Trong bài này chúng tôi trình bày kỹ thuật: Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự đặc hiệu PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers để định nhóm HLA
Trang 1TCNCYH 23 (3) 2003
ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA
TS Bạch Khánh Hoà
Labo trung tâm y sinh học, Đại học Y Hà Nội
Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở người chiếm một vùng khoảng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu người (HLA: Human leucocyt Antigen) được xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa dạng các mảnh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP) Ngày nay, kỹ thuật được sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe Phân tử HLA rất đa dạng, các kháng nguyên này gây ra cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào
Trong bài này chúng tôi trình bày kỹ thuật: Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự
đặc hiệu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) để định nhóm HLA nhằm mục đích sử dụng trong lâm sàng chọn hoà hợp người cho và người nhận tạng mà chúng tôi
đã thực hiện ở Việt Nam từ 2000
1 Mở đầu: kháng nguyên miễn dịch bạch
cầu của người (human leucocyte antigen-
HLA) nằm một phần quan trọng trong hệ thống
di truyền, được gọi là hệ thống chủ yếu hoà hợp
mô (complex major histocompatibilite –
CMH), hệ thống này nằm trên cánh ngắn của
nhiễm sắc thể số 6 (đoạn 6p21.3) Lần đầu tiên
hệ thống này được phát hiện bởi J.Dausset,
1958, và ông đã được nhận giải thưởng Nobel
về Y học năm 1980 [1] HLA có vai trò chủ
đạo trong đáp ứng miễn dịch Tính đa dạng
trong cấu trúc đã dẫn đến những khó khăn
trong xác định kháng nguyên và hiểu biết về
chức năng của nó ứng dụng trong lâm sàng
Vai trò của HLA trong sự nhận biết cái tôi và
không phải tôi rất quan trọng trong ghép cơ
quan, ghép tuỷ, cũng như đáp ứng miễn dịch ở
mức độ peptit Như vậy, với những cấu trúc và
chức năng khác nhau phân tử HLA giúp cho
chúng ta hiểu ngày càng rõ hơn cơ chế đáp ứng
miễn dịch
2 Kỹ thuật định nhóm HLA: trải qua
nhiều giai đoạn kể từ khi phát minh ra hệ thống
HLA cho đến nay có rất nhiều kỹ thuật đã được
áp dụng trong việc xác định kháng nguyên của
hệ thống này, người ta tạm chia nó ra làm hai
nhóm: kỹ thuật huyết thanh học và kỹ thuật
sinh học phân tử nhằm xác định tính đa dạng của HLA bộc lộ trên bề mặt tế bào
2.1.Kỹ thuật huyết thanh học: những năm
1954 là những năm đầu tìm hiểu về hệ thống HLA, người ta chỉ dùng phản ứng ngưng kết bạch cầu sau đó tiến thêm một bước, đó là kỹ thuật vi độc tế bào tiêu thụ bổ thể Dùng tế bào bạch cầu sau khi tách qua Ficoll rồi nhỏ vào các giếng đã có những huyết thanh mang kháng thể đặc hiệu được biết trước, sau đó nhỏ thêm
bổ thể thỏ sẽ dẫn đến hiện tượng chết tế bào nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể và xác định hiện tượng này thông qua nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm, đọc kết quả dưới kính hiển vi đảo ngược Cho đến nay kỹ thuật này vẫn được sử dụng ở nhiều phòng xét nghiệm Trong bài này chúng tôi đề cập đến những
kỹ thuật đang được sử dụng nhiều nhất, đó là những kỹ thuật về sinh học phân tử
2.2 Sự phát triển ngày càng gia tăng trong nuôi cấy dòng tế bào thì sự hiểu biết gen của
lớp I (1980) và lớp II (1982) cũng ngày càng sâu sắc hơn giúp cho giải thích được ADN bổ sung và bộ gen (genomique) cho phép chúng ta
sử dụng sonde thứ hai của HLA.Người ta có thể
sử dụng sond này trong phản ứng lai với ADN của bộ gen để nghiên cứu tính đa dạng của loci
Tiến sĩ, phó trưởng Labo Trung tâm Y sinh học – trường Đại học Y Hà Nội
Trang 2TCNCYH 23 (3) 2003
hay của allen Kỹ thuật sinh học phân tử đầu
tiên được áp dụng trong định nhóm HLA dựa
trên sự phân tích số lượng và kích thước đoạn
ADN lai với sond đặc hiệu của HLA sau khi
nó bị cắt bởi enzym giới hạn Kỹ thuật này gọi
tên là " tính đa dạng các mảnh do men hạn chế
“(RFLP) [2] Đây là kỹ thuật định nhóm HLA
được sử dụng chủ yếu trong workshop-HLA
1997, và cho thấy có nhiều tiến bộ quan trọng,
