QUY TRINH CONG NGHE SAN XUAT HIGH FRUTOSE SYRUPx

quy trình công nghệ sản xuất HFS

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN

1.1 High fructose corn syrup (HFCS)

1.1.1 High fructose corn syrup (HFCS)

1.1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng high fructose corn syrup1.2 Glusose isomerase

1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc Streptomyces spp.

1.3.1.1 Cấu trúc tế bào và trao đổi chất

1.3.1.2 Đặc điểm của Steptomyces

1.3.2 Phân lập Streptomyces flavogrieus

1.3.3 Chiết xuất enzyme glucose isomerase

1.3.4 Xác định hoạt tính glucose isomerase

II CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE ISOMERASE

2.1 Đặc điểm của enzyme cố định

I TỒNG QUAN

1.1 High fructose corn syrup (HFCS)

1.1.1 High fructose corn syrup (HFCS)

HFCS được gọi là isoglucose ở Anh và glucose-fructose ở Canada, và lần đầu tiên được giới thiệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát trong cuối những năm 1960 (HFCS-42 vào năm 1967) và 1970 (HFCS-55 năm 1977) để cải thiện sự ổn định và chức năng khác nhau của thực phẩm và đồ uống Chất làm ngọt Carbohydrate được sử dụng bởi

vì nó tăng cường hương vị các loại thực phẩm khác nhau Nó chủ yếu là monosaccharides như glucose, fructose, galactose và disaccharides như sucrose, lactose, maltose Người ta tìm kiếm chất ngọt thay thế succrose và không nhiều calo để đảm bảo sức khỏe cho bệnh nhân tiểu đường, đồng thời kiểm soát cân nặng Để sản xuất của HFCS tương đối ít kinh phí đã làm cho nó có thể trở thành một giải pháp thay thế hữu hiệu đối với sucrose và đường tự nhiên khác

Hiện chủ yếu người ta sản xuất hỗn hợp glucose (52%) và fructose (42%) từ tinh bột ngô với sản lượng hàng năm khoảng 10 triệu tấn sirô fructose HFCS (high-fructose corn syrup) Điều này càng trở nên thuận tiện hơn khi sử dụng glucose isomerase cố định sử dụng được nhiều lần (Nguyễn Tiến Thắng, 2010)

Marshall và Kooi (1957) đã phát triển quy trình sản xuất high fructose corn syrup (HFCS) Ba loại HFCS được sử dụng phổ biến: HFCS-90 (90% fructose và glucose 10%) được sử dụng trong các ứng dụng chuyên biệt, nhưng quan trọng hơn hỗn hợp glucose syrup: HFCS-42 (42% fructose và glucose 58%) và HFCS-55 (55% fructose và glucose 45%)

1.1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng high fructose corn syrup

HFCS được sản xuất chủ yếu từ ngô Ngô được ngâm để làm mềm hạt cứng, tiếp theo xay ướt và tách thành tinh bột ngô (từ nội nhũ); vỏ ngô, protein và dầu (từ mầm) Tinh bột ngô bao gồm các phân tử đường dài, bao gồm amylose và amylopectin và cần gia nhiệt hoặc thêm HCl cộng với hoạt động của ba loại enzyme khác nhau để phá vỡ nó thành đường glucose đơn giản và đường fructose trong HFCS Một loại enzyme công nghiệp α-

amylase sản xuất từ vi khuẩn Bacillus spp, thủy phân tinh bột ngô thành chuỗi ngắn dextrin

và oligosaccharides Một loại enzym thứ hai, glucoamylase (còn gọi là amyloglucosidase),

được sản xuất từ nấm như Apergillus, phá vỡ dextrin và oligosaccharides thành đường đơn

glucose Các sản phẩm của hai loại enzyme là glucose syrup Enzyme thứ ba và tương đối đắt tiền được sử dụng trong quá trình này là glucose isomerase (còn gọi là D-glucose ketoisomerase ketolisomerase D-xylose), có thể chuyển đổi giữa glucose với fructose Α-amylase và glucoamylase được sử dụng chỉ một lần, glucose isomerase được tái sử dụng cho đến khi nó mất đi hầu hết các hoạt động enzyme của nó α-amylase và glucoamylase được sử dụng tạo ra HFCS đã được biến đổi để cải thiện sự ổn định nhiệt trong việc sản xuất HFCS

