Di truyền phân tử ( phần 9 ) Các thể đột biến của lac operon: các gene cấu trúc, operator, gene điều hoà và promoter 1. Các đột biến ở các promoter và operator Nói chung, các đột biến ở các vùng kiểm soát, chẳng hạn các promoter và operator, thường chỉ ảnh hưởng lên DNA mà chúng khu trú; các đột biến này không tác động lên các vùng định khu trên các phân tử DNA khác (khi nòi vi khuẩn xét đến là thể lưỡng bội một phần, merodiploid). Chúng được gọi là các thể đột biến trội cis. Dưới đây ta hãy xem xét một vài tình huống liên quan. + Ví dụ 1: Một nòi vi khuẩn có kiểu gene là operon P - X + Y + Z + (P = promoter; X, Y, Z = các gene cấu trúc; dấu "-" chỉ đột biến và dấu "+" chỉ chức năng bình thường). Do promoter bị sai hỏng nên RNA polymerase không thể bám vào, vì vậy operon luôn luôn đóng - không tạo ra mRNA. + Ví dụ 2: Một nòi vi khuẩn có kiểu gene P + O - X + Y + Z + (O - hay O c = đột biến cơ định operator). Vì operator bị sai hỏng nên chất ức chế dù bình thường cũng không thể nhân biết và bám vào, vì vậy sự điều hoà sẽ không xảy ra. Operon sẽ luôn luôn ở trạng thái mở (hoạt động). 2. Các đột biến ở các yếu tố ức chế Các phân tử ức chế như đã biết có thể tương tác với tất cả các phân tử DNA trong một tế bào, không có dính dáng tới DNA mà từ đó chúng được sinh ra. Nghĩa là các đột biến tại gene điều hoà có thể cài hiệu quả của chúng lên tất cả các DNA trong tế bào; đó là các thể đột biến trans. + Ví dụ 3: Xét hai nòi vi khuẩn có các operon sau đây: (1) R - P + O + X + Y + Z + (2) R + P - O + X + Y + Z + / R - P + O - X + Y + Z + trong đó R - là gene điều hoà bị đột biến. Ta thấy rằng ở nòi 1, tế bào tạo ra chất ức chế không hoạt động chức năng và nó sẽ chẳng bao giờ bám được operator. Vì vậy operon sẽ luôn luôn ở trạng thái mở. Ở nòi 2 (lưỡng bội một phần), ta hãy xét riêng từng DNA rồi sau đó xét gộp chung với nhau. Operon "trên" (trước) sẽ không bao giờ tạo ra RNA bởi vì promoter bị sai hỏng. DNA "dưới" (sau) lúc nào cũng tạo ra RNA vì chất ức chế bị sai hỏng. Xét chung cho thấy DNA "trên" có thể tạo ra chất ức chế bình thường có thể bám vào cả hai operator. Vì vậy, nòi vi khuẩn này có operon được điều hoà. + Ví dụ 4: Bây giờ ta thử xét kiểu hình của các tế bào lưỡng bội (một phần) đối với gene lacI qua tình huống sau. Một nòi E. coli mà lac I được tiếp hợp với các tế bào E. coli mang một plasmid F' với đoạn DNA gồm PI lacI DNA trên episome. Sự biểu hiện của lacZ sẽ được điều hoà như thế nào trong các tế bào lưỡng bội và dị hợp tử về gene lacI (lac I trên episome và lacI trên nhiễm sắc thể vi khuẩn)? Giải thích. Rõ ràng là các tế bào này xảy ra kiểu điều hoà bình thường về sự chuyển hoá lactose. Vì gene lacI + trên episome F' là trội so với lacI - trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Bạn có thể tự giải thích cơ chế điều hoà này? 3. Các đột biến xảy ra trong các gene cấu trúc Nếu như các tổn thương xảy ra trong các gene cấu trúc thì chúng chỉ ảnh hưởng lên DNA bị đột biến mà thôi. +Ví dụ 5: Xét ba nòi vi khuẩn có các operon sau đây, với giả thiết các gene Z và Y cần cho quá trình phân giải đường lactose. (1) P + O + Z - Y + (2) P + O + Z - Y + / P + O + Z + Y - (3) I + O + Z + / I + O - Z - Ta thấy rằng nòi 1 không thể tổng hợp được β-galactoside có chức năng bình thường; dù môi trường có lactose chúng cũng không thể hấp thụ và phân giải (kiểu hình đột biến). Nòi 2 có sự bổ sung bù trừ về sản phẩm của các gene Z + và Y + của hai DNA, nên lac operon ở tế bào này được