nhất là trong xác định và nghiên cứu tính đa
dạng của lớp II, trong ghép cơ quan và tổ chức
Kỹ thuật RFLP cũng lần đầu tiên cho phép xác
định HLA-DP mà không cần đến kỹ thuật tế
bào và giải thích những hiện tượng không
giống nhau của DP trong nuôi cấy hỗn hợp hai
quần thể tế bào (culture mixte) [3] Nó cũng
còn là một cuộc cách mạng về mối liên quan
giữa HLA và bệnh, miễn dịch kháng bạch cầu
giữa mẹ và con [4]
Kỹ thuật phản ứng chuỗi khuyếch đại gen
(polymerase chain reaction - PCR) là một cuộc
cách mạng cho mọi nghiên cứu về gen, giải
trình tự gen, và nhất là nghiên cứu về tính đa
dạng Kỹ thuật này có độ nhạy cao, đặc hiệu và
đơn giản trong những nghiên cứu về gen Điều
quan trọng trong là sự chọn lựa đoạn mồi sao
cho đạt được những yêu cầu về tính đặc hiệu
Dựa trên những nguyên tắc chính mà người ta
tạm chia nó làm 3 nhóm phương pháp như sau:
Phản ứng chuỗi polymerase với những
oligosondes đặc hiệu đánh dấu phóng xạ hoặc
enzym của allele hay trình tự gen (PCR-SSO:
Polymerase Chain Reaction -Sequence Specific
Oligoprobes)
Tính đa dạng các mảnh do men hạn chế
(RFLP)
Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi
có trình tự đặc hiệu (PCR- SSP)
Kỹ thuật PCR cho phép đánh dấu sự tiến bộ
trong xác định tính đa dạng của gen HLA lớp II
và nhận biết được chính xác những alleles khác
nhau của DRB1 và DPB1 Tính đa dạng của lớp
I cũng gặp những khó khăn khi sử dụng kỹ
thuật PCR vì lý do giàu pseudogenes cùng
khuyếch đại trong vùng của lớp I
2.3 Kỹ thuật PCR-SSP: ngày nay trong
nhiều phòng thí nghiệm hoà hợp mô trên thế giới người ta sử dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật thường quy để định nhóm kháng nguyên bạch cầu, 1999 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An và cộng sự của bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh trường Đại học Y Hà Nội đã thực hiện kỹ thuật này để định nhóm DRB1 [2] Từ tháng 10-
2000 tại phòng thí nghiệm Y Sinh học của trường Đại học Y Hà Nội, chúng tôi cũng đưa vào thực hiện kỹ thuật PCR-SSP để định nhóm cho HLA- A, B, DR, DQ Loại kit chúng tôi sử dụng là “Độ phân giải thấp (Low resolution)” của Dynal, nó cho kết quả tương đương với kết quả làm huyết thanh học Kỹ thuật PCR-SSP
được sử dụng để chọn lựa người cho và người nhận trong ghép tuỷ, ghép cơ quan, tìm mối liên quan giữa HLA với một số bệnh Đối với kít “Độ phân giải cao (High resolution)” xác
định được allele có mặt trên nhiễm sắc thể sẽ cho kết quả có độ phân tích cao hơn nhưng giá thành đắt Vì vậy chúng tôi lựa chọn kỹ thuật PCR-SSP độ phân giải thấp dựa trên những
điểm sau:
- Chất lượng kỹ thuật: không cho hoặc rất ít hiện tượng dương tính giả
- Thời gian thực hiện kỹ thuật ngắn
- Giá thành xét nghiệm không cao
- Trang thiết bị trong phòng thí nghiệm của chúng tôi đảm bảo thực hiện được kỹ thuật này Không gây độc nhiều cho người thực hiện
do hoá chất sử dụng gây ra
Vì vậy, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật này phù hợp với tình hình thực tế ở Việt Nam
Kỹ thuật PCR-SSP là kỹ thuật sử dụng những mồi được khuyếch đại từ phía đầu tận 3’ Phản ứng chỉ bao gồm 2 giai đoạn chính là PCR và điện di trên gen agarose để đọc kết quả
Các bước tiến hành như sau:
Tách ADN từ máu toàn phần theo kỹ thuật perchlorate sodium (kỹ thuật S.A Miller, D.D Polesky- 1988)
.Thực hiện phản ứng PCR bằng kit Dynal: trong mỗi tube đã có sẵn mồi đặc hiệu và nhỏ
Trang 3TCNCYH 23 (3) 2003
thêm 10 àl bao gồm: 0.1 àl Amplitaq DNA
polymerase, 8,9àl đệm SSP-PCR Maaster mix,
1àl DNA cần xác định, trộn kỹ và chạy trên
máy khuyếch đại gen Gene Amp PCR system
9700 với chu kỳ: 96oC trong 2 phút, tiếp đến 10
chu kỳ: 96oC trong 15 giây, 65oC trong 60 giây,
và 20 chu kỳ: 96oC trong 10 giây, 61oC trong
50 giây, 72oC trong 30 giây
Điện di trên gen agarose 2% trong đệm
TAE 0.5M, 100vol trong 15phút
Chụp ảnh và phân tích kết quả bằng phần
mềm của Dynal bán kèm theo kit
Chúng tôi cũng xin trình bày sơ lược về quy
định danh pháp quốc tế: do có sự tiến bộ trong