Sau khi tinh sạch và loại bỏ tạp chất, HFCS-90 được trộn với glucose syrup để sản xuất HFCS-55 (55% fructose) và HFCS-42 (42% fructose) Cả hai HFCS-55 và HFCS-42 có nhiều ưu điểm về chức năng giống nhau, nhưng mỗi loại có đặt tính đăc biệt làm cho nó phù hợp với các loại thực phẩm cụ thể.Vì hàm lượng fructose cao, HFCS-55 ngọt hơn đường sucrose và do đó được sử dụng rộng rãi như là chất tạo ngọt trong nước trái cây, và các đồ uống có gas HFCS-42 có một vị ngọt nhẹ và không làm ẩn đi những hương vị tự nhiên của thực phẩm.Vì vậy, nó được sử dụng rộng rãi trong trái cây đóng hộp, nước sốt, súp, gia vị, bánh nướng, và nhiều loại thực phẩm chế biến khác Nó cũng được sử dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp sữa như sữa chua, sữa hương vị, kem, và món tráng miệng đông lạnh khác.Việc sử dụng HFCS đã tăng lên kể từ khi được giới thiệu như là một chất làm ngọt

HFCS tương đối rẻ, ngọt hơn succose, hòa tan trong dung dịch tốt HFCS là chất lỏng

và do đó dễ dàng vận chuyển và sử dụng trong các công thức đồ uống nhẹ (Hanover và White, 1993).Nó cũng có tính axit , có khả năng bảo quản nên làm giảm việc sử dụng các chất bảo quản khác

hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm

1.2.1.2 Cơ chế xúc tác enzyme:

Cơ chế xúc tác enzyme thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

E + S → ES → P + ETrong đó: E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme – cơ chất, P

là sản phẩm (Product)

Hình Chức năng của enzyme Sư tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất

và chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm (Prescott, Harley và Klein, 2005)

– Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng họa thóa thấp.

– Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

– Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng

tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tương tác tỉnh điện, liên kết hydro, tương tác Van det Waals Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

1.2.1 Sơ lược enzyme glucose isomerase (GI)

D-Glucose/xylose isomerase (D-xylose isomerase ketol; EC 5.3.1.5), thường được gọi

là glucose isomerase (GI), một trong ba enzym có giá trị cao nhất, rồi đến amylase và protease Theo Wiseman, GI có thể là quan trọng nhất trong tất cả các enzyme công nghiệp trong tương lai Nó xúc tác đồng phân hóa thuận nghịch D-glucose và D-xylose thành D-fructose và D-xylulose Sự chuyển đổi xylose thành xylulose phục vụ một nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn hoại sinh phát triển mạnh trên cây mục nát và cũng hỗ trợ trong chuyển hóa sinh học của hemicellulose để sản xuất ethanol Đồng phân hóa glucose thành fructose có tầm quan trọng thương mại trong việc sản xuất HFCS Sucrose có nguồn gốc từ

củ cải đường (40%) và mía (60%) là các chất làm ngọt chính trên thế giới cho đến năm

1976 Việc sản xuất HFCS bằng cách sử dụng isomerase glucose được phát triển đầu tiên ở Nhật Bản và sau đó tại Hoa Kỳ

Nguồn gốc của phát triển thành công ngày hôm nay của sản phẩm fructose syrup nằm trong sự phát hiện của enzyme glucose-isomerizing Việc phát hiện của Marshall và Kooi

năm 1957 về khả năng của enzyme glucose-isomerase từ Pseudomonas hydrophila là điểm

khởi đầu của khai thác các enzyme này để sản xuất HFCS như một sự thay thế cho đường mía Mặc dù ái lực của enzyme này cho glucose là thấp hơn 160 lần so với xylose, nhưng

các enzym cũng có giá trị thương mại đáng kể Takasaki và Tanabe đã phân lập từ Bacillus megaterium AI một glucose isomerase (EC 5.3.1.18) Một hoạt động tương tự như glucose

isomerase, xúc tác các đồng phân hóa của cả hai glucose và mannose fructose, được phân

lập từ Paracolobacterium aerogenoides Glucose isomerase sản xuất bởi vi khuẩn axit Heterolactic yêu cầu xylose như một chất cảm ứng và tương đối ổn định ở nhiệt độ cao

