc, giống với kiểu glycosyl hóa protein điển hình trong tế bào động vật có vú. In Pichia, the outer oligosaccharide chain of secreted proteins is mostly unaltered and consists of Man 8 –9GlcNAc 2 . Mặc dù có nhiều sự khác nhau về số lượng và độ phức tạp của sự kiểu glycosyl hóa liên kết với N được thấy, nhưng chúng vẫn có chứa trình tự bảo tồn nhận biết cho sự khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa-Ser/Thr. Ở Pichia có sự gắn chuỗi oligosaccharide tại vị trí O nhưng nó không phải là thành phần quan trọng của các glycoprotein tan. Sự gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao gồm các phân tử mannose. Tuy nhiên, số lượng mannose trên một chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở vị trí O trong Pichia pastoris vẫn chưa xác định được. Chúng ta không nên thừa nhận rằng một protein không bị glycosyl hóa ở vị trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì sẽ không bị glycosyl hóa trong Pichia. 4. Các enzyme dùng cho nghiên cứu về glycoprotein Các enzyme thường được sử dụng trong những nghiên cứu về cấu trúc đường của các glycoprotein: Enzyme Loại enzyme Sự đặc hiệu Endoglycosidase D Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase F Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase H Endo Cắt các phân tử glycan chứa nhiều mannose β-galactosidase Exo Loại bỏ các enzyme galactosidase khỏi Gal-β1, 5, 8, 9 3-GlcNAc; Gal- β1,4-GlcNAc; Galβ1,3 GalNAc N-glycosidase F Endo Các glycoprotein giữa Asn và GlcNAc Stalidases (Neuraminidases) Exo NeuAc-α2,6-Gal; NeuAc-α2,6- GlcNAc; 2 or NeuAc-α2,3- Ga 5. Kết luận Glycosyl hóa là một quá trình phức tạp và đa dạng trong các sinh vật nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể khái quát hóa theo những kiểu mẫu glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu hiện một protein tái tổ hợp, chúng ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện và phải nắm được mục đích sử dụng của sản phẩm. Các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng tổng hợp các glycoprotein với cấu trúc giống với khi chúng được tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Roland Contreras ở trường đại học Ghent, Bỉ và Tillman Gerngross ở trường Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về việc tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng sản xuất protein với kiểu gắn mannose giống với ở con người. Nhóm nghiên cứu này hy vọng sẽ có thể tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng tổng hợp được các protein hoàn toàn giống như chúng được tổng hợp ở con người . Công nghệ sinh học ( phần 2 ) Hợp chất Flavonoid trong thực vật có hoa “Các hợp chất flavonoid là một trong những yếu tố quyết định màu sắc của hoa. Quá trình sinh tổng hợp flavonoid. sự phát triển của nền sinh học hiện đại. Ngược lại sự phát triển của sinh học hiện đại cũng giúp các nhà khoa học hiểu biết một cách sâu rộng khoa học di truyền và sinh hóa của màu sắc hoa GlcNAc Stalidases (Neuraminidases) Exo NeuAc- 2, 6-Gal; NeuAc- 2, 6- GlcNAc; 2 or NeuAc- 2, 3- Ga 5. Kết luận Glycosyl hóa là một quá trình phức tạp và đa dạng trong các sinh vật nhân chuẩn.