Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR ppsx

Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR The PCR technique was patented by Cetus Corporation, where Mullis worked when he invented the technique. The Taq polymerase enzyme is also covered by patents. There have been several high-profile lawsuits related to the technique, including most famously a lawsuit brought by DuPont. The pharmaceutical company Hoffmann-La Roche purchased the rights to the patents in 1992 and currently holds them. Thực nghiệm PCR Figure 1: PCR machine PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base. Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD. Đoạn mồi Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới. Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C. Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là tương tự nhưng không giống nhau. Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin isoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR. Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C - Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50°C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … - Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổ sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp với mẫu. Có cả chương trình hỗ trợ việc thiết kế mồi (xem External links) Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2) (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút. (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút. [[Tập tin:pcr.png|frame|none|Figure 2: Hình 2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ. Ví dụ Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân đoạn 250bp của đầu C của insulin-like growth factor (IGF). Hỗn hợp phản ứng gồm:  1.0 µl DNA khuôn (100 ng/µl)  2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mỗi mồi(100 ng/µl)  1.0 µl Pfu-Polymerase  1.0 µl nucleotide  5.0 µl đệm  89.5 µl H 2 O 100 µl hỗn hợp phản ứng ( sử dụng ống eppendorf 200 μl) được đưa vào máy PCR. Quy trình PCR bao gồm các bước sau: Bước 1 Khởi đầu. Đun hỗn hợp ở 96°C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng. DNA-Polymerase có thể có trong giai đoạn khởi đầu, hoặc nó có thể được thêm vào ngay sau bước này. Bước 2 Biến tính (Melting). 96°C trong 30 giây. Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ để biến tính DNA. Bước 3 Gắn mồi (Annealing). 68°C trong 30 giây. Bước 4 Kéo dài (Elongation).72°C trong 45 giây. Bước 5 Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy nhiên với mồi và polymerase tốt, 15 đến 20 chu kỳ có thể là đủ. Bước 6 Giữ hỗn hợp ở 7°C. Tại nhiệt độ này DNA sẽ không bị hư hại trong vòng 1 đêm. Figure 3: PCR product compared with DNA ladder in agarose gel. DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3). Image published with permission of Helmut W. Klein, Institute of Biochemistry, University of Cologne, Germany Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc sử dụng sắc ký gel agarose. Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc nhỏ mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy điện di trên gel. Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương. Kích thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh vói thang DNA, thang này có chứa các DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel (hình 3). Tối ưu hoá PCR Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn. [sửa]Recent developments in PCR techniques  A more recent method which excludes a temperature cycle, but uses enzymes, ishelicase- dependent amplification.  A style of PCR that reduces nonspecific primer annealing is Touchdown PCR.  Real-Time PCR is a quantative PCR technique. Những ứng dụng của PCR PCR can be used for a broad variety of experiments and analyzes. Some examples are discussed below. Vân tay di truyền Genetic fingerprinting is a forensic technique used to identify a person by comparing his or her DNA with a given sample, e.g., blood from a crime scene can be genetically compared to blood from a suspect. The sample may contain only a tiny amount of DNA, obtained from a source such as blood, semen, saliva, hair, etc. Theoretically, just a single strand is needed. First, one breaks the DNA sample into fragments, then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint. ]Kiểm tra huyết thống Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. [...]... tích mẫu DNA cổ Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old PCR techniques have been successfully used on animals, such as a fortythousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptianmummies to the identification of a Russian tsar Xác định kiểu gene của các đột biến Through the use of allele-specific PCR, one can easily... back into DNA (complementary DNA to be precise, known as cDNA), at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT -PCR In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will be generated When the product of the PCR reaction are run on an agarose gel (see Figure 3 above) a band, corresponding to a gene,... hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced to detect mutations Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA This analysis is possible right after infection, which can be from several... sequences in two fundamentally different ways in the PCR process Site-directed mutagenesis allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process In the case of random mutagenesis, the... or more SNPs occur together on the same chromosome [Linkage Disequilibrium]) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic recombination So sánh mức độ biểu hiện của gene Researchers have used traditional PCR as a way to estimate changes in the amount of a gene's expression Ribonucleic acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior to making a protein, and those strands... brighter) By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest A quantative RT -PCR method has been developed, it is called Real-Time PCR ... occur Such early Tách dòng gene Cloning a gene not to be confused with cloning a whole organism describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (a vector is a means of inserting a gene into an organism) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig 5) The DNA can... protein that it determines the production of) can also be a way of mass- producing usefulproteins for example, medicines Figure 5: Cloning a gene using a plasmid (1) Chromosomal DNA of organism A (2) PCR (3) Multiple copies of a single gene from organism A (4) Insertion of the gene into a plasmid (5) Plasmid with gene from organism A (6) Insertion of the plasmid in organism B (7) Multiplication or... interest is a T or C single nucleotide polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one containing a primer ending in T, and the other ending in C The common primer would be the same Following PCR, these two sets of reactions would be run out on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the individual is homozygous T, homozygous C, or heterzygous T/C This methodology has several . Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR The PCR technique was patented by Cetus Corporation, where Mullis worked when he. hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR. Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào. that reduces nonspecific primer annealing is Touchdown PCR.  Real-Time PCR is a quantative PCR technique. Những ứng dụng của PCR PCR can be used for a broad variety of experiments and