điều hoà, nghĩa là chỉ hoạt động khi môi trường có lactose và ngưng hoạt động khi môi trường vắng mặt lactose. Ở nòi 3, operon được điều hoà. + Ví dụ 6: Một nòi E. coli là F lacZ met bio được hỗn hợp với nòi E. coli là lacZ met bio và mang một episome với trình tự DNA Plac O lacZ trên episome, và được nuôi cấy trong vài giờ. Sau đó các tế bào này được tách ra, rửa sạch và cấy sang môi trường tối thiểu có chứa lactose như là nguồn đường duy nhất. Một số tế bào sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu có lactose và hình thành các khuẩn lạc. Bằng cách nào một số tế bào đó trở thành lacZ met bio? Rõ ràng đây là kết quả của một kiểu tiếp hợp đặc biệt, gọi là chuyển nạp (sexduction), tức là quá trình mà trong đó các mẩu DNA tự trị được mang vào một vi khuẩn F - bởi một DNA thuộc nhân tố F, và đã xảy ra sự tái tổ hợp ở vị trí lacZ (xem chương 5). + Ví dụ 7: Bạn sẽ mô tả cơ chế điều hoà sự chuyển hoá lactose như thế nào trong các tế bào vừa được mô tả ở trên (ví dụ 6) khi chúng mọc được trên môi trường tối thiểu có lactose như là nguồn dinh dưỡng? Thực chất là ta đang xét sự điều hoà của gene lacZ trên một episome F' dựa trên sơ đồ sau đây: Ở đây, các tế bào này xảy ra kiểu điều hoà bình thường về chuyển hoá lactose. Trình tự DNA gồm Plac O + lacZ + trên episome được điều hoà bằng chất ức chế (repressor) và protein hoạt hoá dị hoá (CAP hay CRP; xem mục V bên dưới) được mã hoá trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Điều hoà âm tính của các operon cảm ứng: lac operon Đại diện cho tất cả các operon của các loại đường di- và polysaccharide (mà vi khuẩn sử dụng như một nguồn cung cấp các hợp chất carbon và năng lượng) là operon lactose ở E. coli. Operon lactose có chức năng sản sinh các enzyme tham gia vào quá trình hấp thụ và phân giải đường lactose (một disacharide) thành galactose và glucose. Nó chỉ hoạt động khi có mặt đường lactose, vì vậy lactose được gọi là chất cảm ứng và lac operon được gọi là operon cảm ứng (inducible) hay operon dị hoá (catabolite). Nói đúng ra, chất cảm ứng là allolactose; lactose (liên kết galactosid dạng β-1,4) bị biến đổi thành chất trung gian trong quá trình thuỷ phân lactose dưới tác dụng của β- galactosidase, gọi là allolactose (liên kết β-1,6). 1. Cấu trúc của lac operon Các thành phần của lac operon ở E. coli như sau : Cấu trúc chi tiết các vùng khác nhau của operon lactose. - Nhóm các gene cấu trúc bao gồm ba gene: lacZ, lacY và lacA (nói gọn là Z, Y và A); trong đó lacZ mã hoá cho b galactosidase (thuỷ phân lactose), lacY mã hoá cho permease (vận chuyển lactose qua màng) và lacA mã hoá transacetylase (chức năng không rõ ràng; theo ý nghĩa nó không phải là enzyme liên quan trực tiếp đến sự chuyển hoá lactose). - Yếu tố chỉ huy (lac operator) là trình tự DNA dài ~34 cặp base cách gene Z chừng 10 cặp base về phía trước, là vị trí tương tác với chất ức chế. Nó chứa trình tự 24 cặp base đối xứng xuôi ngược, giúp chất ức chế (lac repressor) có thể nhận biết và bám vào bằng cách khuếch tán dọc theo DNA từ cả hai phía. - Vùng khởi động (lac promotor) là đoạn DNA dài chừng 90 cặp base nằm trước và trùm lên lac operator 7 cặp base. Nó chứa hai vị trí tương tác với RNA polymerase và với protein hoạt hoá dị hoá (catabolite activator protein = CAP, hoặc CRP - xem mục V). Điểm khởi đầu phiên mã là vị trí gần cuối của lac promoter. - Gene điều hoà (regulatory gene) nằm trước vùng khởi động, mã hoá một protein ức chế gồm bốn polypeptide giống