Với nhiệt ổn định và không không yêu cầu cofactors đắt tiền như NAD1 hoặc ATP cho hoạt động Tiềm năng cho việc sử dụng thay thế đường sản xuất từ tinh bột đã được đề xuất Các chế phẩm enzyme dùng đồng phân hóa glucose lần đầu tiên được thực hiện trên một quy mô công nghiệp vào năm 1967 Nhu cầu đối với HFCS trong ngành công nghiệp thực phẩm gia tăng, và đến năm 1980, thực tế tất cả các công ty lớn chế biến tinh bột trong giới phương Tây đã phải dùng đến công nghệ GI Ngày nay,

enzyme chiếm lĩnh thị trường lớn nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm

Hình Cấu trúc không gian của GIEnzyme so với đồng phân hóa trong hóa học Việc chuyển đổi hóa học của glucose thành fructose đã được biết đến từ 100 năm qua và tạo thành một trong 1 nhóm phản ứng Những phản ứng này thường được thực ở pH và nhiệt độ cao Khả năng sản xuất fructose

hóa học từ glucose đã được nghiên cứu bởi Barker et al Phản ứng này là không đặc hiệu

và dẫn đến hình thành các đường nonmetabolizable như psicose và các sản phẩm màu không mong muốn khác khó khăn để đạt được một fructose nồng độ hơn 40% theo phương pháp này Hơn nữa, hóa học sản xuất fructose có hương vị và vị ngọt giảm, không thể dễ dàng khắc phục Do đó, nó không thể được sử dụng thương mại Mặt khác, enzyme chuyển đổi glucose thành fructose có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như đặc trưng của phản ứng, yêu cầu các điều kiện pH và nhiệt độ của môi trường xung quanh của, và không hình thành các sản phẩm phụ Vì vậy, enzyme chuyển đổi đồng phân hóa hóa học của glucose thành fructose, và ngày nay đã có các quá trình liên quan đến GI đáng kể trong việc mở rộng thị trường công nghiệp

Glucose isomerase chủ yếu được thu nhận từ vi khuẩn Ứng dụng của enzyme này trong sản xuất công nghiệp được bắt đầu từ khi áp dụng công nghệ sử dụng enzyme glucose isomerase cố định trên chất mang không tan

Glucose isomerase từ Lactobacillus sp cần có mặt Co2+ và Mg2+ để hoạt hóa Glucose

isomerase từ Streptomeces có pH optimum 8,0 – 8,5, MW 165.000 – 180.000 Da, ổn định trong khoảng pH 5,0 – 11,0 Glucose isomerase từ Bacillus coagulans do hang Novo cung

cấp có thể hoạt động ở 90oC, nhưng bền hơn cả là ở 60 – 65oC, pH optimum 8,0 – 8,5 Một số sản phẩm glucose isomerase thương mại trình bày trong bảng (Nguyễn Tiến Thắng, 2010)

Taka - Sweet Solvey Enzyme [SOE] S olivaceus

G-zyme G 993 CPC International/Div S olivochromo

Enzyme Biosystems [CPC]

Roquette Freres S.A [RF] S violacenoniger

Sweetzyme Novo Nordisk A/S [NO] Bacilluscoagu

Glucoisomerase Biological Products [ICI] Arthrobacter sp.

1.2.2 Phản ứng đồng phân hóa

Các thí nghiệm được thực hiện trong bình phản ứng sinh học Chất xúc tác là Sweetzyme IT với kích thước hạt từ 0,4 – 1,0 mm, được cung cấp bởi Novozyme A/S (Bagsvaerd, Denmark) Sweetzyme IT là một cấu trúc xốp mang enzyme cố định glucose isomerase.

Một trong những cơ chế động học được xúc tác bởi enzyme glucose isomerase là cơ chế thuận nghịch Briggs-Haldane với k là giá trị hằng số không đổi (A Converti, M Del Borghi, 1997)

Tham số động học của toàn bộ phản ứng có thể tính được bằng phương pháp Lineweaver-Burk.

Dung dịch glucose và fructose được chuẩn bị với nồng độ 0.5; 1.0; 2.0 và 3.0 mol/L Thêm vào 20 g/L dung dịch thuốc thử heptahydrated maige sulphate (MgSO4.7H2O) để dung dịch hoạt động và bền Đầu tiên, tất cả các dung dịch phải được loại khí, tối thiểu 2h để đảm bảo khí hoà tan sẽ không gây ảnh hưởng đến phản ứng.Sử dụng 0.05 mol/L dung dịch đệm Tris để giữ pH của dung dịch ở mức 7.7 – 7.8.