kỹ thuật định nhóm HLA nên các quy định về danh pháp cũng thường xuyên được thông qua
ở các hội nghị quốc tế về HLA, nó cho phép phân biệt kỹ thuật sử dụng trong định nhóm HLA là huyết thanh học hay sinh học phân tử [4] Bằng kỹ thuật sinh học phân tử người ta quy định cách viết như sau:
HLA + locus + * + alen (2 hoặc 4 con số)
Hình 1: Kết quả sản phẩm PCR-SSP sau điện di trên gen agarose 2%
2 con số đầu tương ứng với tính đặc hiệu
của kháng nguyên được xác định
(A* 01 là kháng nguyên A1) điều này đôi
khi không đúng với một số alen ví dụ trong
nhóm alen B*15 thì B*1502 tương ứng với
kháng nguyên được xác định bằng huyết thanh
học là B75, ngược lại có trường hợp có những
alen được phát hiện bằng kỹ thụât sinh học
phân tử mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện được
Các áp dụng chính trong việc định nhóm
HLA bằng kỹ thuật PCR-SSP: đối với kỹ thuật
PCR-SSP chúng tôi đã ứng dụng trong lâm sàng
với một số trường hợp sau:
HLA và bệnh: tuỳ thuộc vào lớp I hay lớp
II mà người ta đã đưa ra những mối liên quan giữa HLA và một số bệnh như : viêm cột sống dính khớp, đái đường không phụ thuộc insulin týp I…và dựa vào mối liên quan này người ta
đã đưa ra những cơ chế mà trong đó peptid của phân tử HLA giữ vai trò chủ yếu
Định nhóm HLA trong ghép: dựa trên nhóm HLA được xác định giữa người cho và người nhận để quyết định có ghép thận cho bệnh nhân hay không?
Tóm lại: do chức năng trình diện đặc hiệu kháng nguyên peptid, do tính đa dạng của các phân tử được biểu lộ, vai trò phân định danh
Trang 4TCNCYH 23 (3) 2003
mục của lymphô T nên hệ thống HLA đóng
một vai trò chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch
Điều này giải thích những đóng góp của hệ
thống này trong ghép , trong mối liên quan của
nó với một số bệnh, trong cảnh giác với phát
triển u, trong truyền máu và trong nghiên cứu
quần thể hay trong pháp y
Nếu việc mô tả tính đa dạng của phân tử và
gen học đã cho những thành công liên tục trong
ghép (đặc biệt trong ghép tuỷ xương) Những
nghiên cứu về trình tự kháng nguyên và gen
còn giải thích được ngày càng rõ hơn sự liên
quan trong tính nhạy cảm hay đề kháng của
một số bệnh (đặc biệt là bệnh tự miễn) Điều
này đã giúp các thầy thuốc lâm sàng trong
miễn dịch trị liệu nhằm khôi phục lại những
hoạt động bình thường của hệ thống miễn dịch
Tài liệu tham khảo
1 Vũ Triệu An, J.C.Homberg : Miễn dịch
học 1997, 105: 120-123
2 S.A.Miller, D.D.Dykes and H.F Polesky:
A simple salting out procedure for extracting
DNA from humain nucleated cells Nucleic acids research 1988, 16: 1215-1218
3 Wake CT, Long EO, Mach B: Allelic polymorphism and complexity of the genes for HLA-DR β chains – direct analysis by DNA- DNA hybridization Nature 1982, 300:
372-374
4 Bignon JD, Semana G, Tiercy M et al: DNA- RFLP analysis: HLA-DR β workshop report In : Dupon B, ed Immunology of HLA Newyork: Springer-Verlag 1989, 851-860
5 Williams F et al.: Development of PCR – SSOP for the identification of HLA-A* 02 subtypes and determination of HLA- A* 02 frequencies within different ethnic populations TISSUE Antigens 1997, 49: 129-133
6 Bodmer JG et al: Nomenclature for factors of the HLA system 1998 Tissue Antigens 1999, 53: 407- 446
Summary
Genotyping for HLA
The major histocompatibility complex in humans (MHC), located on the short arm of chromosome 6, spans a distance of approximately about 4 to 5 megabase (Mb) Historically, HLA antigens have been defined by serologic techniques, and cellular techniques, DNA analyses using restriction fragment length polymorphisme (RFLP) and now is oligonucleotid probe (used in conjunction with the polymerase chain reaction or another process that amplifies the relevant gene copy) HLA molecules contain multiple alloepitopes that are capable of inducing humoral and cellular responses during alloimmunization
This paper, we present the clinical HLA testing: HLA typing (PCR-SSP) to identify HLA specificities to determine compatibility between a specific donnor- recipient pair