nhau, gọi là tứ phân (tetramer), đều chứa 360 amino acid. 2. Cơ chế điều hoà âm tính của lac operon Khi trong môi trường nuôi cấy E. coli vắng mặt lactose (allolactose, chất cảm ứng) thì lac operon không hoạt động, nghĩa là các enzyme tham gia hấp thụ và phân giải lactose không được sinh ra. Nguyên nhân là do chất ức chế của operon (lac repressor) vốn tự thân có hoạt tính, bám chặt vào yếu tố chỉ huy (lac operator) và gây kìm hãm sự phiên mã của các gene cấu trúc Z, Y và A. Do đó các sản phẩm enzyme của lac operon không được tạo ra; tức biểu hiện âm tính. (a) (b) (a) Chất ức chế bám chặt lac operator gây ức chế phiên mã; (b) Mô hình lac operator (rìa trái) bị bám chặt bởi protein ức chế (rìa phải). Ngược lại, nếu bổ sung lactose vào môi trường thì một thời gian sau vi khuẩn sẽ bắt đầu hấp thụ và phân giải nó, nghĩa là các enzyme liên quan đã được sinh ra. Sự kiện này được lý giải như sau: Chất cảm ứng (inducer), ở đây là allolactose - dạng biến đổi của lactose - tương tác với chất ức chế (repressor) làm biến đổi cấu hình của chất này. Một phân tử allolactose bám vào một tiểu đơn vị của chất ức chế. Vì vậy chất ức chế mất ái lực và không thể bám vào lac operator; nó tách ra khỏi DNA. Lúc này các gene cấu trúc được phiên mã và các enzyme tương ứng được tổng hợp, nhờ vậy vi khuẩn có thể hấp thụ và phân giải đường lactose Lactose vì vậy là tác nhân gây cảm ứng (hoạt hoá) lac operon. Ngoài ra, ITPG (isopropyl thiogalactoside) cũng được dùng như một chất cảm ứng nhưng không phải là tác nhân sinh lý. Chất cảm ứng kết hợp với chất ức chế và làm biến đổi hình dáng của nó; chất ức chế vì vậy không bám được vào lac operator. Kết quả là các gene cấu trúc của lac operon được phiên mã tạo ra phân tử mRNA polycistron và các enzyme tương ứng được tổng hợp. Phương thức điều hoà như thế được gọi là điều hoà cảm ứng - âm tính, bởi vì chất ức chế lac operon một khi bám vào lac operator sẽ kìm hãm phiên mã, nghĩa là gây hiệu quả âm tính lên sự biểu hiện của các gene; và hoạt động chức năng của protein này lại phụ thuộc vào chất cảm ứng. Nhờ cơ chế điều hoà kiểu liên hệ ngược này mà vi khuẩn có thể thích ứng để tồn tại và phát triển một cách hợp lý. Chất ức chế một khi được bám đầy đủ bởi allolactose thì tách khỏi operator khiến cho sự điều hoà âm tính (sự ức chế) được làm dịu bớt, tuy nhiên RNA polymerase vẫn chưa thể tạo thành một phức hợp bền vững với promoter để có thể khởi đầu phiên mã được. Về cơ bản, cơ chế "mở" của lac operon được trình bày như trên; nhưng thực ra sự hoạt động của chất cảm ứng mới chỉ làm dịu bớt (alleviation) sự điều hoà âm tính (sự ức chế) của lac operon. Trên hình cho thấy ngay cả khi chất ức chế đã tách khỏi operator, RNA polymerase vẫn không thể bám ổn định vào promoter và khởi đầu phiên mã - nó không có ái lực đủ cao đối với promoter để bám vào đủ lâu để có thể khởi đầu tạo thành liên kết phosphodiester đầu tiên. . Di truyền phân tử ( phần 9 ) Các thể đột biến của lac operon: các gene cấu trúc, operator, gene điều hoà và promoter 1. Các đột biến ở các promoter và operator Nói chung, các đột biến ở các. thuỷ phân lactose dưới tác dụng của β- galactosidase, gọi là allolactose (liên kết β-1, 6). 1. Cấu trúc của lac operon Các thành phần của lac operon ở E. coli như sau : Cấu trúc chi tiết các. khác nhau của operon lactose. - Nhóm các gene cấu trúc bao gồm ba gene: lacZ, lacY và lacA (nói gọn là Z, Y và A); trong đó lacZ mã hoá cho b galactosidase (thuỷ phân lactose), lacY mã hoá