Thêm vào 60 mL dung dịch thuốc thử và 1 g Sweet-zyme IT cho mỗi thử nghiệm Bình phản ứng được khuấy ở 150 rpm và nhiệt độ 328 K Khoảng 50

μ L sẽ được lấy ra từ bình phản ứng tương ứng ở các khoảng thời gian đặc trưng và được pha loãng ở các khoảng nồng độ trong một bộ cảm biến RI Dung dịch glucose và fructose sẽ được xác định bằng phương pháp cột sắc ký lỏng cao

áp, sủ dụng bộ cảm biến RI.

Tham số động học nhận được được trình bày ở bảng 2 Gía trị hệ số cân bằng

Kc, xác định khả năng tạo sản phẩm fructose dưới điều kiện thử nghiệm được sử dụng Ở bảng 2, có thể một vài tham số động học của phản ứng đồng phân quang học glucose đã được đưa ra

Trong lò phản ứng, khối lượng cân chính xác được biểu diễn trong giới hạn cho phép của sự chuyển hoá:

(17)

Với W là khối lượng xúc tác trong bình phản ứng và X là thuốc thử chuyển hoá Tham số φ là:

Từ việc áp dụng biểu đồ phương pháp Linewaever-Bruck, xác định nồng độ trong thử nghiệm ban đầu là một hàm số theo thời gian Công thức (17) được dùng

để xác định tham số của tất cả các điểm của đường cong thử nghiệm Phương pháp hồi quy tuyến tính được đưa ra, chỉ rõ hàm số của công thức (17), toàn bộ phương trình hồi quy không những xác định giá trị của tham số mà còn cho biết giá trị tổng nhỏ nhất của phần còn lại để từ đó thiết lập dữ liệu cho các thử nghiệm Ở phương pháp này, hệ số cân bằng có giá trị là 1.04.

Biểu đồ 3 trình bày một vài kết quả thử nghiệm và dự đoán vài mẫu mô phỏng toàn bộ phản ứng – CT (13) – với tham số được liệt kê ở bảng 3 Theo hình minh hoạ, cả hai mẫu sản phẩm fructose và glucose được chỉ ra cho phản ứng đồng phân học, sử dụng dung dịch thuốc thử ban đầu có nồng độ 0.5 và 1.0 mol/ L.

Biểu đồ tính toán trình bày sự cân bằng trong thử nghiệm, và xác định toàn bộ giá trị của phản ứng, có lợi cho việc dự đoán phản ứng đồng phân học của glucose.

Sự tác động từ ngoài vào trong khiến đường được chuyển hoá Tất cả các thử nghiệm đều được kiểm tra dưới điều kiện tiến hành áp dụng cho thử nghiệm này,

sự khuếch tán vào bên trong màng film và khuếch tán vào trong các lỗ xốp thì không có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình phản ứng.

1.2.3 Động học phản ứng đồng phân hóa glucose thành fructose

Enzyme cố định Sweetzyme IT, glucose isomerase thương mại có sẵn thu được từ Công

ty Novozyme, Đan Mạch được sử dụng trong nghiên cứu này Ba mẫu glucose 10g, 15g và 20g được cân cẩn thận, sau do them 100 ml nước khử ion vào ba mẫu trong ba bình tam giác 250ml để làm cho dung dịch đường glucose nồng độ ban đầu của 10, 15 và 20% tương ứng Tất cả các bình được đậy lại bằng lá nhôm trong suốt thí nghiệm để ngăn chặn

sự bay hơi nước Ba khối lượng enzyme khác nhau 0,5, 1,0 và 1,5 g được thêm vào 3 bình chứa 3dung dịch đường khác nhau Mẫu được đặt riêng biêt trong một chậu nước rung (Julabo SW23) được trang bị kiểm soát nhiệt độ vôi đo chính xác (+ 0,1°C) Các đồng phân hóa nhiệt độ bao phủ khoảng 40-70°C Tốc độ lắc đã được cố định tại 125 rpm trong tất cả các thí nghiệm đồng phân hóa

Các mẫu được phân tích đường sau mỗi hai giờ bằng cách sử dụng HPLC (Agilent

1100 series, mô hình G1362A) được trang bị một máy dò RI Zorbax cột phân tích carbohydrate, 4,6 mm x 150 mm, được duy trì ở 35ºC, được sử dụng để phân tích đường Giai đoạn di động (acetonitril trong nước khử ion; 70:30%) tốc độ dòng chảy là 1,5 ml / phút

Ban đầu, các thí nghiệm đồng phân hóa được thực hiện để tối ưu hóa việc nạp enzyme

và nhiệt độ phản ứng Kết quả của việc tối ưu hóa và các mô hình động đề xuất được trình bày trong các phần phụ sau

Trong các thí nghiệm tối ưu hóa sơ bộ, phản ứng nhiệt độ đã được thay đổi từ 40 đến 70°C glucose ban đầu nồng độ 10%, 15% và 20% và khối lượng enzyme 0,5 g Kết quả cho thấy: ở 40°C, thời gian phản ứng hơn 60h không có sự khác biệt đồng phân hóa glucose đạt được (8,3%, 8,1% và 7%) tương ứng với các nồng độ ban đầu 10%, 15% và 20% Như vậy, để có được đồng phân hóa glucose cao hơn, thời gian phản ứng được tăng lên đến mức cao nhất có thể Kết quả của việc tăng nhiệt độ đồng phân hóa đến 60°C cho thấy có sự chuyển đổi dạng kế của glucose Glucose chuyển đổi ở 60°C đạt 40%, 29,8% và 27,8% tương ứng với glucose ban đầu nồng độ 10%, 15% và 20% Sau khi tăng thêm nhiệt

độ đồng phân hóa đến 70°C, glucose chuyển đổi đạt 40,9%, 35,8% và 33,6% Nhiệt độ phản ứng thí nghiệm tối ưu hóa cho thay giá trị chuyển đổi glucose ở 70°C là gần với những kết quả thu được ở 60°C và cao hơn đáng kể so với những kết quả thu được ở 40°C Tuy nhiên, tăng thêm nhiệt độ phản ứng vượt quá 70°C là điều không nên làm, vì nó sẽ dẫn đến hiện tượng caramen hóa của đường, do đó mang lai màu sắc không mong muốn đến kết quả cuối cùng của dung dich đường Để tối ưu hóa tải enzyme, đồng phân hóa 10% dung dịch glucose đã được tiến hành ở 60°C cho khối lượng ban đầu của enzyme 0,5, 1,0

và 1,5 g Kết quả thí nghiệm như vậy cho thấy, tại khoảng thời gian phản ứng 40h khối

lượng enzyme ban đầu 1.0 va 1.5 có sự khác biệt đáng kể về sự chuyển hoá thành fructose (51,9% và 58,9%), trong khi đó với khối lượng enzyme ban đầu là 0,5 g chỉ là 40% sau 60 giờ thời gian phản ứng đã được thể hiện trong hình 1.

Hai mô hình đã được nghĩ ra để mô tả các động học của phản ứng đồng phân hóa glucose bằng cách sử dụng các dữ liệu thử nghiệm cho các nạp enzyme 1g ở nhiệt độ phản ứng của 50ºC, 60ºC và 70ºC và nồng độ glucose ban đầu 10%, 15% và 20% Mô hình đầu tiên là một mô hình đơn giản không có hình phức tạp (gọi là Model 1) và thứ hai là một mô hình phức tạp với một hình thành một bước phức tạp (gọi là Mô hình 2) Cả hai mô hình giả định động học thứ tự đầu tiên cho các bước khác nhau Việc kích hoạt nguồn năng lượng tương ứng và các yếu tố theo hàm số mũ trước được đánh giá bằng cách sử dụng phần mềm Excel và Runge-Kutta thuật toán lệnh tự thứ tư và phương pháp bình phương it nhất cho giảm thiểu sai sót Hằng số tốc độ được giả định theo Arrehenius

1.3 Streptomyces flavogrieus

1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc Streptomyces spp.

Streptomyces là lớn nhất chi của Actinobacteria và chi nhập của gia đình

streptomycetaceae Hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả Cũng như với các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn gram dương, được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát Streptomyces có khả năng sản xuất bào tử Streptomyces

được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces ) Streptomyces thường sống ở đất và có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

1.3.1.1 Cấu trúc tế bào và trao đổi chất

Streptomyces được tìm thấy trên toàn thế giới, nhất là trong đất Chúng đóng một vai

trò quan trọng trong sự phân giải các chất hữu cơ, thường có nhiều trong các đống phân ủ

Streptomyces có cấu trúc giống nấm Nhánh của chúng sự sắp xếp của các tế bào hình

sợi thành một mạng lưới gọi là sợi nấm Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác nhau bao gồm: đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất các enzym thủy phân ngoại bào Do gen của chúng lớn nên trao đổi chất của chúng cũng đa dạng,